RNAi介導(dǎo)SMV-P3基因沉默增強(qiáng)大豆對(duì)花葉病毒病的抗性

楊向東 牛 陸 張 偉 楊 靜 杜 茜 邢國(guó)杰 郭東全李啟云 董英山

吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 / 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 吉林長(zhǎng)春130033

RNAi介導(dǎo)SMV-P3基因沉默增強(qiáng)大豆對(duì)花葉病毒病的抗性

楊向東 牛 陸 張 偉 楊 靜 杜 茜 邢國(guó)杰 郭東全李啟云 董英山*

吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 / 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 吉林長(zhǎng)春130033

大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus, SMV)病是我國(guó)各大豆主產(chǎn)區(qū)最重要的病害之一, 嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量和籽粒外觀品質(zhì)。培育抗病品種是防治該病害最經(jīng)濟(jì)有效的措施。本研究基于植物介導(dǎo) RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù), 將編碼參與SMV運(yùn)動(dòng)和影響宿主域范圍的P3蛋白基因RNAi片段導(dǎo)入栽培大豆品種, 研究RNAi介導(dǎo)SMV-P3基因沉默對(duì)大豆抗SMV的影響。Southern雜交檢測(cè)結(jié)果表明, 外源RNAi片段以低拷貝的形式(1~4個(gè))整合至大豆基因組中。對(duì)T1~T3代轉(zhuǎn)基因大豆噴施除草劑和PCR鑒定結(jié)果表明, 外源T-DNA插入片段在轉(zhuǎn)基因大豆不同代際間能夠穩(wěn)定遺傳。對(duì)T2和T3代轉(zhuǎn)基因大豆接種SMV鑒定結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)我國(guó)大豆產(chǎn)區(qū)主要流行SMV株系SC-3較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ帐荏w品種Williams 82和SN9的抗性水平顯著提高, 病情指數(shù)降低至4.37~18.51, 且抗性能夠穩(wěn)定遺傳。綜上所述, RNAi介導(dǎo)SM-P3基因沉默能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)SMV的抗性水平。

大豆; 大豆花葉病毒病; SMV-P3; RNAi介導(dǎo)基因沉默

大豆花葉病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是 由大豆花葉病毒引起的一類(lèi)世界性大豆病害, 也是我國(guó)各大豆主產(chǎn)區(qū)最重要的病害之一。SMV一般可造成大豆減產(chǎn)10%~30%, 嚴(yán)重年份和地區(qū)甚至造成大面積絕產(chǎn)[1-3]。SMV還常常造成籽粒斑駁, 嚴(yán)重影響大豆籽粒的外觀品質(zhì)和商品價(jià)值[4]。在分類(lèi)學(xué)上, SMV屬馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus), 主要通過(guò)受侵染的種子和蚜蟲(chóng)傳播。隨著全球范圍內(nèi)大豆種質(zhì)資源交流, 新型病毒株系的出現(xiàn)和致病力強(qiáng)弱的變化, 我國(guó)大豆抗SMV育種工作面臨的形勢(shì)也更為嚴(yán)重。Yang等[5]對(duì)我國(guó)境內(nèi)采集的206個(gè)病毒株和589個(gè)SMV樣本分析表明,新型重組花葉病毒(recombinant Soybean mosaic virus, SMV-R)出現(xiàn)頻率達(dá)到16.7%~60.0%, 且主要集中在我國(guó)中部和南部大豆種植區(qū)。由于化學(xué)防治困難且易造成環(huán)境安全等問(wèn)題, 生產(chǎn)上對(duì)大豆花葉病毒的防治主要依賴于抗SMV大豆品種的培育。由于SMV存在復(fù)雜的株系分化, 大豆對(duì) SMV的抗性又具有株系?；訹6], 因此, 寄主的抗性易隨著病毒株系的變異而喪失[7-9], 培育廣譜、抗性持久的抗病品種也成為防治大豆花葉病毒病的根本途徑。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是植物抵抗外來(lái)核酸(病毒、轉(zhuǎn)座子等)入侵以保持自身基因組完整性的一種防御機(jī)制[10-11]。病毒入侵寄主細(xì)胞后,其雙鏈 RNA (double-strand RNA, dsRNA)被植物DCL (Dicer-like)核酸酶加工為 vsiRNA (virus short interfering RNA), 隨后 vsiRNA與 AGO蛋白結(jié)合,降解與 vsiRNAs 互補(bǔ)配對(duì)的長(zhǎng)鏈病毒 RNA, 從而阻止病毒的進(jìn)一步侵染[12]。許多研究表明, 在植物中表達(dá)部分病毒基因組序列片段, 產(chǎn)生的dsRNA可以有效抑制病毒的侵染[13-15]。在大豆抗SMV研究方面, Wang等[16]將攜帶SMV 3′-UTR的外殼蛋白基因CP導(dǎo)入大豆, 其中2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)SMV抗性水平較受體品種顯著提高。Furutani等[17]將 SMV-CP基因?qū)氪蠖? 接種鑒定結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)SMV侵染具有較高的抗性。Zhang等[18]和Kim 等[19]分別將SMV-NIB和SMV-CP基因序列反向重復(fù)片段(inverted repeat, IR)導(dǎo)入大豆, 接種鑒定結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因大豆能夠有效抵御SMV的侵染, 其SMV抗性顯著高于受體品種。最近, Gao等[3]將轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)的負(fù)調(diào)控因子SMV HC-Pro基因IR片段導(dǎo)入大豆, 接種鑒定表明, 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)SMV抗性顯著提高?？梢?jiàn), 利用宿主介導(dǎo)SMV編碼基因RNAi沉默是提高大豆抗SMV的有效手段。更為重要的是, 利用RNAi干擾技術(shù)為同時(shí)抗多種病毒及病毒不同生理小種提供了一條更為有效的技術(shù)途徑[13,18,20]。但目前已有的研究主要是通過(guò) RNAi介導(dǎo) SMV-CP或 SMVHC-Pro基因沉默提高大豆抗 SMV水平, 而對(duì)其他參與SMV侵染、復(fù)制、運(yùn)動(dòng)等過(guò)程關(guān)鍵基因RNAi沉默介導(dǎo)的SMV抗性研究則尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。

