棉花?；o酶A結合蛋白(ACBP)家族基因的發(fā)掘及在非生物脅迫抗性中的功能鑒定

秦朋飛 尚小光 宋 健 郭旺珍

南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室, 江蘇南京 210095

棉花?；o酶A結合蛋白(ACBP)家族基因的發(fā)掘及在非生物脅迫抗性中的功能鑒定

秦朋飛 尚小光 宋 健 郭旺珍*

南京農(nóng)業(yè)大學作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室, 江蘇南京 210095

酰基輔酶A結合蛋白(ACBP)家族基因在植物正常生長發(fā)育、響應逆境脅迫及生物膜修復等方面具有重要作用。本研究基于陸地棉(Gossypium hirsutum)遺傳標準系TM-1基因組序列信息, 鑒定并獲得21個棉花ACBP家族基因成員的全序列和染色體定位等信息。聚類分析表明這 21個基因分屬于I~IV類。依據(jù)與擬南芥的同源性, 將棉花ACBP家族基因命名為GhACBP1~GhACBP6六大亞類。轉(zhuǎn)錄組分析表明, 該家族基因在不同組織、不同發(fā)育時期表達差異較大。不同逆境誘導分析表明, GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6顯著受鹽、旱、低溫、高溫逆境脅迫誘導, 而GhACBP4和GhACBP5對逆境脅迫響應不強烈。進一步分析表明, GhACBP3和GhACBP6的表達受過氧化氫(H2O2)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)和乙烯(ET)的誘導。病毒誘導的基因沉默(VIGS)試驗表明, 沉默 GhACBP3 和GhACBP6亞類基因會降低棉花植株對干旱和鹽的耐性。目標基因沉默后, 植株干物質(zhì)積累下降, 株高變矮, 超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性降低, 丙二醛(MDA)含量升高, 表明GhACBP3和GhACBP6在棉花抗旱、耐鹽中發(fā)揮作用。研究為利用ACBP家族基因進行棉花抗逆性研究及應用提供參考。

棉花; ACBP基因家族; 結構; 表達; 干旱脅迫; 鹽脅迫

植物在生長發(fā)育過程中需要穩(wěn)定的能量供應與合適的生長環(huán)境, 脂類物質(zhì)在該過程中發(fā)揮重要作用。脂類物質(zhì)不僅為植物生長提供能量, 同時也是植物體內(nèi)生理和病理反應的重要參與者, 尤其在穩(wěn)定細胞膜、識別并響應生物非生物脅迫方面具有重要作用[1]。ACBP家族蛋白是一類?；d體蛋白, 在脂類合成和轉(zhuǎn)運過程中具有重要功能。在原核和真核生物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn) ACBP基因家族, 并在哺乳動物體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)該蛋白[2-3]。目前已在擬南芥、蓖麻、地黃、龍舌蘭、陸地棉、水稻等植物中系統(tǒng)鑒定該家族基因[4-10]。ACBP家族主要具有一個高度保守的ACBP結構域[11-12], 部分成員還具有錨蛋白重復序列(ankyrin repeats)、kelch motif、coiled-coil、信號肽、跨膜域等結構域[13], 根據(jù)以上結構域的有無將所有成員分為4類(I~IV)[14]。

ACBP蛋白通過調(diào)節(jié)飽和脂肪酸代謝[15]、?；o酶A庫[16]、脂肪酸β氧化、囊泡運輸[17]等多種細胞內(nèi)復雜的生理過程[11,18]參與植物生長發(fā)育、生物非生物脅迫響應、膜修復等生理過程[13-14,19]。研究表明, 擬南芥中AtACBP1和AtACBP2能夠結合卵磷脂和酰基輔酶酯類[20], 同時參與長鏈飽和脂肪酸的合成。AtACBP1和AtACBP2基因的雙突變會導致擬南芥種子胚胎發(fā)育前期所需的長鏈脂肪酸不足, 進而引起擬南芥種子胚胎發(fā)育異常甚至死亡[21-22]。其他ACBP蛋白也會參與種毛和成熟葉片表皮毛發(fā)育過程[9]。大量研究表明, ACBP家族蛋白影響植物對重金屬氧化、干旱、低溫和病菌侵染等生物、非生物脅迫的響應[12]。AtACBP1和 AtACBP2能夠被Pb(II)、Cd(II)、Cu(II)等離子脅迫誘導表達, 他們通過結合轉(zhuǎn)運亞油酰(18:2)輔酶A、亞麻酰(18:3)輔酶A來促進細胞膜修復[23], 過表達AtACBP2能夠增強擬南芥抗旱性[24]。AtACBP3通過水楊酸信號途徑參與擬南芥的抗病性, 在AtACBP3過表達的擬南芥植株中, 提升了擬南芥對假單胞菌(Pseudomonas syringae)侵染的抵抗能力。同時, ACBP基因家族參與低溫脅迫響應過程, AtACBP1和AtACBP6均參與擬南芥抗凍反應, 但二者功能截然相反。沉默 AtACBP6 后, 發(fā)現(xiàn)擬南芥對凍害更加敏感, 而敲除 AtACBP1,擬南芥抗凍性卻得到增強[25-26]。水稻(Oryza sativa)中研究也表明, OsACBP4、OsACBP5和OsACBP6顯著受鹽及干旱脅迫誘導[27]。以上研究表明, ACBP基因家族在植物生長發(fā)育和響應脅迫方面具有重要作用。

