粳稻品種吉粳809的稻瘟病抗性基因分析

朱亞軍孫 強(qiáng)王金明陳 凱馮 博方雅潔林秀云,*徐建龍,3,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 吉林公主嶺 136100;3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳生物育種創(chuàng)新研究院, 廣東深圳 518120

粳稻品種吉粳809的稻瘟病抗性基因分析

朱亞軍1,**孫 強(qiáng)2,**王金明2陳 凱1馮 博1方雅潔1林秀云2,*徐建龍1,3,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081;2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 吉林公主嶺 136100;3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳生物育種創(chuàng)新研究院, 廣東深圳 518120

稻瘟病是水稻生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害之一, 種植抗病品種是抵御稻瘟病危害的有效措施。本研究利用吉粳809的2個(gè)親本材料吉粳88與93072配制的回交分離群體進(jìn)行稻瘟病人工接種, 采用抗、感極端分池法定位雙親的稻瘟病抗性基因, 結(jié)合基因型分析, 推斷吉粳809的抗性基因組成。結(jié)果表明, 回交群體對(duì)強(qiáng)致病菌GD9-1表現(xiàn)為4個(gè)主效抗病基因Pi-2(t)、Pi-7-1(t)、Pi-7-2(t)和Pi-11(t)分離, 對(duì)弱致病菌GD19-1表現(xiàn)單個(gè)主效抗病基因Pi-2(t)分離, 其中Pi-2(t)基因同時(shí)抗2個(gè)菌株。除Pi-2(t)位點(diǎn)抗性等位基因來(lái)自吉粳88, 其余3個(gè)位點(diǎn)的抗性等位基因均來(lái)自93072。比較基因組研究表明, Pi-2(t)可能與Pi-b等位, Pi-11(t)可能與Pi-47(t)或Pik等位, 而Pi-7-1(t)和Pi-7-2(t) 是2個(gè)新的抗性位點(diǎn), 分別與RM21260和RM8037連鎖, 遺傳距離為0.11 cM和6.97 cM。利用與上述4個(gè)抗病位點(diǎn)緊密連鎖的SSR標(biāo)記和來(lái)自3000份水稻種質(zhì)資源重測(cè)序開發(fā)的56K芯片鑒定抗性位點(diǎn)吉粳809與雙親基因型的異同, 推斷吉粳809抗性基因組成, 發(fā)現(xiàn)吉粳809攜帶輪回親本吉粳88的Pi-2(t)和來(lái)自供體親本93072的Pi-11(t) 2個(gè)基因, 合理地解釋了吉粳809抗性明顯好于吉粳88的原因。對(duì)如何通過不同主效抗性基因聚合特別是充分利用原來(lái)抗病品種中“喪失”抗性殘效基因來(lái)改良品種的稻瘟病抗性進(jìn)行了討論。

水稻; 稻瘟病; 抗病基因; 極端分離群體分池法; 抗性基因聚合

由真菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病嚴(yán)重危害水稻的生產(chǎn), 每年造成全球水稻產(chǎn)量損失高達(dá)18%[1]。在我國(guó), 稻瘟病在南北稻區(qū)每年均受到不同程度的危害, 一般減產(chǎn) 10%~20%, 嚴(yán)重的達(dá)40%~50%, 局部田塊甚至顆粒無(wú)收[2], 且在過去20年有增長(zhǎng)的趨勢(shì)[3]。據(jù)全國(guó)農(nóng)作物重大病蟲害預(yù)警, 2012年稻瘟病在中國(guó)的發(fā)病面積約為 553萬(wàn)公頃, 較 2011年增加 20%[4]。稻瘟病不僅威脅世界糧食的安全, 同時(shí)還導(dǎo)致稻米品質(zhì)下降[5]。實(shí)踐證明,通過遺傳育種手段培育優(yōu)良抗病品種是防治稻瘟病和解決糧食安全的最有效途徑之一[6], 而抗病基因的發(fā)掘與利用是抗病育種的基礎(chǔ)和核心工作[7]。

