響應(yīng)面法優(yōu)化參麥醒腦方提取工藝及益智作用初步觀察

馮彬彬,張建海,*

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系,重慶 404120;2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心,重慶 404120)

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響應(yīng)面法優(yōu)化參麥醒腦方提取工藝及益智作用初步觀察

馮彬彬1,2,張建海1,2,*

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系,重慶 404120;2.重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心,重慶 404120)

目的:優(yōu)化參麥醒腦方提取工藝并進行益智作用觀察。方法:以黨參多糖和黨參炔苷得率為指標(biāo),通過單因素實驗設(shè)計,考察超聲時間、超聲溫度和料液比3個因素對提取工藝的影響趨勢,采用Box-behnken響應(yīng)面法對關(guān)鍵因素的參數(shù)范圍進一步的研究和探討;采用Morris水迷宮進行參麥醒腦方益智作用初步觀察。結(jié)果:黨參多糖和黨參炔苷的最佳提取工藝參數(shù):超聲時間32 min,超聲溫度52 ℃,液固比1∶27,此條件下參麥醒腦組方中黨參炔苷提取得率和黨參多糖成分保留率分別為(5.18±0.22) μg/g和2.07%±0.15%。Morris水迷宮實驗結(jié)果表明,參麥醒腦方能改善D-半乳糖、NaNO2致小鼠記憶損傷。結(jié)論:采用響應(yīng)面法能夠優(yōu)化黨參多糖和黨參炔苷的最佳提取工藝;參麥醒腦方保健品具有益智作用。

響應(yīng)面法,參麥醒腦方,提取工藝,水迷宮

記憶功能減退(健忘)是輕度認(rèn)知損害的標(biāo)志癥狀,目前西醫(yī)對其尚無肯定療法,而傳統(tǒng)中醫(yī)藥在長期的臨床實踐中積累了豐富的經(jīng)驗;中藥又具有多途徑、多靶點的特點,因而中藥在改善記憶方面已成為熱點研究,國內(nèi)外研究者紛紛對中藥增智健腦問題進行廣泛地探討[1-4]。中醫(yī)認(rèn)為健忘是一個病變涉及多個臟腑,又與氣血痰濁密切相關(guān)的綜合性復(fù)雜病癥,但其中心環(huán)節(jié)是脾腎二臟,脾腎虧衰日久,加重認(rèn)知功能障礙,從而會產(chǎn)生癡呆,糾正了脾腎的虧損,就解決了病變的關(guān)鍵。參麥醒腦組方以黨參為君藥補先天精氣以充腦髓,佐以麥冬、熟地、生棗仁、遠(yuǎn)志健脾寧心以安神,全方具有補脾益腎、益智醒腦、寧心安神的功效。

參麥醒腦方以黨參為主要材料,輔以熟地、麥冬、生棗仁、遠(yuǎn)志等可用于保健品的中藥材,由《辨證錄》中強記湯加減而成,主要用于健忘增智抗衰老。其中主藥黨參為桔?？浦参锎h參CodonopsistangshenOliv.的根,主要含有苷類、甾醇類、三萜類、木脂素、倍半萜、黃酮類和多糖類等多種化學(xué)成分,其中多糖達51.79%,黃酮0.192%[5-7]。黨參具有補中和胃、清肺、補氣益血、生津化痰的作用,同時具有益智、延緩衰老、改善記憶力等的功效。黨參富含多糖和黃酮類化合物,其中黨參多糖具有預(yù)防老年癡呆癥、調(diào)節(jié)免疫功能、促進造血功能的作用。實驗證明新疆黨參多糖可使小鼠SOD增加、MDA減少,具有清除體內(nèi)自由基的作用,并通過SOD的增加和MDA的減少起到預(yù)防老年癡呆癥發(fā)病[8-9],黨參水煎劑可對抗PIA對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響,具有改善記憶的作用[10]。文獻表明黨參炔苷可作為黨參的一個重要鑒別和質(zhì)量評價標(biāo)志[11],黨參炔苷對乙醇造成的胃黏膜損傷有很好的保護作用[5-7]。本文以黨參多糖和黨參炔苷為主要指標(biāo),研究組提取工藝及參麥醒腦方對改善記憶的功效研究組方,為黨參系列保健品開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