棉花是我國及世界上重要的經(jīng)濟作物。隨著氣候變化及耕地面積的減少, 為滿足水稻、小麥、玉米等糧食作物的種植需求, 更多的棉花種植向較為干旱、灘涂鹽堿、貧瘠的土地轉(zhuǎn)移。高鹽、干旱脅迫對棉花生長及最終產(chǎn)量具有重要影響[28]。提高棉花抗逆性、培育抗逆新品種是確保棉花產(chǎn)業(yè)安全的有效途徑。ACBP作為一類重要的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及響應脅迫的基因家族, 對其在棉花生長及抗逆過程中的功能研究相對較少。本研究結合最近公布的陸地棉基因組序列信息[29]分析棉花ACBP基因家族結構、分布、表達特征, 通過qRT-PCR、VIGS等方法[30]驗證GhACBP3和GhACBP6在陸地棉高鹽、干旱脅迫中的功能, 為利用 ACBP基因提高棉花抗逆性提供了重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用耐旱、耐鹽陸地棉品種晉棉19 (Gossypium hirsutum cv.Jinmian 19)進行目標基因表達分析和VIGS試驗。將其種植于南京農(nóng)業(yè)大學植物生長室, 16 h (28℃)/8 h (25℃)(白天/晚上)生長條件。VIGS侵染菌株為根癌農(nóng)桿菌 GV3101 (Agrobacterium tumefaciens GV3101), 轉(zhuǎn)化載體為煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus)載體TRV1和TRV2。

1.2 陸地棉ACBP家族序列獲取

利用釋放的陸地棉遺傳標準系 TM-1 (Gossypium hirsutum acc.TM-1)基因組序列信息[29], 參考擬南芥中 ACBP基因序列, 從棉花基因組中獲取全部含有 ACBP結構域的序列, 并根據(jù)不同組織器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析各成員表達水平。

1.3 陸地棉ACBP家族生物信息學分析

將所獲取的棉花ACBP序列和擬南芥ACBP序列進行系統(tǒng)進化分析。使用ClustalX軟件比對氨基酸序列[31], 用 MEGA5.0軟件通過鄰接算法構建系統(tǒng)進化樹[32], 用BootStrap檢驗, 并重復1000次。通過 NCBI-Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)網(wǎng)站分析功能結構域、跨膜結構域和信號肽。使用Premier 5.0軟件(http://www.premierbiosoft.com/)設計定量引物、用于構建 VIGS載體的引物及基因沉默后目標基因表達檢測引物(表1)。

1.4 誘導表達分析及qRT-PCR檢測

在二葉一心期, 分別對晉棉 19進行干旱(PEG-6000, 20%)、鹽(NaCl, 200 mmol L–1)、低溫(4℃)、高溫(40℃)及過氧化氫(H2O2, 10 mmol L–1)、水楊酸(SA, 10 mmol L–1)、茉莉酸(JA, 10 mmol L–1)、脫落酸(ABA, 100 μmol L–1)和乙烯(ET, 10 mmol L–1)處理。對每一處理分別在處理后0、0.5、1、2、4、6、8、10、12和24 h取葉片樣品, 取3株作為生物學重復, 液氮保存?zhèn)溆?。采?RNA提取試劑盒(BioFlux)提取樣品RNA, –70℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂梅崔D(zhuǎn)錄試劑盒(HiScriptIIQRT SuperMix for qPCR)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈, –20℃保存cDNA產(chǎn)物備用。VIGS候選基因沉默的檢測樣品處理同上。

表1 ACBP家族基因表達分析及載體構建所用引物Table1 Primers for expression analysis and vector construction of ACBP family genes

按照SYBR Green說明書敘述的定量反應體系,以棉花持家基因 His3 (AF024716)為內(nèi)參基因, 在7500型實時熒光定量PCR儀(ABI, USA)上完成定量PCR擴增, 每個生物學重復單株中設置 3次技術重復。擴增程序為95℃預變性10 min; 94℃變性15 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 40個循環(huán); 72℃延伸10 min, 以熔解曲線繪制程序結束。反應結束后, 采用2–ΔΔCt分析數(shù)據(jù)。