基于快速發(fā)展的分子生物學(xué)和相應(yīng)的分子標(biāo)記技術(shù), 目前至少已報(bào)道了86個(gè)主效稻瘟病抗性基因, 350個(gè)微效QTL[8-9]。這些抗性位點(diǎn)分布于水稻的12條染色體上, 其中第7染色體上分布最少, 僅Pi17一個(gè), 第11染色體上最多, 達(dá)17個(gè)位點(diǎn), 24個(gè)基因[10]。遺傳分析揭示, 這些抗性位點(diǎn)中45%來(lái)自粳稻, 51%來(lái)自秈稻, 剩余4%來(lái)自野生稻, 絕大部分位點(diǎn)的抗性基因呈顯性遺傳[11-12]。迄今已有24個(gè)主效基因被成功克隆, 但尚沒有微效 QTL被克隆的報(bào)道[10]。

吉粳88是吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所采用地理遠(yuǎn)緣奧羽346為母本與長(zhǎng)白9號(hào)雜交選育成的首個(gè)粳稻超級(jí)稻品種, 表現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病, 2005年先后通過吉林省、遼寧省、國(guó)家品種審定, 在吉林省內(nèi)外累計(jì)種植面積達(dá)40萬(wàn)公頃以上[13]。該品種僅2006年在吉林省種植面積就達(dá)到30萬(wàn)公頃, 占水田面積的40%[13]。由于大面積集中種植單一品種,吉粳88的稻瘟病抗性近年來(lái)基本喪失, 在生產(chǎn)上成為感病品種。

吉粳809是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所合作以吉粳 88為母本、秈稻 93072為父本, 雜交并經(jīng)2次回交, 經(jīng)系譜法選育成的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗稻瘟病粳稻品種[14]。 2013年通過吉林省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定, 2014年通過國(guó)家農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。田間鑒定試驗(yàn)表明, 吉粳88感稻瘟病, 93072抗稻瘟病,吉粳809對(duì)苗瘟表現(xiàn)為抗病, 葉瘟和穗瘟均表現(xiàn)為中抗, 稻瘟病綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)為中抗以上, 抗性顯著好于吉粳88。為了揭示93072稻瘟病的抗性遺傳機(jī)制, 挖掘其潛在的抗性基因, 鑒定與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記, 本研究通過對(duì)吉粳88與93072配制的回交群體人工接種稻瘟病, 采用極端分離群體分池法分析抗性位點(diǎn), 定位 93072的抗性基因, 獲得與之緊密連鎖的SSR標(biāo)記, 并結(jié)合系譜分析, 推斷吉粳809的抗性基因, 為今后抗稻瘟病品種培育和抗病品種合理布局提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

吉粳 88為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的吉林省首個(gè)大面積推廣的國(guó)審超級(jí)稻品種[15], 近年來(lái)稻瘟病抗性減弱, 逐年喪失稻瘟病抗性, 成為感病品種; 93072為全球分子育種材料, 表現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、抗旱和抗稻瘟病。以吉粳 88為輪回親本與稻瘟病抗源品種93072雜交和回交, BC1F1代隨機(jī)選25個(gè)單株回交, 從BC2F2群體中逐株收獲少量種子形成混合分離的BC2F3群體, 用于抗性鑒定和篩選。吉粳 809是以吉粳88為母本與93072雜交后經(jīng)2次回交結(jié)合系譜法選育成的優(yōu)質(zhì)粳稻品種, 其稻瘟病綜合評(píng)價(jià)為中抗以上。

1.2 稻瘟病接種和鑒定

委托廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 參照楊健源等[16]描述的接種方法進(jìn)行苗期稻瘟病接種試驗(yàn)。水稻種子經(jīng)催芽后穴播于30 cm×20 cm×5 cm規(guī)格的搪瓷盆, 供試親本、抗病對(duì)照 Tetep和感病對(duì)照麗江新團(tuán)黑谷各播種1行, 每盆播品種材料24 個(gè), 每行播量為 8~10粒種子。將回交群體一分為二, 定名為A群體和B群體, 分別用于接種G1小種的強(qiáng)致病菌GD9-1和弱致病菌GD19-1。每群體各3500粒, 播2盆。采取旱育秧, 長(zhǎng)至一葉一心期施硫酸銨, 每盆施0.5 g, 接種前共施3次。待稻苗長(zhǎng)至 3.5~4.0葉齡, 用配制好的孢子液人工噴霧接種, 每盆接種菌液量為20 mL。接種后于遮光密閉的培養(yǎng)箱中25℃保濕24 h, 之后置溫室, 在25~28℃下保濕培植至稻苗發(fā)病, 接種7 d后進(jìn)行調(diào)查。