昆明種小鼠清潔級,雌性,體重為(20±2) g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供;合格證號:SCXK(渝)2007-0001;對照品黨參炔苷(批號:111732-201206)和無水葡萄糖(批號:110833-201205)均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈、甲醇色譜純,迪馬公司;乙醇、甲醇、NaNO2等均為分析純，西隴化工股份有限公司;D-半乳糖成都市科龍化工試劑廠;腦復(fù)康東北制藥廠;水去離子水;黨參重慶市神女藥業(yè)股份有限公司;熟地、麥冬、生棗仁、遠(yuǎn)志等中藥材均購置于桐君閣大藥房,均由本校中藥教研室張建海教授鑒定。

Agilent1260美國安捷倫公司;U-3010紫外分光光度計日本日立;Sorvall Legend Micro 17型離心機美國Thermo公司;KQ5200E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;BSA224S電子天平賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;GZX-9240 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HH.SYZ1-NI型電熱恒溫水浴鍋北京市長風(fēng)儀器儀表公司;SHB-IV雙A循環(huán)式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司;ZS001-Morris水迷宮北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司;Millipore(Aquelix5)純水系統(tǒng)。

1.2實驗方法

1.2.1參麥醒腦方提取工藝按參麥醒腦方稱取黨參、熟地、麥冬、生棗仁、遠(yuǎn)志適量,粉碎,通過改變超聲時間、超聲溫度和料液比進行提取,共提取三次,合并提取液,濃縮,制成每毫升含生藥1 g藥液,分別制成1.0、0.5、0.25 g/mL做為參麥醒腦方高、中、低劑量組,備用。

1.2.2黨參多糖和黨參炔苷的測定參考文獻方法[11-15],測定參麥醒腦方中黨參多糖和黨參炔苷的含量。

以葡萄糖為標(biāo)樣,配制成14.31、28.62、57.25、85.88、114.51、143.14 μg/mL 6個濃度,以1.0 mL純化水做參比,在490 nm測吸光度值,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以黨參炔苷為標(biāo)樣,配制成5.000、10.00、20.00、40.00、80.00、160.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用以下色譜條件進行測定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜柱:Agilent-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm),流動相:乙腈-水(21∶79),流速為1.0 mL/min,溫度25 ℃,檢測波長為268 nm,進樣量為10 μL。

樣品測定,按照1.2.2項下操作,取干燥至恒重的參麥醒腦方提取物0.1 g,精密稱定,于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解,過濾,濾液過0.22 μm微孔濾膜,進樣。

1.2.3單因素實驗取參麥醒腦組方藥材粉末10.0 g,精密稱定,以黨參多糖和黨參炔苷含量為評價指標(biāo),初始實驗條件為超聲時間20 min、超聲溫度50 ℃和料液比1∶20,依次以固定兩個因素分別對超聲時間(10、15、20、25、30、35、40 min)、超聲溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)和料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)進行單因素實驗,確定各因素的最佳范圍,每個因素重復(fù)實驗3次,取平均值。

1.2.4提取工藝優(yōu)選基于1.2.3項單因素實驗結(jié)果,取參麥醒腦組方藥材粉末10.0 g,精密稱定,根據(jù)各因素的特點及影響程度,選擇超聲時間、超聲溫度、料液比為自變量,黨參炔苷和黨參多糖為因變量,采用進行三因素三水平Box-behnken Design實驗設(shè)計,每組實驗重復(fù)3次,確定最佳提取工藝,因素水平及編碼見表1。

表1　Box-behnken實驗因素水平表

1.2.5動物實驗

1.2.5.1學(xué)習(xí)記憶障礙模型建立及實驗動物分組按照文獻進行Morris水迷宮篩選健康昆明小鼠65只[16-17],隨機分為正常對照組、模型組;根據(jù)參考文獻稍加改變[18-19]:模型組小鼠腹腔注射D-半乳糖240 mg/(kg·d)和NaNO2180 mg/(kg·d),連續(xù)40 d,正常組小鼠腹腔注射0.2 mL的生理鹽水溶液。造模結(jié)束后,用Morris水迷宮法比較正常對照組和模型對照組動物行為學(xué)指標(biāo),以正常組成績明顯優(yōu)于模型組(p<0.05)表示造模成功。隨機將模型小鼠分為5組:空白對照組、參麥醒腦方高、中、低劑量組、腦復(fù)康組。