1.5 GhACBP3和 GhACBP6基因沉默植株的抗旱或耐鹽性鑒定

在GhACBP3和GhACBP6中分別選取401 bp 和273 bp的基因?qū)；蛄凶鳛楹蜻x片段, 采用同源重組法構建融合該片段的 TRV2基因沉默載體(表1)。經(jīng)金斯瑞生物科技有限公司(南京)測序證明載體無誤。以TRV1和含有候選基因片段的TRV2分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌工程菌, 于28℃培養(yǎng)72 h, 挑單克隆檢測, 確認攜帶載體的陽性農(nóng)桿菌株。經(jīng)過培養(yǎng)后, 將TRV1重懸液和TRV2::GhACBP3、TRV2::GhACBP6、TRV2::GhCLA1、TRV2::00分別以1∶1 (體積比)比例混勻后, 采用針筒浸潤法, 從葉片背部注射菌液,進行棉花VIGS沉默。隨后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(白天16 h/23℃; 晚上8 h/21℃), 約兩周后目的基因沉默, 其中注射TRV2::GhCLA1 (編碼1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶, 沉默后引起植株葉片白化表型)的棉花葉片白化, 作為基因沉默的標識表型。

待幼苗生長至3~4片真葉期, 分別用15% PEG、250 mmol L–1NaCl直接從培養(yǎng)缽頂部澆灌, 觀察表型。PEG處理約10 d及NaCl處理約20 d后對表型拍照并取樣用于測生理指標。選用子葉節(jié)以上部分測量株高; 采用倒 3葉離體測定干旱導致的葉片失水率, 每小時測量1次; 取根及地上幼苗部分于105℃殺青 5 min, 95℃過夜烘干, 測定其重量, 取三個單株作為生物學重復, 并計算平均值; 使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定生理指標(超氧化物歧化酶 SOD、過氧化物酶 POD和丙二醛MDA)[30], 每個生理指標測定采用3個生物學重復,每個生物學重復設置3次技術重復。

2 結果與分析

2.1 陸地棉ACBP家族基因生物信息學分析

基于高度保守的ACBP (PF00887)結構域, 在異源四倍體陸地棉TM-1 (AADD)基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出21條序列, 其中A亞組含有10個ACBP成員, 分布于5個A亞組染色體, D亞組含有10個ACBP成員, 分布于4個D亞組染色體, 另外1條尚未確定具體染色體歸屬(表2)。該家族成員的開放閱讀框(ORF)核苷酸序列長度從267 bp到2109 bp, 預測對應編碼氨基酸序列長度88 aa到702 aa不等。參照擬南芥分類方法和系統(tǒng)進化分析結果, 將陸地棉 21條氨基酸序列分成I~IV類(圖1)。6個陸地棉ACBP基因和擬南芥AtACBP6分屬一支, 歸為第I類; 2個和AtACBP1、AtACBP2分屬一支, 屬于第II類; 5個和AtACBP3聚為一支, 為第III類; 8個和AtACBP4、AtACBP5聚為一支, 為第 IV類。根據(jù)該分類結果,分別將這 21條ACBP家族基因命名為GhACBP1~ GhACBP6亞類(圖1), 除了GhACBP1和GhACBP2中分別只包含一個亞組成員外, 其余每個基因都具有A亞組和D亞組2個成員。

2.2 陸地棉ACBP家族基因表達分析

2.2.1 陸地棉 TM-1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析 該家族不同亞類基因在不同組織、器官和不同發(fā)育時期的胚珠、纖維中其表達量差異較大(圖2)。GhACBP6-1 和GhACBP6-2在所有成員中表達量最高, 呈組成型表達模式, 其他 ACBP基因在不同組織中表達水平存在較大差異。GhACBP1在胚珠發(fā)育過程中優(yōu)勢表達; GhACBP3-2在纖維次生壁發(fā)育期優(yōu)勢表達, 而GhACBP3-3在花、花瓣及雄蕊中優(yōu)勢表達; GhACBP4-2在纖維發(fā)育過程中均優(yōu)勢表達。

2.2.2 不同逆境脅迫誘導表達分析 未檢測到GhACBP2在葉片中表達, GhACBP4和GhACBP5對這 4種逆境脅迫的響應不明顯, 而 GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6均受到不同逆境處理的誘導表達(圖3)。特別是GhACBP3在干旱、低溫和高溫脅迫下表達量顯著上升, 是處理前表達量的 2~20倍,同時在鹽處理2 h和4 h后, 表達水平也顯著提高; GhACBP6在干旱、鹽、低溫和高溫脅迫下, 表達水平極顯著升高, 推測在棉花受逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

圖1 擬南芥和陸地棉中ACBP基因家族的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of ACBP genes in Arabidopsis thaliana and Gossypium hirsutum

圖2 陸地棉ACBP家族基因表達譜Fig.2 Expressional patterns of ACBP genes in multiple tissues in Gossypium hirsutum

圖3 棉花ACBP基因在干旱、鹽、低溫及高溫脅迫下的表達水平Fig.3 Expression level of cotton ACBP genes under drought, salt, low temperature and high temperature stresses