由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所和吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供的16個(gè)秈型小種和14個(gè)粳型小種的品種抗譜測(cè)定菌株, 分別來(lái)自廣東省和吉林省各地區(qū), 包括14個(gè)B群小種、2個(gè)C群小種、1個(gè)E群小種、5個(gè)F群小種和8個(gè)G群小種(表1)。品種抗譜測(cè)定設(shè)2個(gè)重復(fù), 按國(guó)際水稻研究所稻瘟病圃苗瘟分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查病級(jí), 0~3級(jí)為抗病、4~9級(jí)為感病[17]。

1.3 DNA提取和BSA抗感池構(gòu)建

采用CTAB法提取單株的基因組DNA[18]。基于回交群體接種后的抗性評(píng)價(jià)選株構(gòu)建抗感池。從群體A中選擇17個(gè)抗病單株(0級(jí))和17個(gè)極端感病單株(9級(jí))提取DNA構(gòu)建群體A的抗、感池, 分別記作A-R和A-S; 從群體B中選15個(gè)抗病單株(0級(jí))和15個(gè)極端感病單株(9級(jí))提取DNA構(gòu)建群體B的抗、感池, 即B-R和B-S。用于抗病池構(gòu)建的抗病株是從被四周感病植株包圍的抗病株中選擇, 以排除由于接種因素而導(dǎo)致的不發(fā)病造成的抗病假象。

1.4 分子標(biāo)記多態(tài)性篩選和基因型鑒定

首先利用常用的535對(duì)均勻分布于水稻12條染色體上的SSR引物對(duì)雙親進(jìn)行多態(tài)性篩選, 進(jìn)一步利用雙親間多態(tài)標(biāo)記對(duì) A和B群體的抗感池進(jìn)行基因型鑒定, 初步確定與抗性基因連鎖的標(biāo)記位點(diǎn)。依據(jù)初步定位獲得的與抗性基因連鎖的位點(diǎn), 從 SSR引物數(shù)據(jù)庫(kù)中有針對(duì)性地從該連鎖位點(diǎn)兩側(cè)選更多的引物, 逐一鑒定抗感池和雙親的多態(tài)性,從而在每個(gè)抗性位點(diǎn)附近獲得一組多態(tài)標(biāo)記。篩選的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)A和 B群體中鑒定出來(lái)的更多感病株進(jìn)行基因型鑒定, 通過以下公式估算各標(biāo)記位點(diǎn)與抗性基因位點(diǎn)的重組值, 實(shí)現(xiàn)對(duì)抗性基因的進(jìn)一步精細(xì)定位。

重組率= (N1+N2/2)/N, 其中 N1為各標(biāo)記帶有抗病親本純合基因型的個(gè)體數(shù), N2為帶有雙親雜合基因型的個(gè)體數(shù), N為感病群體的總株數(shù)。

試驗(yàn)過程中PCR反應(yīng)采用20 μL總體積的常規(guī)反應(yīng)體系, 以 8%的聚丙烯酰氨凝膠電泳對(duì)每個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因型分型。

1.5 吉粳809抗性基因分析

首先以與抗性基因緊密連鎖的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)93072、吉粳88和吉粳809分型, 分析吉粳809抗性基因的遺傳組成。進(jìn)一步利用56K高通量基因芯片對(duì)吉粳88、93072和吉粳809進(jìn)行全基因組基因型掃描, 分析吉粳809與雙親的多態(tài)性尤其是抗性位點(diǎn)附近的多態(tài)性。比較SNP基因型揭示的差異區(qū)段與抗性基因SSR標(biāo)記定位結(jié)果, 驗(yàn)證抗性位點(diǎn)的可靠性, 并推斷吉粳809帶有的抗性基因。56K SNP芯片是基于 3000份全球水稻核心種質(zhì)重測(cè)序數(shù)據(jù)開發(fā)的[19], 包括55 312個(gè)SNP位點(diǎn), 這些位點(diǎn)均勻分布于水稻12條染色體, 平均間距為6.84 kb。委托北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司完成3個(gè)樣本的SNP芯片基因型分型。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel整理數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析和計(jì)算遺傳重組率。

2 結(jié)果與分析

2.1 吉粳88、93072和吉粳809抗性評(píng)價(jià)

