李斯特菌噬菌體裂解酶CBD蛋白的克隆與表達(dá)

葛懷娜,劉珊娜,劉金福,范志華

(1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)院學(xué)院,天津 300384;2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384)

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李斯特菌噬菌體裂解酶CBD蛋白的克隆與表達(dá)

葛懷娜1,2,劉珊娜2,*,劉金福2,范志華2

(1.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)院學(xué)院,天津 300384;2.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,天津 300384)

單核細(xì)胞增生李斯特菌噬菌體的裂解酶中細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)能夠特異識別李斯特菌細(xì)胞。本研究將CBDP40基因擴(kuò)增后插入pET32a(+)載體,導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),獲得重組菌株,并對其進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),分析重組蛋白的活性。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)表明,經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的重組大腸桿菌BL21(DE3)在38 ku處有明顯誘導(dǎo)條帶,與預(yù)期蛋白分子量相符。經(jīng)過超聲細(xì)胞破碎,重組蛋白CBDP40分布在上清液中,通過鎳離子螯合親和層析純化重組蛋白，洗脫后的蛋白濃度為0.908 mg/mL。經(jīng)菌體結(jié)合和間接ELISA驗(yàn)證,重組蛋白CBDP40具有生物學(xué)活性,即對李斯特菌具有識別功能。CBD蛋白的重組表達(dá)、純化及其活性驗(yàn)證,為深入研究裂解酶的理化性質(zhì)和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

單核細(xì)胞增生李斯特菌,噬菌體裂解酶,基因表達(dá),親和層析

李斯特菌(Listeria)是一種分布廣泛的胞內(nèi)寄生革蘭氏陽性短桿菌,共分7個種[1],包括單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、伊氏李斯特菌(L.ivanoyii)、無害李斯特菌(L.innocua又名英洛克李斯特菌)、韋氏李斯特菌(L.welshmei)、西爾李斯特菌(L.seeligcri)、格氏李斯特菌(L.grayi)和莫氏李斯特菌(L.murrayi)[2]。李斯特菌屬中以單核細(xì)胞增生李斯特菌致病性最強(qiáng)[3],該菌可導(dǎo)致人畜共患疾病,其致病劑量很低,在食品中存在100 cfu/g的該菌即可感染人類,并出現(xiàn)臨床癥狀。主要病癥為敗血癥、腦膜炎、單核細(xì)胞增多和胃腸炎等[4]。李斯特菌分布廣泛,且在食物中易于滋生,對嬰幼兒,老年人及免疫耐受病人致死率較高,因此該菌被世界衛(wèi)生組織列為四種主要食源性致病菌之一[5]。