GhACBP3和GhACBP6亞類基因均受過氧化氫(H2O2)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、乙烯(ET) 5種植物信號物質(zhì)的顯著誘導(圖4)。表明GhACBP3和GhACBP6能夠響應陸地棉體內(nèi)多種信號途徑, 可能參與多種防御功能。

2.3 GhACBP3和 GhACBP6抗旱、耐鹽功能鑒定

2.3.1 GhACBP3和GhACBP6沉默水平檢測 不同組合的VIGS載體分別注射子葉完全展開的棉株, 10天后, 作為沉默標識表型的TRV2::GhCAL1組幼苗真葉出現(xiàn)白化表型, 而其他組并無顯著白化表型(圖5)。對不注射對照組(CK)、注射TRV2::00組以及注射TRV2::GhACBP3、TRV2::GhACBP6組檢測GhACBP3與 GhACBP6基因的表達水平, 發(fā)現(xiàn)TRV2::GhACBP3、TRV2::GhACBP6組的目標基因均被顯著沉默(圖6)。

圖4 GhACBP3和GhACBP6在過氧化氫(H2O2)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)和乙烯(ET)處理后的表達水平Fig.4 Expression levels of GhACBP3 and GhACBP6 after hydrogen peroxide (H2O2), salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), abscisic acid (ABA), and ethylene (ET) treatment

2.3.2 GhACBP3和GhACBP6抗旱鑒定 脅迫處理10 d后, PEG處理組植株出現(xiàn)葉片失水、萎蔫等典型的植株受干旱脅迫表型, 同期澆水對照組并無以上顯著表型(圖7和圖8)。與野生型 CK及TRV2::00植株相比, TRV2::GhACBP3基因沉默植株表現(xiàn)出對干旱的高度敏感, 葉片褐化死亡, 莖稈明顯彎曲(圖7-D, E, F)。與CK及TRV2::00植株相比, TRV2::GhACBP3基因沉默植株在干旱處理后, 根及幼苗的干物質(zhì)重量顯著降低, 失水率顯著加快, 植株也顯著變矮(圖9-A, B, C)。TRV2::GhACBP3基因沉默植株中超氧化物歧化酶(SOD)含量、過氧化物酶(POD)含量顯著降低, 而丙二醛(MDA)含量顯著升高(圖9-D, E, F)。

圖5 沉默GhACBP3和GhACBP6的植株表型Fig.5 Phenotype of VIGS cotton plants with silencing of GhACBP3 and GhACBP6

與野生型 CK及 TRV2::00植株相比, TRV2:: GhACBP6基因沉默植株對干旱表現(xiàn)敏感, 雖然沒有GhACBP3基因沉默植株反應強烈, 但顯示明顯的葉片黃斑及失水表型, 而在CK及TRV2::00植株中很少出現(xiàn)此表型(圖8-D, E, F)。TRV2::GhACBP6基因沉默植株在干旱處理后, 植株根及幼苗的干物質(zhì)重量顯著降低, 失水率顯著增加, 植株也顯著變矮(圖10-A, B, C)。同時, 其超氧化物歧化酶(SOD)含量、過氧化物酶(POD)含量顯著降低, 而丙二醛(MDA)含量顯著升高(圖10-D, E, F)。綜上所述, GhACBP3 和 GhACBP6抑制表達均顯著降低棉花對干旱的抵抗能力。

2.3.3 GhACBP3和GhACBP6耐鹽鑒定 與CK 及TRV2::00植株相比, TRV2::GhACBP3基因沉默植株在鹽處理第10天葉片出現(xiàn)黃斑, 同時葉片顏色變深, 是植物受到鹽脅迫的典型性狀, 第15天出現(xiàn)倒一葉生長停滯, 第25天倒一葉出現(xiàn)皺縮, 部分植株已經(jīng)皺縮死亡(圖11-D, E, F, G)。與正常澆水對照組相比, 鹽處理組的植株生長受到抑制, 植株高度顯著降低; 同時, 在受到鹽脅迫后, TRV2::GhACBP3基因沉默植株的株高和干物質(zhì)量與CK及TRV2::00植株相比顯著降低(圖12-A, B)。與對照相比, TRV2::GhACBP3植株中SOD和POD活性顯著降低, 而MDA含量顯著升高(圖12-C, D, E)。

圖6 GhACBP3和GhACBP6在VIGS植株中的基因沉默水平Fig.6 Silencing level of GhACBP3 and GhACBP6 in VIGS cotton plants

TRV2::GhACBP6基因沉默植株在受到鹽脅迫后其表型與GhACBP3沉默植株略有不同。GhACBP6沉默植株在鹽脅迫20 d后出現(xiàn)嚴重的倒一葉生長停滯, 且葉片皺縮, 出現(xiàn)黃斑較少, 葉片顏色變深(圖13-D, E, F, G)。與CK及TRV2::0植株相比, GhACBP6沉默植株的干物質(zhì)量及株高顯著降低, 表明其正常生長受到嚴重抑制(圖14-A, B)。SOD和POD活性在GhACBP6沉默植株中顯著降低, MDA含量顯著升高(圖8-C, D, E)。