與Potyvirus屬其他病毒成員類(lèi)似, SMV基因組為單鏈正義 RNA[21], 其基因組共編碼 11個(gè)不同功能的成熟蛋白[22]。P3蛋白是由SMV基因組編碼的一個(gè)關(guān)鍵蛋白。研究表明, P3蛋白不僅在病毒復(fù)制和運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用, 同時(shí)與感染寄主癥狀表型密切相關(guān), 并在一定程度上決定了病毒侵染的寄主范圍[23-24]。最近研究表明, P3蛋白是攜帶Rsv1抗性位點(diǎn)大豆基因型的無(wú)毒決定因子[25-26]。攜帶Rsv4抗性位點(diǎn)大豆基因型的無(wú)毒決定因子也位于P3蛋白序列內(nèi)部, 并在 SMV致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[27-29]。另外, 位于P3蛋白基因順?lè)醋觾?nèi)部編碼75個(gè)氨基酸的PIPO蛋白對(duì)病毒粒子在寄主體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[30]。本文利用 RNAi介導(dǎo)SMV-P3基因沉默研究對(duì)大豆抗SMV的影響,以期為進(jìn)一步拓寬大豆抗SMV遺傳資源基礎(chǔ), 培育廣譜、高抗SMV轉(zhuǎn)基因大豆新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆花葉病毒 SC-3株系和受體品種 Williams 82分別由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所和大豆研究所提供; 受體品種SN9由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)謝甫綈教授惠贈(zèng)。大腸桿菌DH5α購(gòu)自北京TIANGEN公司; 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA101由本實(shí)驗(yàn)室保存; 載體質(zhì)粒 pTF101-RBSC由東北師范大學(xué)劉寶教授惠贈(zèng)。TRIzol試劑和Prime-Scrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購(gòu)自美國(guó) Invitrogen和日本 TaKaRa公司; KOD FX高保真酶購(gòu)自日本TOYOBO公司; ExTaq MasterMix聚合酶購(gòu)自北京康為試劑公司; 限制性內(nèi)切酶Hind III、Sac I等購(gòu)自美國(guó)Thermo公司; 除草劑Basta購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司; 草銨膦(Glufosinate-ammonium, 貨號(hào) 45520-100MG)購(gòu)自Sigma公司; QuickStix PAT/bar 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙購(gòu)自美國(guó)EnviroLogix公司; 遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分、植物激素、抗生素等購(gòu)自美國(guó)Phyto Tech 和Sigma公司; 測(cè)序與引物合成委托北京華大基因公司完成。