噬菌體(bacteriophage or phage)是一類針對細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物具有感染作用的病毒,噬菌體只針對其固定宿主,具有高度特異性,嚴(yán)格寄生在宿主體內(nèi),對動、植物細(xì)胞沒有損害[6]。在食品領(lǐng)域利用噬菌體的特異性可以對李斯特菌的污染進(jìn)行防治。例如2006年8月美國FDA批準(zhǔn)了LMP-102TM作為抗單核細(xì)胞增生李斯特菌的抗菌劑,通過噴霧技術(shù)噴灑于即食肉類食品和禽類產(chǎn)品的表面進(jìn)行消毒,該噬菌體制劑能有效裂解170多種單核細(xì)胞增生李斯特菌[7]。此外,噬菌體也可用來對李斯特菌進(jìn)行檢測,Loessner MJ等[8]就利用報告噬菌體技術(shù),將報告基因通過噬菌體插入到目標(biāo)菌體的DNA中,報告基因隨著目標(biāo)菌體DNA的復(fù)制而表達(dá),成功地檢測出巧克力布丁、意大利奶酪、蝦等中的李斯特菌。噬菌體裂解酶(endolysin)是由噬菌體基因編碼的可高效裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的一類水解酶的總稱,能夠在增殖過程的后期裂解宿主菌的細(xì)胞壁,從而釋放子代噬菌體[9]。噬菌體裂解酶一般有2個結(jié)構(gòu)域組成,分別為氨基端的催化結(jié)構(gòu)域(Enzymatically Active Domain,EAD)和位于羧基端的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cell-wall Binding Domain,CBD)。EAD決定催化活性,CBD決定識別特異性,它們共同決定裂解酶結(jié)構(gòu)和功能的不同。對李斯特菌噬菌體裂解酶CBD進(jìn)行熒光標(biāo)記,結(jié)果表明CBD對李斯特菌菌株乃至不同血清型菌株都有非常好的特異性識別作用[10-11]。本研究對來源于李斯特菌噬菌體裂解酶的CBDP40基因進(jìn)行克隆表達(dá),得到純化的重組蛋白,并對其進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證。通過菌體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和間接ELISA,分析其效價和活性,為CBD蛋白構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)理的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌[E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)]、單增李斯特菌(L.monocytogenesCVCC 1595)、質(zhì)粒pET32a(+)均由本實(shí)驗(yàn)室保存;CBDP40基因[12]通過TA克隆保藏在pMD18-T載體中;引物由金唯智公司合成;限制性內(nèi)切酶EcoR V、XhoI和T4連接酶寶生物(大連)有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒上海生工公司;His-Trap預(yù)裝柱(5 mL)北京韋氏博慧色譜科技有限公司;Anti-His tag抗體北京華大公司;質(zhì)粒小提試劑盒、重組腸激酶和異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)北京索萊寶公司;TaqDNA聚合酶和DNA marker上海生工生物公司;蛋白Marker北京鼎國昌盛公司;大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng),單增李斯特菌培養(yǎng)基采用TSB-YE培養(yǎng)基。

PCR擴(kuò)增儀、蛋白質(zhì)電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)Bio-Rad公司;Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;ELx800型酶標(biāo)儀BioTek公司;核酸電泳儀北京六一公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1pET32a(+)-CBDP40表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建以含有CBDP40序列質(zhì)粒為模板,引物序列為:CBDP40-F:5′-AATGGGATATCGGTAAACCGTCTACA-3′,CBDP40-R:5′-AGGCGCTCGA TTATTTAACTCTAATTTT-3′。使用taq DNA聚合酶,先以溫度梯度法擴(kuò)增目的基因,退火溫度設(shè)定為53、53.8、54.6、56.1、57.3 ℃。確定最佳退火溫度后,以最佳退火溫度擴(kuò)增目的基因?；厥漳康钠闻cpET32a(+)載體使用限制性內(nèi)切酶EcoR V和XhoI雙酶切,經(jīng)T4連接酶連接后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α中,挑取氨芐青霉素抗性LB平板(氨芐青霉素終濃度100 μg/mL)培養(yǎng),挑取抗性平板上長出的單菌落,菌落PCR、質(zhì)粒PCR篩選轉(zhuǎn)化子。獲得陽性克隆轉(zhuǎn)化子送至北京金唯智公司測序鑒定。將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中,重組子命名為BL21/pET32a(+)-CBDP40。

1.2.2pET32a(+)-CBDP40的誘導(dǎo)表達(dá)、純化、菌體結(jié)合及Western Blot鑒定從轉(zhuǎn)化的平板上挑取含有pET32a(+)-CBDP40表達(dá)質(zhì)粒的克隆接種至LB培養(yǎng)基中(氨芐青霉素終濃度100 μg/mL);37 ℃培養(yǎng)12 h后以1%(v/v)轉(zhuǎn)接于新鮮的LB(氨芐霉素終濃度100 μg/mL)培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)至OD600 nm達(dá)到0.6時加入IPTG(終濃度0.1 mmol/L)誘導(dǎo);繼續(xù)培養(yǎng)3 h后離心收集菌體。使用細(xì)胞破碎儀破碎菌體(3 s破碎,5 s停頓,25 min),上清液過濾后經(jīng)鎳離子螯合親和層析純化,以1 mL/min的速度洗脫,收集10、20、50、100、200 mmol/L咪唑濃度的洗脫液,SDS-PAGE檢測純化情況。采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度。將重組蛋白與已滅活的李斯特菌1∶1混合,37 ℃孵育20 min,0.1 mol/L PBS洗滌3次,進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。各樣品在SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,使用anti-His tag抗體孵育進(jìn)行Western Blot檢測。