1.2.5.2給藥方法各給藥組小鼠在水迷宮檢測造模效果以后,參麥醒腦方高、中、低劑量組每天按0.1 mL/10 g灌胃,正常對照組和模型對照組小鼠灌胃等體積的生理鹽水,腦復(fù)康組每天按0.1 mL/10 g給予腦復(fù)康混懸液,連續(xù)28 d。

1.2.5.3Morris水迷宮法檢測給藥結(jié)束后,對各組實驗大鼠進行Morris水迷宮行為學(xué)檢測。實驗前24 h將大鼠放入水迷宮中自由游泳3 min以熟悉迷宮環(huán)境。測試主要內(nèi)容:用于檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)能力的定位航行實驗,即空間記憶獲得能力,主要通過搜索持續(xù)時間(逃避潛伏期)和搜索路徑長度(到達隱藏平臺的路程)兩個指標(biāo)進行考核;用于檢測大鼠的空間記憶能力的空間探索實驗,主要以穿越目標(biāo)平臺次數(shù)為考核指標(biāo)。

1.3數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并采用Design-Expert 7.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進行整理及統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1黨參多糖和黨參炔苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用1.2.1項下方法分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以吸光度值(Y)為縱坐標(biāo),葡萄糖質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進行線性回歸,回歸方程為:Y=0.1494X-0.078,R2=0.9995,線性范圍14.31～143.14 μg/mL;以峰面積Y對質(zhì)量濃度X進行線性回歸,得黨參炔苷回歸方程Y=53.67X+649.68,R2=0.9991,線性范圍5.000～160.0 μg/mL。線性關(guān)系良好。

2.2單因素實驗結(jié)果

2.2.1超聲溫度按照1.2.3項下方法進行提取,結(jié)果見圖1。由圖1可以看出,其他條件不變的情況下,在一定范圍內(nèi),隨著溫度升高,黨參炔苷和黨參多糖得率先升后降,當(dāng)溫度超過50 ℃后,黨參炔苷得率降低緩慢,而黨參多糖得率則降低很快,可能多糖類成分隨著溫度升高會部分降解,綜合考慮黨參炔苷和黨參多糖的含量,故選擇提取溫度為50 ℃為最佳。

圖1　超聲溫度對黨參炔苷和黨參多糖的影響Fig.1　Effect of extraction temperature on lobetyolin and codonopsis pilosula polysaccharide

2.2.2超聲時間按照1.2.3項下方法進行提取,結(jié)果見圖2。從圖2可以看出隨著超聲時間的延長,在一定時間范圍內(nèi),黨參炔苷和黨參多糖得率均先升高后下降,25 min后黨參炔苷得率開始下降,但降低緩慢;黨參多糖得率在35 min后開始下降,可能超聲時間越長,溫度也會上升,導(dǎo)致多糖得率下降,這與超聲溫度單因素實驗結(jié)果趨勢一致,故綜合考慮選擇30 min超聲提取。

圖2　超聲時間對黨參炔苷和黨參多糖的影響Fig. 2　Effect of ultrasonic time on lobetyolin and codonopsis pilosula polysaccharide

圖3　料液比對黨參炔苷和黨參多糖的影響Fig.3　Effect of solid to liquid ratio on lobetyolin and codonopsis pilosula polysaccharide

2.2.3料液比按照1.2.3項下方法進行提取,結(jié)果見圖3,由圖3可以看出,在一定料液比范圍內(nèi),黨參炔苷和黨參多糖得率均升高,在1∶25后黨參炔苷得率繼續(xù)升高,但升高幅度很小;黨參多糖得率則開始小幅下降,可能黨參多糖成分復(fù)雜,料液比增大出現(xiàn)部分溶解或成分改變,故綜合考慮故選擇料液比為1∶25最佳。

2.3提取工藝優(yōu)選結(jié)果

2.3.1提取工藝優(yōu)選結(jié)果根據(jù)1.2.4實驗方法,提取工藝優(yōu)選結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2　黨參多糖及黨參炔苷提取工藝的