1.2 SMV-P3反向重復(fù)片段設(shè)計(jì)及RNAi表達(dá)載體構(gòu)建

利用TRIzol試劑從感染SMV SC-3 病毒的大豆葉片(本實(shí)驗(yàn)室保存)中提取總 RNA, 并用 Prime-Scrip 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈, 保存于–20℃。根據(jù)GenBank中已登錄SMV株系P3基因保守序列(2529~2822 nt)設(shè)計(jì)引物, 正向引物為5′-GGTTGTTGGATGCTTTTCTTTC-3′, 反向引物為5′-TCTCTTGATGGGCTTGGTTTCACC-3′。以合成cDNA第一鏈為模板, 利用 KOD FX 高保真酶擴(kuò)增目的片段。以 pTF101-RBSC質(zhì)粒為載體骨架, 利用常規(guī)分子生物學(xué)操作技術(shù)將目的片段分別以正向和反向的方式構(gòu)建到載體中, 構(gòu)建植物RNAi表達(dá)載體 pTF101-RBSC-P3, 并送北京華大公司測(cè)序驗(yàn)證。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTF101-RBSC-P3中, SMV-P3 RNAi片段啟動(dòng)子為菜豆葉片特異啟動(dòng)子RBSC2 (GenBank登錄號(hào)為 AF028707.1), 內(nèi)含子序列來(lái)源于黃菊花屬Flaveria trinervia丙酮酸磷酸雙激酶pdk基因, 植物篩選標(biāo)記為草胺膦抗性基因bar (圖1)。采用凍融法將載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA101以備轉(zhuǎn)化。

圖1 RNAi表達(dá)載體pTF101-RBSC-P3 T-DNA區(qū)示意圖Fig.1 Schematic representation of the T-DNA region of the recombinant plasmid pTF101-RBSC-P3

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化[31], 轉(zhuǎn)化受體品種為Williams 82和SN9。將萌發(fā)培養(yǎng)基GM (B5鹽、B5維生素、30 g L–1蔗糖、3.9 g L–1MES、5 g L–1瓊脂粉, pH 5.8)上培養(yǎng)24 h后的大豆種子沿種臍部位剖開(kāi), 并在子葉節(jié)位置輕微劃傷, 然后于農(nóng)桿菌液中侵染30 min。將侵染后的外植體轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基CCM (B5鹽、B5維生素、30 g L–1蔗糖、3.9 g L–1MES、1.67 mg L–1BAP、0.25 mg L–1GA3、400 mg L–1半胱氨酸、154.2 mg L–1DTT、200 μmol L–1AS、5 g L–1瓊脂粉, pH 5.4)上, 于23℃條件下暗培養(yǎng)4 d。將外植體近軸面朝上轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基SIM (B5鹽、B5維生素、30 g L–1蔗糖、0.59 g L–1MES、1.67 mg L–1BAP、250 mg L–1頭孢霉素、100 mg L–1Timentin、6 mg L–1草丁膦、8 g L–1瓊脂粉, pH 5.7)上, 25℃, 16 h/8 h光暗條件下培養(yǎng)2周左右。然后將外植體取出, 切除多余的下胚軸部分, 并轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基 SIM 上繼續(xù)培養(yǎng)2~4周。將外植體上產(chǎn)生的叢生芽轉(zhuǎn)移至芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基SEM (MS鹽、MS維生素、30 g L–1蔗糖、0.59 g L–1MES、50 mg L–1天門(mén)冬氨酸、50 mg L–1L-谷氨酸、0.1 mg L–1IAA、0.5 mg L–1GA3、1.0 mg L–1玉米素核苷、250 mg L–1頭孢霉素、100 mg L–1Timentin、6 mg L–1草丁膦、8 g L–1瓊脂粉, pH 5.7)上培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為25℃, 16 h/8 h光暗周期。待抗性芽長(zhǎng)至3~5 cm時(shí),將其切下, 并用1 mg L–1IBA浸泡30 s, 然后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基RM (MS鹽、20 g L–1蔗糖、0.59 g L–1MES、 50 mg L–1天門(mén)冬氨酸、50 mg L–1L-谷氨酸、1.0 mg L–1IBA、3 g L–1植物凝膠, pH 5.6)上繼續(xù)培養(yǎng)。待抗性芽長(zhǎng)出健壯的根時(shí), 移栽至溫室中生長(zhǎng)結(jié)實(shí)。