采用從我國(guó)廣東省和吉林省分別收集的 15個(gè)秈型和粳型優(yōu)勢(shì)致病菌株, 接種吉粳809和其雙親吉粳88和93072, 輪回親本吉粳88對(duì)稻瘟病的抗性頻率僅為46.7%, 屬于感病品種, 93072抗性頻率為 73.3%, 屬中抗品種(表1)。由吉粳 88和 93072雜交衍生出來(lái)的吉粳809的抗性頻率介于雙親之間, 為 66.7%, 屬中抗類型, 表明吉粳 809的抗性來(lái)自93072的抗性基因。分析3個(gè)品種對(duì)30個(gè)秈、粳菌株的抗性表明, 雙親對(duì)57-2、13-284和2013-1-1均表現(xiàn)抗病, 但吉粳 809對(duì)這些菌株則表現(xiàn)感病; 相反, 雙親對(duì)13-466均表現(xiàn)感病, 而吉粳809則表現(xiàn)抗病。表明秈、粳雜交后代分離群體發(fā)生基因重組時(shí)可能產(chǎn)生新的等位基因, 這些等位基因的抗性反應(yīng)完全不同于雙親。

2.2 93072的抗性基因定位

利用均勻分布于水稻12條染色體上的553對(duì)SSR引物對(duì)抗、感親本進(jìn)行多態(tài)性分析, 獲得 13對(duì)多態(tài)性標(biāo)記。進(jìn)一步利用篩選到的多態(tài)性標(biāo)記,分別對(duì)接種強(qiáng)致病菌GD9-1的A群體和接種弱致病菌GD19-1的B群體建立的抗、感池分析, 從A群體的抗、感池獲得 7對(duì)多態(tài)性標(biāo)記, 分別是第 2染色體的RM208、RM406、RM266, 第7染色體的RM427、RM214、RM542和第11染色體的RM254; 從B群體的抗、感池獲得3對(duì)多態(tài)性標(biāo)記, 分別是第2染色體的RM208、RM406和RM266, 其中第2染色體的 3個(gè)引物(RM208、RM406和 RM266) 在2個(gè)群體的抗、感池中都表現(xiàn)出多態(tài)性(表2)。

利用隱性集團(tuán)分析法估算各多態(tài)標(biāo)記位點(diǎn)與抗性基因位點(diǎn)之間的重組率。A、B群體各接種3500株苗, 分別分離出感病單株882和922株。結(jié)果在A群體定位到4個(gè)抗性基因, 其中Pi-2(t)被定位到第2染色體長(zhǎng)臂末端, 與RM208緊密連鎖, 遺傳距離為3.75 cM; Pi-7-1(t)和Pi-7-2(t)都被定位到第7染色體上, 分別與RM427和RM214連鎖, 遺傳距離分別是12.24 cM和9.69 cM; Pi-11(t)被定位在第11染色體長(zhǎng)臂末端, 與 RM254緊密連鎖, 遺傳距離為2.15 cM (表2)。在B群體定位到1個(gè)抗性基因, 與第2染色體上的RM208緊密連鎖, 遺傳距離為3.15 cM (表2)。除Pi-2(t)位點(diǎn)的抗性基因來(lái)自吉粳88外, 其余3個(gè)抗性位點(diǎn)的有利等位基因均來(lái)自供體親本93072。

表1 吉粳809及其雙親對(duì)30個(gè)稻瘟病菌株的抗性反應(yīng)Table1 Reaction of resistance to 30 Magnaporthe oryzae strains for Jijing 809 and its parent

表2 抗性基因的初步定位Table2 Preliminary mapping for resistance genes

在初步定位結(jié)果的基礎(chǔ)上, 在上述3條染色體上鑒定到與抗性基因連鎖的位點(diǎn)兩側(cè), 選擇更多的SSR標(biāo)記鑒定雙親和抗、感兩池的多態(tài)性, 又鑒定出10個(gè)新的SSR多態(tài)性標(biāo)記, 包括第2染色體上的1個(gè)(RM14175), 第7染色體上的9個(gè)(RM6697、RM3484、RM21260、RM21264、RM5499、RM8021、RM8037、RM7184和RM6449), 而第11染色體上RM254位點(diǎn)附近沒有篩選到新的多態(tài)性標(biāo)記。利用位于RM208上游約55 kb的多態(tài)性標(biāo)記RM14175 對(duì)B群體的感病單株進(jìn)行PCR檢測(cè)表明, Pi-2(t)與RM14175緊密連鎖, 遺傳距離為3.27 cM。綜合上述定位結(jié)果, Pi-2(t)最終被定位到分子標(biāo)記RM14175與 RM208之間(圖1)。由于 Pi-7-1(t)和Pi-7-2(t)僅在 A群體中定位到, 因此利用9對(duì)新篩選的位于第7染色體上的多態(tài)性標(biāo)記對(duì)A群體的感病單株進(jìn)行基因型鑒定, Pi-7-1(t)與RM21260緊密連鎖, 922個(gè)單株中僅出現(xiàn)1個(gè)交換單株, 遺傳距離約為 0.11 cM; Pi-7-2(t)位于分子標(biāo)記 RM8021與RM8037之間, 與后者遺傳距離較小, 約 6.97 cM(圖1)。