圖7 GhACBP3沉默植株在干旱脅迫下的表型Fig.7 Phenotype of GhACBP3-silencing plants under drought stress

圖8 GhACBP6沉默植株在干旱脅迫下的表型Fig.8 Phenotype of GhACBP6-silencing plants under drought stress

(圖9 )

圖9 GhACBP3沉默植株在干旱脅迫下的生長參數(shù)(A、C)及生理指標(B、D~F)Fig.9 Growth parameters (A and C) and physiological index (B and D–F) of GhACBP3-silencing plants under drought stress

(圖10)

圖10 GhACBP6沉默植株在干旱脅迫下的生長參數(shù)(A、C)及生理指標(B、D~F)Fig.10 Growth parameters (A and C) and physiological index (B and D–F) of GhACBP6-silencing plants under drought stress

(圖12)

圖12 GhACBP3沉默植株在鹽脅迫下的生長參數(shù)(A、B)及生理指標(C、D和E)檢測Fig.12 Growth parameters (A and B) and physiological index (C, D, and E) of GhACBP3-silencing plants under salt stress

圖13 GhACBP6沉默植株在鹽脅迫下的表型Fig.13 Phenotype of GhACBP6-silencing plants under salt stress

圖14 GhACBP6沉默植株在鹽脅迫下的生長參數(shù)(A、B)及生理指標(C、D和E)Fig.14 Growth parameters (A and B) and physiological index (C, D, and E) detection of GhACBP6-silencing plants under salt stress

總之, GhACBP3和GhACBP6沉默后, 鹽脅迫下會導致棉花幼苗生長嚴重滯緩, 葉片幼小, 整株孱弱, 對鹽脅迫的抵抗力下降, 對棉花的生長發(fā)育造成不可逆的傷害。說明 GhACBP3和GhACBP6亞類基因在棉花幼苗抵抗鹽脅迫過程中具有重要作用。

3 討論

ACBP家族基因在應對植物生物及非生物脅迫及多種生長發(fā)育過程中具有重要作用[1,13,19,33]。本研究將21個ACBP基因分為I~IV四大類。每一類包含1~2個擬南芥ACBP成員及多個陸地棉成員, 說明ACBP家族基因在陸地棉基因組中進行了多次基因復制與擴張。

ACBP家族基因能夠在擬南芥多種組織中表達,如種子、葉片及根中, 且一些家族成員具有組織表達特異性[9,21,23]; 在水稻中, 不同 ACBP家族基因的表達也表現(xiàn)出器官和組織特異性[27]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及qRT-PCR分析表明, 陸地棉ACBP家族基因的表達具有明顯的時空特異性, 暗示 ACBP不同家族成員間具生物學功能的多樣性。進一步研究表明, ACBP家族基因響應多種逆境, 特別是GhACBP1、GhACBP3和GhACBP6亞類基因受到多種逆境處理均誘導表達。同時, GhACBP3和GhACBP6亞類基因也受包括過氧化氫(H2O2)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、乙烯(ET) 5種植物激素顯著誘導。說明GhACBP3和GhACBP6基因可能是調(diào)控陸地棉逆境下生長發(fā)育的關鍵 ACBP成員。

在擬南芥中, AtACBP3能夠通過調(diào)控細胞膜磷脂代謝及胞吞作用相關蛋白 ATG8的穩(wěn)定性而影響葉片衰老過程。過量表達AtACBP3基因能夠增加或減少植株中磷脂酰乙醇胺(PE)、半乳糖脂和磷脂的含量, 而抑制表達則獲得相反結果[34]。本研究通過VIGS試驗沉默GhACBP3基因后, 在高鹽、干旱脅迫下, 植株葉片損傷嚴重, 膜質(zhì)過氧化有害衍生物含量升高, 生長發(fā)育滯緩, 顯著降低了陸地棉抗旱、耐鹽能力。說明GhACBP3基因能夠參與棉花的多種逆境脅迫反應, 在陸地棉抗旱、耐鹽中具有重要生物學作用。與GhACBP3基因在陸地棉抗旱、耐鹽中的作用類似, GhACBP6基因沉默后也會顯著降低陸地棉的抗旱、耐鹽能力。擬南芥研究表明, AtACBP6能夠結合亞麻酰輔酶A酯、油酰輔酶A酯等輔酶酯類和卵磷脂(PC), 過表達AtACBP6能夠上調(diào)磷脂酶Dδ (PLDδ)的表達, 從而促進甘油磷酸酯(PA)的合成,并能夠在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運卵磷脂參與脂類代謝, 而促進細胞膜的修復[26]。推測 GhACBP6基因在棉花抗逆過程中的作用也是通過參與細胞膜的修復來完成。本研究發(fā)現(xiàn), GhACBP3和GhACBP6基因沉默植株在受到干旱及鹽脅迫后其表型有所差異。在受到干旱脅迫后, GhACBP3沉默植株葉片萎焉死亡嚴重, 而 GhACBP6沉默植株的這種表型較輕; 受到鹽脅迫后, GhACBP3沉默植株葉片出現(xiàn)黃斑較多, 倒一葉停止生長也較早, 而GhACBP6沉默植株葉片出現(xiàn)黃斑較少, 倒一葉停止生長也晚。這與AtACBP3和 AtACBP6基因調(diào)控擬南芥發(fā)育過程存在差異相一致[26,34],說明GhACBP3和GhACBP6基因在陸地棉抗旱、耐鹽中的作用可能有所差異, 或者兩者的非生物脅迫抗性機制存在不同, 其作用機制需要進一步研究。