1.4 PCR檢測(cè)和除草劑噴施鑒定

對(duì)移栽至溫室中的轉(zhuǎn)化再生植株進(jìn)行 PAT/bar試紙檢測(cè), 具體檢測(cè)方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。采用DNA 快速提取法提取轉(zhuǎn)化再生植株葉片 DNA[32],根據(jù)植物RNAi表達(dá)載體pTF101-RBSC-P3序列設(shè)計(jì) 2對(duì)特異性檢測(cè)引物(P3-F1/P3-R1和 Bar-F1/ Bar-R1)。引物P3-F1 (5′-ACCTCAACTCCACCAGC ATC-3′)位于SMV-P3 RNAi片段上游啟動(dòng)子RBSC2,引物 P3-R1 (5′-TACTCTCAACTTTTATCTTCTTCG TC-3′)位于內(nèi)含子pdk序列。引物對(duì)Bar-F1/Bar-R1 (F: 5′-GCACCATCGTCAACCACTACATCGAG-3′, R: 5′-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3′)位于bar基因讀碼框。預(yù)期PCR擴(kuò)增片段分別為727 bp和441 bp。內(nèi)標(biāo)基因Gmactin檢測(cè)引物為Act-F1/Act-R1 (F: 5′-TTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′, R: 5′-GAT CTTCATGCTGCTGGGTG-3′), 擴(kuò)增片段為403 bp。3對(duì)引物PCR擴(kuò)增條件均為95℃ 5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

對(duì)T1~T3代轉(zhuǎn)基因植株后代采用PCR檢測(cè)和田間噴施除草劑 Basta (主要成分為草銨膦)的方法鑒定。PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法同上。待大豆幼苗長(zhǎng)出第1組三出復(fù)葉時(shí), 噴施500 mg L–1Basta。7~14 d后調(diào)查除草劑抗性情況, 并拔除對(duì)除草劑 Basta敏感的植株。本研究中獲得的PCR陽(yáng)性和耐除草劑大豆用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 轉(zhuǎn)基因大豆Southern雜交檢測(cè)

選取T1代PCR陽(yáng)性大豆植株進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)。采用高鹽CTAB法提取轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)化植株葉片總DNA[33]。利用Hind III酶切總DNA (30~50 μg), 0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段。采用高鹽轉(zhuǎn)移法, 將酶切片段轉(zhuǎn)移至帶正電荷的Hybond-N+尼龍膜(Amersham, USA)上。根據(jù) RNAi載體 pTF101-RBSC-P3中的bar基因序列設(shè)計(jì)引物(引物序列同上),并擴(kuò)增探針模板。利用 DIG隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針。根據(jù) Roche公司的 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行探針制備及雜交。雜交溫度為42℃, 以2×SSC (含0.1% SDS), 37℃條件下洗膜 2次, 每次 5 min; 0.5×SSC (含0.1% SDS), 66℃條件下洗膜2次, 每次15 min。然后利用BCIP/NBT在膜上化學(xué)顯色。

1.6 SMV田間抗性鑒定

采用汁液摩擦接種法, 對(duì)T2和T3代轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行抗SMV鑒定。每個(gè)株系種植3壟, 每壟30株, 隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。待大豆植株第 1片三出復(fù)葉出現(xiàn)時(shí), 參照Gao等[3]的方法接種SMV SC-3病毒。參照Z(yǔ)hi等[34]提出的SMV病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn), 計(jì)算病情指數(shù)。高抗(IM),無(wú)可見(jiàn)系統(tǒng)癥狀, 病情指數(shù)為 0; 抗病(R), 病情指數(shù)在1~20之間; 中抗(MR), 病情指數(shù)在21~35之間; 中感(MS), 病情指數(shù)在36~50之間; 感病(S), 病情指數(shù)在51~70之間; 高感(HS), 病情指數(shù)大于70。對(duì)受體大豆和轉(zhuǎn)基因大豆的株系生育期(growing period duration, GPD)、葉形(leaf shape, LS)、花色(flower color, FC)、株高(plant height, PlH)、種皮色(seed coat color, SCC)、分枝數(shù)(branching number, BN)、節(jié)數(shù)(node number, NN)、結(jié)莢高度(podding height, PoH)、百粒重(100-seed weight, 100SW)、種臍色(hilum color, HC)等表型性狀進(jìn)行調(diào)查。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用 Microsoft Excel軟件, 采用 t-檢驗(yàn)分析轉(zhuǎn)基因大豆株系與對(duì)照受體品種對(duì) SMV抗性水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)SMV-P3 RNAi大豆植株的獲得及分子鑒定