2.3 吉粳809抗性基因分析

抗性基因定位結(jié)果證實(shí), RM208、RM21260、RM8037和RM254分別與4個(gè)定位到的抗性基因緊密連鎖, 因此利用這 4個(gè)分子標(biāo)記對(duì) 93072、吉粳88和吉粳809進(jìn)行基因型分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉粳809 在RM254位點(diǎn)上擴(kuò)增出與供體親本93072相同大小的片段(表3), 在其余 3個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出與吉粳88大小相同的片段, 表明吉粳809攜帶了第2染色體上的Pi-2(t)基因和第11染色體上的Pi-11(t) 2個(gè)抗基因, 其中前者有利等位基因來(lái)自親本吉粳 88,后者的有利等位基因來(lái)自93072。

圖1 連鎖圖譜和抗性基因在染色體上的分布Fig.1 Genetic linkage map and distribution of four resistance genes on chromosomes

進(jìn)一步利用56K基因芯片來(lái)驗(yàn)證SSR分析結(jié)果。56K基因芯片總計(jì)包括55 312個(gè)SNP位點(diǎn), 刪去雙親和吉粳 809中雜合和缺失的位點(diǎn), 剩余52 921個(gè)SNP, 其中親本間沒有多態(tài)的位點(diǎn)43 808 個(gè), 有多態(tài)的位點(diǎn) 9113個(gè)。對(duì)于 3個(gè)抗性基因Pi-2(t)、Pi-7-1(t)和 Pi-7-2(t), 以與抗性基因緊密連鎖的左右兩側(cè)標(biāo)記為界, 分析兩側(cè)標(biāo)記內(nèi)吉粳809與雙親的基因型, 結(jié)果表明, Pi-2(t)定位區(qū)間內(nèi)有10個(gè)SNP在雙親間有多態(tài)性, 且吉粳809在這 10個(gè)多態(tài)性 SNP位點(diǎn)上的基因型和母本吉粳88一致(表4); Pi-7-1(t)和Pi-7-2(t)定位區(qū)間內(nèi)分別有13和33個(gè)多態(tài)性SNP, 吉粳809在這些多態(tài)性SNP位點(diǎn)的基因型和母本吉粳88一致; 對(duì)于Pi-11(t), 僅檢測(cè)到 RM254與其緊密連鎖, 因此以包括 RM254 (24 230 491 bp)在內(nèi)上下游各 10 kb的范圍對(duì)吉粳 809與父母本基因型一致性進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)55K芯片在該區(qū)間共有5個(gè)SNP位點(diǎn), 其中4個(gè)在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性, 吉粳809在這些多態(tài)性SNP位點(diǎn)的基因型與父本93072基因型一致(表4)。表明 SNP基因型分析結(jié)果與 SSR完全一致, 證實(shí)吉粳809確實(shí)攜帶了2個(gè)抗性基因, 即保留自輪回親本吉粳 88的 Pi-2(t)和來(lái)自供體親本93072的 Pi-11(t), 該結(jié)果合理地解釋了吉粳 809抗性好于吉粳88的原因。

表3 吉粳809在與4個(gè)抗性基因緊密連鎖的位點(diǎn)上的基因型Table3 Genotyping for Jijing 809 using seven linkage markers of four resistance genes

表4 利用56K芯片驗(yàn)證吉粳809所攜帶的抗性基因Table4 Verification of blast resistance genes carried by Jijing 809 using 56K chip