鹽、旱害主要通過植物體內(nèi)滲透脅迫、離子毒害和營養(yǎng)供應失衡而引起, 植物通過啟動自身眾多防御基因, 從信號響應到信號傳遞, 最后到功能基因作用的發(fā)揮, 包括提高脯氨酸、脂類等有機物質(zhì)含量, 修復受損機體等。目前在棉花中已經(jīng)鑒定出許多和抗旱、耐鹽相關的基因, 包含轉(zhuǎn)錄因子[35]、激酶基因[36]、胚胎發(fā)生晚期富集蛋白、離子通道蛋白等。而ACBP家族基因涉及到植物體內(nèi)?；o酶A庫的穩(wěn)定, 細胞膜修復所需磷脂類物質(zhì)的合成及轉(zhuǎn)運, 生長發(fā)育所需脂類及傳遞抗逆信號的磷脂類含量變化的識別, ACBP家族基因和脂類代謝對植物抵抗高鹽、干旱等逆境具有不可忽視的作用。植物在鹽漬化土壤中會遭受水分虧缺和 Na+毒害的雙重作用, 本研究鑒定完成的GhACBP3和GhACBP6基因同時參與陸地棉的抗旱、耐鹽進程, 有望在棉花抗逆育種方面發(fā)揮重要作用。

4 結論

基于陸地棉遺傳標準系 TM-1序列信息, 獲得21個棉花ACBP家族成員信息, 并完成系統(tǒng)進化和分類分析。ACBP家族不同亞類基因在不同組織、不同發(fā)育時期表達差異大, 其中GhACBP1、GhACBP3 和GhACBP6顯著受高鹽、干旱、低溫、高溫等逆境脅迫誘導。沉默GhACBP3和GhACBP6導致陸地棉抗旱、耐鹽能力顯著下降, 表明 GhACBP3和GhACBP6在棉花抗逆進程中發(fā)揮重要作用。

[1] Liu F, Zhang X, Lu C, Zeng X, Li Y, Fu D, Wu G.Non-specific lipid transfer proteins in plants: presenting new advances and an integrated functional analysis.J Exp Bot, 2015, 66: 5663–5681

[2] Guidotti A, Forchetti C M, Corda M G, Konkel D, Bennett C D, Costa E.Isolation, characterization, and purification to homogeneity of an endogenous polypeptide with agonistic action on benzodiazepine receptors.Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80: 3531–3535

[3] Alho H, Costa E, Ferrero P, Fujimoto M, Cosenza-Murphy D, Guidotti A.Diazepam-binding inhibitor: a neuropeptide located in selected neuronal populations of rat brain.Science, 1985, 229: 179–182

[4] Weselake R J, Nykiforuk C L, Laroche A, Patterson N A, Wiehler W B, Szarka S J, Moloney M M, Tari L W, Derekh U.Expression and properties of diacylglycerol acyltransferase from cell-suspension cultures of oilseed rape.Biochem Soc T, 2000, 28.6

[5] Hills M J, Dann R, Lydiate D, Sharpe A.Molecular cloning of a cDNA from Brassica napus L.for a homologue of acyl-CoA-binding protein.Plant Mol Biol, 1994, 25: 917–920

[6] Engeseth N J, Pacovsky R S, Newman T, Ohlrogge J B.Characterization of an Acyl-CoA-binding protein from Arabidopsis thaliana.Arch Biochem Biophys, 1996, 331: 55–62

[7] Erber A, Horstmann C, Schobert C.A cDNA clone for acyl-CoA-binding protein from castor bean.Plant Physiol, 1997, 114: 396–396

[8] Metzner M L, Ruecknagel K P, Knudsen J, Kuellertz G, Mueller-Uri F, Diettrich B.Isolation and characterization of two acyl-CoA-binding proteins from proembryogenic masses of Digitalis lanata Ehrh.Planta, 2000, 210: 683–685

[9] Guerrero C, Martín-Rufián M, Reina J J, Heredia A.Isolation and characterization of a cDNA encoding a membrane bound acyl-CoA binding protein from Agave americana L.epidermis.Plant Physiol Bioch, 2006, 44: 85–90