以參麥醒腦組方中黨參炔苷和黨參多糖提取量為響應(yīng)值,采用Design-Expert 7.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進行三元二次多項式逐步回歸擬合,黨參炔苷和黨參多糖回歸方程分別為Y1=5.15+0.26A+0.19B+0.097C+0.059AB-0.036AC-0.060BC-0.43A2-0.41B2-0.38C2、Y2=2.09+0.041A+0.061B+0.095C-0.022AB-0.010AC-0.065BC-0.35A2-0.26B2-0.22C2。

從表3方差分析可知,所建回歸模型p值均小于0.01(極顯著),說明響應(yīng)面的模型顯著性較高;失擬項誤差項的p值均大于0.05,說明響應(yīng)面的模型對實驗擬合的情況較好,實驗誤差小,表明此模型成立。從表3可看出,就黨參炔苷成分來看,A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2為顯著性影響因素,在各影響因素中,超聲溫度(A)的影響因素最大;總的作用因素中,一次項和平方項的影響較大,交互項影響相對較小。就黨參多糖成分來看,B、C、BC、A2、B2、C2為顯著性影響因素;在各影響因素中,料液比(C)的影響因素最大;一次項C和A2、B2、C2平方項的影響較大,交互項影響相對較小。

表3　回歸方程方差分析

注:*p<0.05;**p<0.01。

為了更直觀地表現(xiàn)各因素對黨參炔苷和黨參多糖提取量的相互關(guān)系,根據(jù)回歸模型繪制響應(yīng)面曲線圖,其交互作用的兩因素相應(yīng)的響應(yīng)面圖見圖4。由圖4的響應(yīng)面的3D圖可以可直觀地反映各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值。圖4中響應(yīng)面曲線均較陡,等高線圖均為橢圓形,表明各因素中AB和BC對黨參炔苷交互作用顯著;BC對黨參多糖含量交互作用顯著。說明3個因素之間具有顯著性交互作用,這和方差分析的結(jié)果相一致。

2.3.2驗證實驗通過Design Expert軟件進行響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化,確定黨參炔苷最佳提取工藝條件為提取溫度52.76 ℃,超聲時間32.88 min,料液比1∶28.13,黨參炔苷理論提取率為5.18 μg/g;黨參多糖最佳提取工藝條件為提取溫度50.38 ℃,超聲時間30.96 min,料液比1∶27.11,黨參多糖理論提取量2.11%。結(jié)合實際操作考慮,將黨參炔苷和黨參多糖的共同提取工藝條件修正為:提取溫度52 ℃,提取時間32 min,液固比1∶27。按該工藝進行5次驗證實驗,參麥醒腦組方中黨參炔苷提取得率和黨參多糖成分保留率分別為(5.18±0.22) μg/g和2.07%±0.15%,與預(yù)測值基本一致,表明該三元二次方程與實際情況擬合較好,充分驗證了所建模型的準(zhǔn)確性。

2.4動物實驗結(jié)果

根據(jù)1.2.5項下的方法,動物實驗研究結(jié)果見表4。

表4顯示,Morris水迷宮檢測中,搜索持續(xù)時間即逃避潛伏期和搜索路徑長度反映空間記憶獲得能力,與正常組比較,各造模組動物找到平臺的時間明顯延長(p<0.05),說明模型動物其記憶能力沒有自動恢復(fù);與模型組比較,參麥醒腦方除低劑量組外,高、中劑量組動物逃避潛伏期和平均游程均低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),其中參麥醒腦方高劑量組療效最好,說明參麥醒腦方有改善記憶的作用,效果有劑量依賴關(guān)系。提示模型組動物學(xué)習(xí)能力相對較弱,正常組和各給藥組均較模型組學(xué)習(xí)快,除低劑量組外差別均有顯著意義(p<0.05)。各給藥組與空模組的比較提示各給藥組均能顯著改善模型鼠的學(xué)習(xí)能力;各給藥組與正常組比較提示各給藥組無法使模型鼠的學(xué)習(xí)能力改善到正常水平,但可以使模型鼠學(xué)習(xí)能力得到改善,其中高劑量組優(yōu)于其余各給藥組,高劑量組和腦康組療效無顯著差異。