根據(jù) GenBank中已登錄大豆花葉病毒株系 P3基因的保守序列, 選取302 bp片段(2529~2822 nt)作為靶序列, 構(gòu)建攜帶該靶序列反向重復(fù)片段的RNAi表達(dá)載體(圖1)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將SMV-P3 RNAi片段導(dǎo)入大豆栽培品種Williams 82和SN9。共轉(zhuǎn)化外植體2876個(gè), 經(jīng)過(guò)分化、篩選和再生, 獲得耐6 mg L–1草丁膦再生植株146株。PAT/bar試紙和PCR檢測(cè)結(jié)果表明, 其中83株能擴(kuò)增出目的條帶,擴(kuò)增條帶分別為727 bp和441 bp, 與預(yù)期大小一致,而對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株則沒(méi)有相應(yīng)的條帶(圖2和圖3), PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為 2.89%。轉(zhuǎn)基因植株移栽至溫室后能夠正常開(kāi)花結(jié)實(shí), 且在表型上與對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株無(wú)明顯差異。選取6個(gè)PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因大豆植株進(jìn)行 Southern雜交, 雜交探針為 bar基因序列。根據(jù)載體pTF101-RBSC-P3 T-DNA中Hind III酶切位點(diǎn)的位置, 預(yù)期雜交片段最小應(yīng)為1.5 kb。檢測(cè)結(jié)果表明, 6個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆植株均可以檢測(cè)到雜交信號(hào),而對(duì)照非轉(zhuǎn)基因大豆則沒(méi)有雜交條帶出現(xiàn)(圖4), 表明外源片段已整合到大豆基因組中。在檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植株中, 外源T-DNA插入拷貝數(shù)為1~4個(gè)。

2.2 轉(zhuǎn)基因大豆外源片段遺傳穩(wěn)定性分析

除草劑噴施結(jié)果表明, 在500 mg L–1Basta處理?xiàng)l件下, 非轉(zhuǎn)基因大豆很快(7 d左右)出現(xiàn)葉片黃化或枯死現(xiàn)象, 而轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)正常(圖5)。3個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆株系B013、B115和B127中, 除草劑抗性植株和敏感植株比例約為3∶1, 另外3個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆株系B128、B163和B166分離比例約為15∶1。連續(xù)3代PCR檢測(cè)結(jié)果表明, 外源SMV-P3 RNAi片段在轉(zhuǎn)基因大豆不同代際間能夠穩(wěn)定遺傳(圖6)。

圖2 PAT/bar試紙檢測(cè)Fig.2 Liberty link strips test

圖3 T0代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)Fig.3 PCR analysis of the T0transgenic plants

圖4 T1代轉(zhuǎn)基因大豆Southern雜交檢測(cè)Fig.4 Southern blot analysis of the T1transgenic plants

圖5 T3代轉(zhuǎn)基因大豆耐除草劑鑒定(500 mg L–1Basta)Fig.5 Herbicide tolerance with 500 mg L–1of Basta in T3transgenic lines

圖6 T1~T3代轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測(cè)Fig.6 PCR of the T1–T3transgenic lines

2.3 轉(zhuǎn)基因大豆抗SMV鑒定

接種SMV SC-3后, 對(duì)照非轉(zhuǎn)基因大豆出現(xiàn)葉片嚴(yán)重皺縮、花葉和植株矮化等 SMV感染典型癥狀。轉(zhuǎn)基因大豆植株則表現(xiàn)輕微或是無(wú)明顯癥狀(圖7和圖8), 表明RNAi介導(dǎo)SMV-P3基因沉默顯著降低了SMV的侵染及癥狀發(fā)展。也說(shuō)明SMV-P3基因與 SMV感染寄主癥狀表型密切相關(guān)[23-24]。連續(xù) 2代抗性鑒定結(jié)果表明, 在鑒定的 6個(gè)株系中, B127 和 B163對(duì) SMV抗性最強(qiáng), 病情指數(shù)降低至4.37~11.11, 另外4個(gè)株系對(duì)SMV也表現(xiàn)出較高的抗性水平(表1)。6個(gè)株系的病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照非轉(zhuǎn)基因大豆Williams 82 (病情指數(shù)36.81~45.24) 和SN9 (病情指數(shù)39.80~46.97), 說(shuō)明轉(zhuǎn)基因大豆顯著提高了SMV抗性水平, 且抗性性狀能夠穩(wěn)定遺傳(表1)。另外, 對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆田間表型性狀調(diào)查結(jié)果表明, 6個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆株系在葉形(圓形)、花色(白色)、種皮色(黃色)、種臍色(黑色)、株高、節(jié)數(shù)、結(jié)莢高度、生育期等方面與受體大豆品種沒(méi)有明顯差異(表2)。初步說(shuō)明, 外源片段的插入并沒(méi)有對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆的表型性狀造成影響。