3 討論

3.1 定位基因與已知抗性基因的比較

迄今, 已報(bào)道了 86個(gè)主效稻瘟病抗性基因和350個(gè)微效QTL[8-9]。在本研究中, 鑒定到Pi-2(t)、Pi-7-1(t)、Pi-7-2(t)和Pi-11(t) 4個(gè)抗性基因。Pi-2(t)位于第2染色體長(zhǎng)臂, 與SSR標(biāo)記RM208緊密連鎖, Pi-7-1(t)和 Pi-7-2(t)位于第 7染色體, 分別與RM21260和RM8037連鎖; Pi-11(t)位于第11染色體長(zhǎng)臂末端, 與RM254緊密連鎖。將與4個(gè)抗性基因緊密連鎖的4個(gè)標(biāo)記錨定到日本晴參考基因組上,與已經(jīng)定位和克隆的主效抗性基因比較發(fā)現(xiàn), RM208位于已克隆主效抗性基因 Pib上游約 29.9 kb處。多個(gè)文獻(xiàn)也指出 RM208與Pib共分離, 可用于稻瘟病分子輔助改良研究[20-23], 這表明Pi-2(t)很可能是Pib或其等位基因。Pi17是迄今第7染色體上唯一被定位到的主效抗性位點(diǎn), 與同工酶基因Est9連鎖, 位于染色體長(zhǎng)臂73.3 cM處[24]。與Pi-2(t)不同, Pi-7-1(t)和Pi-7-2(t)是2個(gè)新的抗性位點(diǎn), 抗性等位基因均來(lái)自供體親本 93072, 前者位于染色體短臂, 后者位于著絲粒區(qū)附近, 均位于Pi17上游且距離較遠(yuǎn)。分析表明, Pi-11(t)位于第11染色體末端的抗性基因富集區(qū)域, 且有2個(gè)抗性位點(diǎn)與其鄰近或可能存在關(guān)聯(lián), 如 Pik位于 Pi-11(t)下游約 1 Mb處, Pik的復(fù)等位基因Pik-m與RM254緊密連鎖,遺傳距離為13.4 cM[25]; Pi-47(t)被定位于分子標(biāo)記RM206 和 RM224 之間(22 480 961~27 673 251 bp)[26], 該區(qū)間覆蓋Pi-11(t)和Pik。56K芯片數(shù)據(jù)表明, 在第 11染色體上, 吉粳 809在染色體末端24~26 Mb范圍內(nèi)僅滲入了93072的2個(gè)小片段, 其中1個(gè)小片段恰好覆蓋Pik (未給出詳細(xì)數(shù)據(jù))。因此, 我們推斷 Pi-11(t)可能是 Pi-47(t)或 Pik的等位基因。鑒于Pik-m和Pi-47(t)是2個(gè)重要的廣譜抗病基因[2], 攜帶3個(gè)抗性基因的93072 [Pi-7-1(t)、Pi-7-2(t)和Pi-11(t)]比攜帶2個(gè)抗性基因的吉粳809 [Pi-2(t)和 Pi-11(t)]具有更強(qiáng)的抗性, 因此后續(xù)我們將對(duì)Pi-7-1(t)、Pi-7-2(t)和Pi-11(t)進(jìn)行進(jìn)一步的定位和克隆, 闡明其抗性特征, 明確 Pi-11(t)與Pi-47(t)和Pi-km的確切關(guān)系, 加快其在稻瘟病抗性改良中的應(yīng)用。

3.2 秈粳交后代基因重組產(chǎn)生新的等位變異

秈粳亞種間存在隱秘的染色體結(jié)構(gòu)差異, 由于染色體重排和基因重組, 秈粳交后代將產(chǎn)生豐富的遺傳變異[27], 這一現(xiàn)象在水稻全球分子育種計(jì)劃的回交育種實(shí)踐中得到證實(shí)。Zhang等[28]從黃華占與國(guó)際水稻研究所品種PSBRC66和PSBRC28的雜交和回交的后代, 從雙親感病的回交后代篩選到一批對(duì)白葉枯病廣譜抗病的株系, 遺傳分析證實(shí)其攜帶一個(gè)新的白葉枯病抗性基因 Xa39, 揭示了秈秈交后代染色體重組也會(huì)產(chǎn)生新的有利變異。本研究中, 利用15個(gè)秈型和15個(gè)粳型優(yōu)勢(shì)致病菌株, 對(duì)吉粳88、93072和吉粳809進(jìn)行抗性評(píng)價(jià), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種多數(shù)致病小種后, 吉粳809與2個(gè)親本的抗感反應(yīng)一致, 但有少數(shù)菌株接種后, 吉粳 809與 2個(gè)親本的抗感反應(yīng)不一致, 抗感完全相反, 如接種57-2、13-284和2013-1-1后, 雙親均表現(xiàn)抗病, 但吉粳809表現(xiàn)出感病; 相反, 接種13-466后雙親均表現(xiàn)感病, 但吉粳809卻表現(xiàn)出抗病特征(表1)。因此, 我們推測(cè)吉粳 809在培育過程中, 秈粳染色體發(fā)生重組而產(chǎn)生了新的有利變異, 而且這些等位基因的效應(yīng)可能完全不同于雙親。這一現(xiàn)象啟示我們,在秈粳交或遺傳距離較遠(yuǎn)的秈秈交甚至粳粳交后代, 加強(qiáng)選擇有可能篩選出雙親不具備的有利性狀。