表4　小鼠記憶能力測定±s)

圖4　超聲溫度、超聲時間和料液比對黨參炔苷和黨參多糖影響的響應(yīng)面Fig.4　3D maps of temperature,extraction time and ratio of solid to liquid on lobetyolin and codonopsis pilosula polysaccharide

注:*與模型組比較p<0.05;#與正常組比較p<0.05。

從穿越目標(biāo)平臺的次數(shù)看,除低劑量組外,正常組和各給藥組動物穿越平臺的次數(shù)均明顯高于模型組(p<0.05),反映模型組動物學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損,經(jīng)采用參麥醒腦方治療后,模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力有所提高,參麥醒腦方高劑量組效果最好,與正常組無顯著差異(p>0.05),說明該組動物的記憶能力基本接近正常,這一結(jié)果與定位航行檢測結(jié)果基本吻合。

3　結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了參麥醒腦方中黨參多糖和黨參炔苷的提取工藝,并建立了二次回歸模型,采用此模型得到黨參多糖和黨參炔苷的最佳提取工藝條件為:提取溫度52 ℃,超聲提取時間32 min,液固比1∶27,此條件下參麥醒腦組方中黨參炔苷提取得率和黨參多糖成分保留率分別為(5.18±0.22) μg/g和2.07%±0.15%。

本實驗采用Morris水迷宮進行參麥醒腦方益智作用初步觀察,結(jié)果表明,參麥醒腦組方可拮抗D-半乳糖造成的小鼠記憶獲得不良,改善亞硝酸鈉造成的小鼠記憶鞏固障礙。參麥醒腦組方對D-半乳糖、亞硝酸鈉等化學(xué)藥品誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶障礙具有顯著改善作用。從中醫(yī)理論和實驗結(jié)果可以看出,參麥醒腦組方給藥對記憶障礙具有明顯的影響,應(yīng)深入全面研究其作用機制。

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Optimization of extraction technology of shenmaixingnaofang by box-behnken design and observation nootropic effect of mice

FENG Bin-bin1,2,ZHANG Jian-hai1,2,*

(1.Chongqing Three Gorges Medical College,Depantment of Pharmacy,Chongqing 404120,China;2.Chongqing Engineering Research Center of Antitumor Natural Drugs,Chongqing 404120,China)

Objective:To optimize extraction technology and to observe the nootropic effect of Shenmaixingnaofang. Methods:With the transfer rates of lobetyolin andcodonopsispilosulapolysaccharide,as evaluation indexes,the effect of the three factors,such as ultrasonic time,extraction temperature and solid to liquid ratio was investigated by the single factor experiment. By analysis of variance,the key factors that could influence the process were determined. Then the range of parameters of key factors was further studied and explored by Box-Behnken response surface methodology. The changes of learning and memorizing ability were tested with Morris water maze. Results:The optimum preparation conditions of the lobetyolin andcodonopsispilosulapolysaccharide were as follows:ultrasonic time was 32 min,extraction temperature was 52 ℃,solid to liquid ratio was 1∶27. Under these conditions,the transfer rates of lobetyolin andcodonopsispilosulapolysaccharide were(5.18±0.22)μg/g and 2.07%±0.15%. Shenmaixingnaofang could improve the damage of learning and memory by D-gal and NaNO2. Conclusion:The optimum preparation conditions of the lobetyolin andcodonopsispilosulapolysaccharide had been optimized by the response surface method,which could help to enhance the stability of the process. All the treatment groups diagnosed with Shenmaixingnaofang could improve the abilities of learning and memory in mice models.

response surface;Shenmaixingnaofang;extraction technology;morris water maze

2016-01-06

馮彬彬(1970-)，女，博士，副教授，研究方向：中藥資源的開發(fā)利用， E-mail：fengbin1024@sina.com。

張建海(1968-)，男，碩士，教授，研究方向：藥用植物栽培及有效成分分析， E-mail：zhjh200596@126.com。

重慶市教委自然科學(xué)項目(KJ1402508)；校級橫向課題。

TS201.1

B

1002-0306(2016)16-0248-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.041