3 討論

圖7 摩擦接種SMV SC-3后轉(zhuǎn)基因植株葉片癥狀表現(xiàn)Fig.7 Leaf symptom of the transgenic plants inoculated with SMV SC-3 by rub infection

圖8 接種SMV后整株癥狀表現(xiàn)Fig.8 Plants of the transgenic lines after inoculation with SMV SC-3

表1 T2和T3代轉(zhuǎn)基因大豆接種SMV SC-3抗性鑒定結(jié)果Table1 SMV resistance evaluation of the T2and T3transgenic lines

已有的研究表明, 通過(guò) RNAi干擾抑制或阻斷SMV關(guān)鍵基因的表達(dá)可以顯著增強(qiáng)大豆抗SMV能力[3,18-19,35]。在SMV基因組編碼的11個(gè)不同功能的成熟蛋白中, P3蛋白參與SMV復(fù)制和病毒粒子在宿主體內(nèi)的運(yùn)動(dòng), 并與感染寄主癥狀表型密切相關(guān)[23-24]。最近的研究結(jié)果表明, P3蛋白可能是攜帶 Rsv1和Rsv4抗性位點(diǎn)大豆基因型的無(wú)毒決定因子[25-29]。進(jìn)一步研究表明, Rsv1編碼蛋白可以識(shí)別P3蛋白, 并誘發(fā)大豆產(chǎn)生 Rsv1基因介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response, HR)[26]。盡管目前尚沒(méi)有直接證據(jù)表明P3蛋白與植物非宿主抗性機(jī)制有關(guān), 但也提示P3蛋白在決定大豆宿主范圍中發(fā)揮著重要的作用, 并與SMV致病性有關(guān)[29]。因此, 抑制SMV-P3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯可以干擾或影響SMV的致病性, 并在一定程度上影響SMV的宿主范圍?；谶@一思路, 本研究利用宿主RNAi介導(dǎo)SMV-P3基因沉默研究對(duì)大豆抗SMV的影響。研究結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)SMV-P3 RNAi片段大豆在接種SMV SC-3株系后, 其癥狀表現(xiàn)輕微或無(wú)明顯癥狀, 病情指數(shù)比受體對(duì)照品種顯著降低, 表明SMV-P3基因沉默顯著降低了SMV侵染或癥狀發(fā)展, 提高了轉(zhuǎn)基因大豆抗SMV的能力。本研究首次報(bào)道了RNAi介導(dǎo)SM-P3基因沉默可以顯著提高大豆抗SMV水平, 為培育廣譜、高抗SMV轉(zhuǎn)基因大豆新品種提供了一條新的路徑。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆株系農(nóng)藝性狀的大田表現(xiàn)Table2 Agronomic performance of the transgenic lines in field condition

值得注意的是, 盡管抑制 SMV-P3基因的表達(dá)顯著了提高大豆抗SMV能力, 但就本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果來(lái)看, 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)SMV抗性并沒(méi)有達(dá)到免疫水平。這一點(diǎn)與Zhang等[18]和Kim等[19]等研究結(jié)果不同。其原因可能與RNAi干擾本身抑制效率有關(guān), 即SMV-P3 RNAi并沒(méi)有100%抑制或降解P3基因的表達(dá); 也可能是抑制P3基因的表達(dá)僅對(duì)SMV在寄主體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)造成干擾, 限制了SMV癥狀的發(fā)展, 但在高水平接種量條件下并沒(méi)有完全抑制 SMV的侵染。不過(guò), 從育種和生產(chǎn)實(shí)際角度講, 低于免疫水平的抗性對(duì)于延緩SMV病毒生理小種進(jìn)化速度, 提高大豆品種持久抗性水平又具有積極的意義。已有的研究表明, 由于位置效應(yīng)、T-DNA插入拷貝數(shù)等因素的影響, 外源基因或片段在轉(zhuǎn)基因植株中易丟失或沉默, 從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因后代遺傳不穩(wěn)定[36]。本研究結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)SMV-P3 RNAi大豆抗性性狀在不同代際間能夠穩(wěn)定遺傳。這可能是轉(zhuǎn)基因大豆中外源T-DNA插入拷貝數(shù)較少(1~3個(gè))的緣故, 也可能與本研究選用的葉片特異性啟動(dòng)子RBSC2有關(guān)。