3.3 推廣品種的稻瘟病抗性改良策略

大多抗病品種在生產(chǎn)上推廣數(shù)年后, 由于抗病基因相對(duì)單一, 稻瘟病菌群體中的毒性小種逐漸成為優(yōu)勢(shì)小種, 最終導(dǎo)致抗病品種的抗性喪失, 造成病害流行。這迫使育種家通過聚合多個(gè)抗性基因來(lái)延長(zhǎng)品種的抗性壽命[29]。研究表明, 持久抗性與多個(gè)抗病, 基因的協(xié)同作用密切相關(guān)。一些優(yōu)異的稻瘟病抗源, 如Moroberekan、Tetep、三黃占等, 都具有多個(gè)抗病基因[30]。近年來(lái), 采用定向回交育種和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)相結(jié)合策略, 選育出一批優(yōu)異的水稻抗病改良株系, 如Hittalmani等[31]將Pi1、Piz5和Pita聚合到水稻品系BL125中, 顯著提升了BL125的抗性水平和抗譜; 柳武革等[32]聚合Pi1和 Pi2基因育成廣譜抗稻瘟病兩系不育系GD-7S; 李洪亮等[33]把Pi1和Pi2基因聚合到水稻品種空育131 中, 培育出了廣譜、 持久抗稻瘟病的寒地優(yōu)質(zhì)水稻品種; 王軍等[34]將稻瘟病抗病基因Pi-ta和Pi-b和條紋葉枯病抗病基因Stv-bi聚合, 選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗水稻新品系74121; 向小嬌等[35]將稻瘟病抗性基因Pi9、Pigm和pi21導(dǎo)入感稻瘟病的京作1號(hào)背景, 培育出不同單基因和多基因聚合的抗病新品系。

本研究表明, 吉粳88帶有Pi-2(t)基因, 該基因與Pi-b可能等位, 在品種育成之初具有較好的稻瘟病抗性。由于該品種在吉林省大面積集中種植, 其攜有的Pi-2(t)基因在推廣數(shù)年后喪失抗性。程芳艷等[36]也證明了 Pi-b基因在黑龍江省無(wú)效, 建議在北方粳稻育種中不宜單獨(dú)利用?？乖垂w 93072對(duì)強(qiáng)致病菌株GD9-1帶有 3個(gè)抗性基因, 即 Pi-7-1(t)、Pi-7-2(t)和Pi-11(t), 前2個(gè)是本研究發(fā)現(xiàn)的新基因, Pi-11(t)可能與 Pi-47(t)或 Pik等位, 具有較廣的抗譜。因此, 將93072的Pi-11(t)導(dǎo)入吉粳88, 與原有的Pi-2(t)聚合,增強(qiáng)了育成品種吉粳 809的抗性水平。Li等[37]發(fā)現(xiàn)來(lái)自特青的抗白葉枯病 Xa-4位點(diǎn)的等位基因 Xa-4T對(duì)白葉枯病菌CR4和CXO8表現(xiàn)為1對(duì)顯性主基因抗性, 但其抗性被CR6小種克服, 表現(xiàn)為1個(gè)具顯著殘余效應(yīng)的隱性 QTL, 認(rèn)為白葉枯病持久抗病品種可以通過聚合多個(gè)基因或 QTL, 包括表現(xiàn)殘余效應(yīng)的QTL來(lái)實(shí)現(xiàn)抗性累加。吉粳809中來(lái)源于吉粳88的抗性“喪失”的 Pi-2(t)基因與來(lái)自 93072的 Pi-11(t)抗性基因之間是否存在抗性協(xié)同作用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。稻瘟病持久抗性品種的培育, 除聚合不同的主效抗性基因外, 是否可以通過聚合感病品種中已有抗性“喪失”的殘余效應(yīng)基因與外來(lái)導(dǎo)入的抗性基因來(lái)提高抗性水平, 值得進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