[10] Reddy A, Ranganathan B, Haisler R, Swize M.A cDNA encoding acyl-CoA-binding protein from cotton.Plant Physiol, 1996, 111: 348

[11] Burton M, Rose T M, Faergeman N J, Knudsen J.Evolution of the acyl-CoA binding protein (ACBP).Biochem J, 2005, 392: 299–307

[12] Xiao S, Chye M L.New roles for acyl-CoA-binding proteins (ACBPs) in plant development, stress responses and lipid metabolism.Prog Lipid Res, 2011, 50: 141–151

[13] Fan J, Liu J, Culty M, Papadopoulos V.Acyl-coenzyme A binding domain containing 3 (ACBD3; PAP7; GCP60): an emerging signaling molecule.Prog Lipid Res, 2010, 49: 218–234

[14] Xiao S, Chye M L.An Arabidopsis family of six acyl-CoA-binding proteins has three cytosolic members.Plant Physiol Bioch, 2009, 47: 479–484

[15] Kannan L, Knudsen J, Jolly C A.Aging and acyl-CoA binding protein alter mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase activity.Biochim Biophys Acta, 2003, 1631: 12–16

[16] Knudsen J, Burton M, Faergeman N.Long chain acyl-CoA esters and acyl-CoA binding protein (ACBP) in cell function.Elsevier: Advances in Molecular and Cell Biology: 2003.pp 123–152

[17] Faergeman N J, Feddersen S, Christiansen J K, Larsen M K, Schneiter R, Ungermann C, Mutenda K, Roepstorff P, Knudsen J.Acyl-CoA-binding protein, Acb1p, is required for normal vacuole function and ceramide synthesis in Saccharomyces cerevisiae.Biochem J, 2004, 380: 907–918

[18] Gaigg B, Neergaard T B, Schneiter R, Hansen J K, Faergeman N J, Jensen N A, Andersen J R, Friis J, Sandhoff R, Schr?der H D, Knudsen J.Depletion of acyl-coenzyme A-binding protein affects sphingolipid synthesis and causes vesicle accumulation and membrane defects in Saccharomyces cerevisiae.Mol Biol Cell, 2001, 12: 1147–1160

[19] Larsen M K, Tuck S, Faergeman N J, Knudsen J.MAA-1, a novel acyl-CoA-binding protein involved in endosomal vesicle transport in Caenorhabditis elegans.Mol Biol Cell, 2006, 17: 4318–4329

[20] Chen Q F, Xiao S, Qi W, Mishra G, Ma J, Wang M, Chye M L.The Arabidopsis acbp1acbp2 double mutant lacking acyl-CoA-binding proteins ACBP1 and ACBP2 is embryo lethal.New Phytol, 2010, 186: 843–855

[21] Baud S, Guyon V, Kronenberger J, Wuillème S, Miquel M, Caboche M, Lepiniec L, Rochat C.Multifunctional acetyl-CoA carboxylase 1 is essential for very long chain fatty acid elongation and embryo development in Arabidopsis.Plant J, 2003, 33: 75–86

[22] Sellwood C, Slabas A, Rawsthorne S.Effects of manipulating expression of acetyl-CoA carboxylase I in Brassica napus L.embryos.Biochem Soc T, 2000, 28: 598–600

[23] Gao W, Xiao S, Li H Y, Tsao S W, Chye M L.Arabidopsis thaliana acyl-CoA-binding protein ACBP2 interacts with heavy-metal-binding farnesylated protein AtFP6.New Phytol, 2009, 181: 89–102

[24] Du Z Y, Chen M X, Chen Q F, Xiao S, Chye M L.Overexpression of Arabidopsis acyl-CoA-binding protein ACBP2 enhances drought tolerance.Plant Cell Environ, 2013, 36: 300–314

[25] Du Z Y, Xiao S, Chen Q F, Chye M L.Depletion of the membrane-associated acyl-coenzyme A-binding protein ACBP1 enhances the ability of cold acclimation in Arabidopsis.Plant Physiol, 2010, 152: 1585–1597

[26] Chen Q F, Xiao S, Chye M L.Overexpression of the Arabidopsis 10-kilodalton acyl-coenzyme A-binding protein ACBP6 enhances freezing tolerance.Plant Physiol, 2008, 148: 304–315

[27] Meng W, Su Y C, Saunders R M, Chye M L.The rice acyl-CoA-binding protein gene family: phylogeny, expression and functional analysis.New Phytol, 2011, 189: 1170–1184

[28] 戴海芳, 武輝, 阿曼古麗·買買提阿力, 王立紅, 麥麥提·阿皮孜, 張巨松.不同基因型棉花苗期耐鹽性分析及其鑒定指標篩選.中國農(nóng)業(yè)科學, 2014, 47: 1290–1300

Dai H F, Wu H, Amanguli·Maimaitiali, Wang L H, Maimaiti·Apizi, Zhang J S.Sci Agric Sin, 2014, 47: 1290–1300 (in Chinese with English abstract).