研究表明, SMV-P3基因在不同SMV株系中存在著較高水平的變異[23,37]。楊清華[37]對(duì)不同來(lái)源SMV生理小種P3基因序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明, 來(lái)源于中國(guó)和韓國(guó)的SMV株系P3基因序列同源性相對(duì)較高, 核苷酸序列同源性為 92.4%~ 98.9%, 氨基酸序列同源性為96%~100%。與來(lái)源于美國(guó)的SMV株系P3基因序列同源性相對(duì)較低, 核苷酸序列同源性為 88.50%~99.79%, 氨基酸序列同源性為91.40%~99.86%[37]。本研究根據(jù)GenBank中已登錄SMV株系 P3基因保守序列(2529~2822 nt)設(shè)計(jì)反向重復(fù)片段, 并研究了轉(zhuǎn)SMV-P3 RNAi大豆對(duì)SMV SC-3株系抗性的影響。由于P3蛋白在決定SMV宿主范圍中發(fā)揮著重要的作用[23-24], 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)其他SMV株系的抗性是否也能夠顯著提高, 需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步鑒定評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

將編碼參與SMV運(yùn)動(dòng)和影響宿主域范圍的P3蛋白基因 RNAi片段導(dǎo)入大豆基因組中, 轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)SMV SC-3抗性水平較受體品種Williams 82和SN9顯著提高, 病情指數(shù)降低至4.37~18.51, 且抗性能夠穩(wěn)定遺傳, 表明RNAi介導(dǎo)SM-P3基因沉默能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因大豆抗SMV水平。

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RNAi-mediated SMV-P3 Silencing Increases Soybean Resistance to Soybean Mosaic Virus

YANG Xiang-Dong, NIU Lu, ZHANG Wei, YANG Jing, DU Qian, XING Guo-Jie, GUO Dong-Quan, LI Qi-Yun, and DONG Ying-Shan*

Agricultural Biotechnology Institute, Jilin Academy of Agricultural Sciences / Jilin Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Changchun 130033, China

Soybean mosaic virus (SMV) is one of the most important diseases in major soybean production areas and has severe effects on soybean production and seed quality in China.Breeding disease-resistant varieties is the most economical and effective strategy to prevent and control SMV.In this study, RNAi fragments of the gene encoding P3 protein, which is involved in SMV mobility and affecting host range, were introduced into soybean by plant-mediated RNA interference (RNAi) techniques to explore the influence of RNAi-mediated SMV-P3 silencing on soybean SMV resistance.Southern blot analysis revealed that exogenous RNAi fragments were integrated into the soybean genome at low copy numbers (1–4).T1–T3generation transgenic soybeans were sprayed with herbicide and inserted fragments were examined using PCR.The results indicated that T-DNA insertion fragments could be stably inherited between generations of transgenic soybean.Inoculation of T2and T3generation transgenic soybeans with SMV suggested that transgenic soybeans exhibited significantly higher resistance to the prevailing SMV strain, SC-3, in major soybean production areas than the non-transgenic control varieties Williams 82 and SN9.The disease index was reduced by 4.37–18.51.Further, the resistance could be stably inherited.In conclusion, RNAi-mediated SMV-P3 silencing can significantly increase the SMV resistance of the transgenic soybean.

Soybean; Soybean mosaic virus; SMV-P3; RNAi-mediated gene silencing

10.3724/SP.J.1006.2016.01647

本研究由國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2016ZX08004-004)和吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150204011NY)資助。

This study was supported by the China National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08004-004) and the Science & Technology Development Project of Jilin Province (20150204011NY)。

*通訊作者(Corresponding author): 董英山, E-mail: ysdong@cjaas.com, Tel: +86-431-87063008

聯(lián)系方式: E-mail: xdyang020918@126.com, Tel: +86-431-87063044

稿日期): 2016-02-16; Accepted(接受日期): 2016-06-20; Published online(

日期): 2016-07-04.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160704.0826.002.html