定位到4個(gè)主效抗病基因, 其中 Pi-2(t)同時(shí)抗2個(gè)菌株。Pi-2(t)可能與 Pi-b等位, Pi-11(t)可能與Pi-47(t)或Pik等位, Pi-7-1(t) 和Pi-7-2(t)是2個(gè)新的抗性位點(diǎn), 除Pi-2(t)位點(diǎn)的抗性等位基因來(lái)自吉粳88外, 其余3個(gè)位點(diǎn)的抗病等位基因均來(lái)自93072。吉粳809攜帶來(lái)自受體親本吉粳88的Pi-2(t)和來(lái)自供體親本93072的 Pi-11(t) 2個(gè)抗性基因, 合理地解釋了吉粳809抗性明顯好于吉粳88的原因。

致謝: 感謝廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所朱小源研究員提供苗期稻瘟病接種幫助。

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Analysis of Blast Resistance Genes in Japonica Variety Jijing 809

ZHU Ya-Jun1,**, SUN Qiang2,**, WANG Jin-Ming2, CHEN Kai1, FENG Bo1, FANG Ya-Jie1, LIN Xiu-Yun2,*, and XU Jian-Long1,3,*

1National Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2Rice Research Institute, Jilin Academy of agricultural Sciences, Gongzhuling 130000, China;3Shenzhen Institute of Breeding and Innovation, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, China

Blast is one of the most hazardous diseases in rice production.Planting resistance variety is an effective solution to control the disease.In this study, a backcross population derived from two parents, Jijing 88 and 93072, was selected to identify blast resistance genes using bulked extremes and recessive class under artificial inoculation and further to deduce the composition of resistance genes in Jijing 809 developed from Jijing 88 and 93072.Four major resistance genes, i.e., Pi-2(t), Pi-7-1(t), Pi-7-2(t), and Pi-11(t), were responsible for segregation of resistance to the strong virulent strain GD9-1, and only one resistance gene Pi-2(t) for segregation of resistance to the weak virulent strain GD19-1.Among them, Pi-2(t) was effective to both strains.The favorable alleles at all loci were from 93072 except for the allele at Pi-2(t) from Jijing 88.According to genomic comparison, Pi-2(t) wasdeduced to be allelic to Pi-b, and Pi-11(t) to Pi-47(t) or Pik; whereas Pi-7-1(t) and Pi-7-2(t) were two novel resistance genes, which were linkages to SSR markers with RM21260 (0.11 cM) and RM8037 (6.97 cM).Genotypes on the four above-referenced loci were compared between Jijing 809 and its parents by using closely linked SSR markers and a set of 56k gene chip developed from re-sequenced data of 3000 accessions of rice germplasm.The results indicated that the resistance genes in Jijing 809, Pi-2(t) and Pi-11(t), were inherited from the recurrent parent Jijing 88 and the donor parent 93072, respectively, which reasonably explained the higher blast resistance in Jijing 809 than in Jijing 88.Finally, we discussed how to pyramid different known major resistant genes, especially to make full use of the ‘defeated’ resistance gene in the original resistant variety to improve blast resistance in rice.

Rice; Blast; Resistance gene; Bulked extremes and recessive class; Pyramiding of resistance gene

10.3724/SP.J.1006.2016.01638

本研究由引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計(jì)劃(948計(jì)劃)項(xiàng)目(2010-G2B-2), 吉林省科技成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目(20130305038NY), 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2014AA10A601)和吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20140101014JC)資助。

This study was supported by the Program of Introducing International Super Agricultural Science and Technology (2010-G2B-2), Project of transformation of scientific and technological achievements in Jilin Province (20130305038NY), the National High Technology Research and Development Program of China (2014AA10A601), and the Natural Science Foundation of Jilin Province (20140101014JC).

*通訊作者(Corresponding authors): 徐建龍, E-mail: xujlcaas@126.com, Tel: 010-82105854; 林秀云, E-mail: linxiuyun1965@163.com, Tel: 13504462960

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

聯(lián)系方式: 朱亞軍, E-mail: zhuyajunstar@163.com; 孫強(qiáng), E-mail: jlsunqiang@126.com

稿日期): 2016-08-01; Accepted(接受日期): 2016-09-18; Published online(

日期): 2016-09-18.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160918.1608.004.html