1.2.3ELISA法測定蛋白效價用0.1 mol/L的碳酸鹽緩沖液作為包被緩沖液,包被4 ℃過夜后甲醇滅活菌體;洗滌后5% BSA 37 ℃封閉1 h;洗滌后加入重組蛋白,37 ℃溫箱孵育1 h;洗滌后每孔加入anti-His tag 37 ℃孵育0.5 h;洗滌后加入HRP-羊抗鼠IgG 37 ℃孵育0.5 h;洗滌后每孔加新鮮配制的顯色液室溫反應(yīng)15 min;最后每孔加終止液,15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測OD450 nm值。每塊板設(shè)空白對照孔、陰性對照孔和陽性對照孔,以(待測孔的OD值-空白對照孔OD值)大于或等于(陰性對照孔OD值-空白對照孔OD值)的2.1倍者,即P/N大于或等于2.1,判定為陽性結(jié)果。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個處理重復(fù)三次,采用Image Lab軟件進(jìn)行分析,應(yīng)用WPS表格作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1pET32a(+)-CBDP40表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是實(shí)驗(yàn)室常用的基因表達(dá)系統(tǒng),該表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚、目的基因的表達(dá)水平高,同時又具備培養(yǎng)周期短、抗污染能力強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)[13]。pET系列載體是大腸桿菌表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng),本文所選用的pET-32a(+)載體屬于其中高效表達(dá)載體的一種。溫度梯度核酸電泳結(jié)果(圖1)顯示擴(kuò)增片段大小與預(yù)計大小(500 bp左右)一致,在56.1 ℃條帶亮度最佳,選定最佳退火溫度,批量擴(kuò)增并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行目的片段回收。對回收產(chǎn)物和pET32a(+)載體進(jìn)行限制性內(nèi)切酶EcoR V和XhoI雙酶切,T4連接酶連接后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α,通過菌落PCR和質(zhì)粒PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序。測序結(jié)果顯示插入的外源基因與NCBI中CBDP40基因序列(Accession number EU855793)完全相同,pET32a(+)-CBDP40表達(dá)載體已成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。

圖1　目的基因PCR擴(kuò)增Fig.l　PCR amplification of target CBDP40 gene注:M:DNA Marker;1:53 ℃擴(kuò)增產(chǎn)物;2:53.8 ℃擴(kuò)增產(chǎn)物;3:54.6 ℃擴(kuò)增產(chǎn)物;4:56.1 ℃擴(kuò)增產(chǎn)物;5:57.3 ℃擴(kuò)增產(chǎn)物;6:水做模板的陰性對照。

2.2pET32a(+)-CBDP40的誘導(dǎo)表達(dá)、純化、菌體結(jié)合及Western Blot鑒定

SDS-PAGE分析表明,重組菌在30 ℃、IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L時有明顯誘導(dǎo)條帶,分子量在38 ku附近,其分子量與理論大小相符(圖2)。Image Lab軟件分析顯示誘導(dǎo)蛋白占總蛋白量27.6%。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)量并無明顯影響,由于IPTG具有細(xì)胞毒性,高濃度的IPTG不利于菌體的生長和蛋白量的提高[14]。因此,選擇0.1 mmol/L的終濃度為最佳誘導(dǎo)濃度。本實(shí)驗(yàn)采用的pET32a(+)載體中編碼了His-tag基因序列,便于后期對重組蛋白進(jìn)行純化。梯度洗脫的電泳結(jié)果表明,目的蛋白主要存在于100 mmol/L咪唑洗脫組分中,占總蛋白量68.5%,此濃度咪唑洗脫的蛋白濃度為0.908 mg/mL(圖3)。將純化后的重組蛋白以及李斯特菌菌體結(jié)合樣品進(jìn)行 Western Blot(anti-His tag抗體作為一抗)分析,結(jié)果表明蛋白正確表達(dá),且能與李斯特菌結(jié)合(圖4)。