[29] Zhang T, Hu Y, Jiang W, Fang L, Guan X, Chen J, Zhang J, Saski C A, Scheffler B E, Stelly D M, Hulse-Kemp A M, Wan Q, Liu B, Liu C, Wang S, Pan M, Wang Y, Wang D, Ye W, Chang L, Zhang W, Song Q, Kirkbride R C, Chen X, Dennis E, Llewellyn D J, Peterson D G, Thaxton P, Jones D C, Wang Q, Xu X, Zhang H, Wu H, Zhou L, Mei G, Chen S, Tian Y, Xiang D, Li X, Ding J, Zuo Q, Tao L, Liu Y, Li J, Lin Y, Hui Y, Cao Z, Cai C, Zhu X, Jiang Z, Zhou B, Guo W, Li R, Chen Z J.Sequencing of allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L.acc.TM-1) provides a resource for fiber improvement.Nat Biotechnol, 2015, 33: 531–537

[30] Zhang F, Li S, Yang S, Wang L, Guo W.Overexpression of a cotton annexin gene, GhAnn1, enhances drought and salt stress tolerance in transgenic cotton.Plant Mol Biol, 2015, 87: 47–67

[31] Julie D.Thompson T J G, Frédéric P, Fran?ois J D G.Higgins.The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res, 1997, 25: 4876–4882

[32] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S.MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods.Mol Biol Evol, 2011, 28: 2731–2739

[33] Xiao S, Chye M L.Overexpression of Arabidopsis ACBP3 en-hances NPR1-dependent plant resistance to Pseudomonas syringe pv tomato DC3000.Plant Physiol, 2011, 156: 2069–2081

[34] Xiao S, Gao W, Chen Q F, Chan S W, Zheng S X, Ma J, Wang M, Welti R, Chye M L.Overexpression of Arabidopsis Acyl-CoA binding protein ACBP3 promotes starvation-induced and agedependent leaf senescence.Plant Cell, 2010, 22: 1463–1482

[35] Chu X, Wang C, Chen X, Lu W, Li H, Wang X, Hao L, Guo X.The cotton WRKY gene GhWRKY41 positively regulates salt and drought stress tolerance in transgenic Nicotiana benthamiana.PLoS One, 2015, 10: e0143022

[36] Shi J, Zhang L, An H, Wu C, Guo X.GhMPK16, a novel stress-responsive group D MAPK gene from cotton, is involved in disease resistance and drought sensitivity.BMC Mol Biol, 2011, 12: 22

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Genome-wide Identification of Acyl-CoA-Binding Protein (ACBP) Gene Family and Their Functional Analysis in Abiotic Stress Tolerance in Cotton

QIN Peng-Fei, SHANG Xiao-Guang, SONG Jian, and GUO Wang-Zhen*
State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Acyl-CoA-binding protein (ACBP) plays important roles in plant development, including normal growth, response to biotic/abiotic stress and membrane system repairing.However, the functions of ACBPs in cotton still remain largely unknown.Based on the G.hirsutum TM-1 genome database, we identified 21 ACBP genes and obtained their sequence information, chromosomal location.Phylogenetic analysis revealed that the 21 ACBP genes were classified into four groups.According to the nomenclature of A.thaliana homologous gene, the cotton ACBP genes were named as GhACBP1–GhACBP6 subclasses.Transcriptome data showed that the expression patterns of ACBP genes varied significantly in different cotton tissues.Further abiotic stresses treatment analysis showed that GhACBP1, GhACBP3, and GhACBP6 sub-class genes could be significantly induced by drought, salt, low temperature and high temperature treatments, while GhACBP4 and GhACBP5 sub-class genes could not.GhACBP3 and GhACBP6 could also be significantly induced by hydrogen peroxide (H2O2), salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA), abscisic acid (ABA), and ethylene (ET).Virus induced gene silencing (VIGS) results exhibited that down-regulation of GhACBP3 and GhACBP6 sub-class genes would significantly reduce the plant tolerance to drought and salt stresses.Compared with the control, the GhACBP3 and GhACBP6 silencing plants demonstrated significantly reduced plant dry matter, decreased plant height, lower superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) activities, and increased malondialdehyde (MDA) content.These results support the important functions of GhACBP3 and GhACBP6 in cotton tolerance to drought and salt.This study will provide useful information for further use of ACBP genes in future cotton studies and breeding practice.

Cotton; ACBP gene family; Structure; Expression; Drought stress; Salt stress

10.3724/SP.J.1006.2016.01577

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2015ZX08005-004)和江蘇現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心(No.10)項目資助。

This program was financially supported in part by the National Majar Project for Developing New GM Crops (2011ZX08005-004) and Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production Project (No.10).

*通訊作者(Corresponding author): 郭旺珍, E-mail: moelab@njau.edu.cn, Tel: 025-84396523

稿日期): 2016-02-29; Accepted(接受日期): 2016-07-11; Published online(

日期): 2016-08-11.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160811.1623.024.html