圖2　CBDP40重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)電泳結(jié)果圖Fig.2　Expression of recombinant CBDP40注:M:蛋白Marker;1:未誘導(dǎo)全菌;2:誘導(dǎo)全菌;3:誘導(dǎo)后破碎上清;4:誘導(dǎo)后破碎沉淀。

圖3　CBDP40重組蛋白梯度純化電泳結(jié)果圖Fig.3　Gradient purification of recombinant CBDP40注:M:蛋白Marker;1:未誘導(dǎo)全菌;2:誘導(dǎo)全菌;3:10 mmol/L咪唑處洗脫結(jié)果;4:20 mmol/L咪唑處洗脫結(jié)果;5:50 mmol/L咪唑處洗脫結(jié)果;6:100 mmol/L咪唑處洗脫結(jié)果;7:200 mmol/L咪唑處洗脫結(jié)果;Dye:僅含染料,蛋白分子量為0。

圖4　CBDP40重組蛋白的Western Blot 鑒定結(jié)果圖Fig.4　Western Blot identification of recombinant CBDP40注:1:誘導(dǎo)全菌;2:誘導(dǎo)后破碎上清;3:誘導(dǎo)后破碎沉淀;4:100 mmol/L咪唑處洗脫結(jié)果;5:滅活李斯特菌;6:滅活李斯特菌與重組蛋白樣品。

2.3重組蛋白CBDP40 ELISA的測定結(jié)果

采用間接ELISA法對重組蛋白CBDP40的效價進(jìn)行測定,結(jié)果如表1所示。CBDP40、CBDP40(1∶1稀釋)的P/N值均大于2.1,判定為陽性結(jié)果,證明對CBD蛋白進(jìn)行異源表達(dá)具有可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組蛋白CBDP40與李斯特菌發(fā)生特異性結(jié)合,證明對CBD蛋白進(jìn)行異源表達(dá)具有可行性。安慧婷[9]通過構(gòu)建增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)表達(dá)菌株,結(jié)合共聚焦顯微鏡驗(yàn)證了CBD區(qū)域的特異結(jié)合功能。本實(shí)驗(yàn)通過對表達(dá)出的蛋白進(jìn)行ELISA效價活性檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性,以更簡便、快捷、直觀的方法驗(yàn)證了CBD蛋白的結(jié)合特性。

表1　CBDP40重組蛋白 的ELISA分析結(jié)果

注:+代表陽性。

3　討論與結(jié)論

本研究選用pET32a(+)原核表達(dá)載體,構(gòu)建了pET32a(+)-CBDP40重組質(zhì)粒,將其導(dǎo)入E.coliBL21(DE3)中,使用IPTG作為誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)表達(dá)成功,經(jīng)過細(xì)胞破碎,鎳離子螯合親和層析對其菌體蛋白進(jìn)行純化,得到了水溶性蛋白,蛋白濃度為0.908 mg/mL,成功實(shí)現(xiàn)了CBDP40蛋白的高效可溶性表達(dá)。對表達(dá)出的蛋白進(jìn)行ELISA效價活性檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈陽性,Western Blot也證實(shí)其可與單核細(xì)胞增生李斯特菌結(jié)合,即經(jīng)過異源重組表達(dá)的蛋白對李斯特菌具有生物學(xué)活性。國外已有關(guān)于單增李斯特菌噬菌體裂解酶的研究報道,且體外裂解效果良好[11-12]。噬菌體裂解酶作為一種新型殺菌劑具有高效性、特異性、安全性等優(yōu)點(diǎn)。李斯特菌噬菌體裂解酶CBD蛋白的成功克隆、表達(dá)和純化將有利于揭示噬菌體裂解酶的作用機(jī)制,為李斯特菌的快速檢測和診斷提供新的思路和途徑。

[1]Laksanalamai P,Steyert S R,Burall L S,et al. Genome sequences ofListeriamonocytogenesserotype 4b variant strains isolated from clinical and environmental sources[J]. Genome Announcements,doi:10.1128/genomeA.00771-13.

[2]馮可,胡文中,姜愛麗,等. 單核細(xì)胞增生性李斯特菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2014(4):392-396.

[3]王燕春,董麗,于慧霞.關(guān)于單核細(xì)胞增生李斯特菌的探討和研究[J]. 醫(yī)學(xué)動物防制,2012,28(10):1175-1177.

[5]Barbosa J,Borges S,Camilo R,et al. Biofilm formation among clinical and food isolates ofListeriamonocytogenes[J]. International Journal of Microbiology,2013:5245-5756.

[6]Potase C. Phage renaissance:new hope against antibiotic resistance[J]. Environmental Health Perspectives,2013,121(2):

48-53.

[7]FDA. Approval ofListeria-specific bacteriophage preparation on ready-to-eat(RTE)meat and poultry products. CFSAN/Office of Food Additive Safety[R]. FDA August 24 2006.

[8]Loessner M J,Rudolf M,Scherer S. Evaluation of luciferase reporter bacteriophage A511:luxAB for detection ofListeriamonocytogenesin contaminated foods[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997,63(8):2961-2965.

[9]安慧婷. 單增李斯特菌溶源性噬菌體的分離鑒定及部分基因功能研究[D]. 上海:上海交通大學(xué),2014.

[10]Loessner M J,Kramer K,Ebel F,et al. C-terminal domains ofListeriamonocytogenesbacteriophage murein hydrolases determine specific recognition and high-affinity binding to bacterial cell wall carbohydrates[J]. Molecular Microbiology,2002,44:335-349.

[11]Smartt A E,Tingting X,Patricia J,et al. Pathogen detection using engineered bacteriophages[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry,2012,402:3127-3146.

[12]Mathias S,Tatiana S,Eugster M R,et al. Rapid multiplex detection and differentiation ofListeriacells by use of fluorescent phage endolysin cell wall binding domains[J]. Applied and Environmental Microbiology,2010(9):5745-5756.

[13]Dea S,Gagnon C A,Mardassi H,et al. Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus:comparison of the North American and European isolates[J]. Archives of Virology,2000,145(4):659-688.

[14]鄒運(yùn)明,馬武龍,高慎陽,等. IPTG誘導(dǎo)濃度對重組李氏溶血素表達(dá)的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,37(2):199-201.

Cloning and expression ofListeriaphage endolysin CBD protein

GE Huai-na1,2,LIU Shan-na2,*,LIU Jin-fu2,FAN Zhi-hua2

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China;2.College of Food Science and Bioengineering,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China)

Listeriamonocytogenesphage endolysin cell-wall binding domain(CBD)can specifically recognizeListeriacells. The amplifiedCBDP40 gene was inserted into vector pET32a(+)and introduced intoEscherichiacoliexpression system in order to obtain the recombinant strain. The recombinant cells were induced with IPTG and the recombinant protein was analysed for its activity. An evident induced protein band at 38 ku was observed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)after 0.1 mmol/L IPTG induction,which was in accord with the expected molecular weight. Recombinant protein CBDP40 was obtained in the supernatant after cell sonification and purified by nickel-chelating affinity chromatography with the yield of 0.908 mg/mL in the elute. The results of cell binding assay and indirect ELISA showed that CBDP40 had biological activity with the function ofListeriaidentification. Recombinant expression,purification and activity determination of CBD may lay the foundation for further studying the physico-chemical properties and mechanism of endolysin.

Listeriamonocytogenes;endolysin;gene expression;affinity chromatography

2016-02-22

葛懷娜(1990-),女,碩士研究生,研究方向:動物性食品生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制,E-mail:345086504@qq.com。

劉珊娜(1984-),女,博士,講師,研究方向:食品微生物,E-mail:shannaliu@tjau.edu.cn。

天津市科技支撐計劃項目(14ZCZDNC00003)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0234-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.038