米曲霉A-F04的β-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆鑒定及其生物信息學(xué)分析

高　斌,李　棒,李　婭,李　斌,劉成梅,付桂明,*

(1.南昌大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué),中德食品工程中心,江西南昌 330047;3.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌330031)

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米曲霉A-F04的β-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆鑒定及其生物信息學(xué)分析

高斌1,2,3,李棒3,李婭3,李斌1,2,3,劉成梅1,2,3,付桂明1,2,3,*

(1.南昌大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047;2.南昌大學(xué),中德食品工程中心,江西南昌 330047;3.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌330031)

以實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的高產(chǎn)β-果糖基轉(zhuǎn)移酶(β-fructosyltransferase,β-FTase)的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株A-F04出發(fā),提取米曲霉A-F04基因組DNA和RNA,采用PCR和RT-PCR技術(shù)克隆β-FTase基因,得到β-FTase基因完整編碼序列和內(nèi)含子序列,利用重組技術(shù)構(gòu)建β-果糖基轉(zhuǎn)移酶質(zhì)?；驇?并構(gòu)建基因的進(jìn)化樹,預(yù)測(cè)β-FTase分子量、等電點(diǎn)、氨基酸組成等物化性質(zhì),預(yù)測(cè)其N-糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽,運(yùn)用SWISS-MODEL對(duì)β-FTase的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示,成功鑒定出菌株A-F04具有β-FTase基因;菌株A-F04的β-FTase基因編碼區(qū)長度為1630 bp,含有一個(gè)52 bp的內(nèi)含子,位于173 bp與224 bp之間;編碼序列的開放閱讀框總長為1578 bp;軟件分析得知β-FTase為親水性的穩(wěn)定蛋白,其分子量為57.4653 ku,理論等電點(diǎn)為4.83,由525個(gè)氨基酸組成;可能的N-糖基化位點(diǎn)有6處;信號(hào)肽分析軟件得知其編碼的1～17位置處的氨基酸為信號(hào)肽;SWISS-MODEL構(gòu)建的3個(gè)模型質(zhì)量較高,有利于后期對(duì)β-FTase的結(jié)構(gòu)和功能的研究。

米曲霉A-F04,β-果糖基轉(zhuǎn)移酶,基因鑒定,生物信息學(xué)分析

β-果糖基轉(zhuǎn)移酶(β-fructosyltransferase,β-FTase,EC 2.4.1.9)能以蔗糖為反應(yīng)底物,催化合成低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)[1-2]。FOS對(duì)改善腸道功能、防治便秘和腹瀉、提高免疫力、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等具有特殊的生理功效,在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用市場(chǎng)巨大。在自然條件下,主要從植物中獲取FOS,此種方法較為困難,且產(chǎn)量少,工業(yè)上主要用β-FTase酶來催化合成FOS[3-7]。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),含有β-FTase基因的微生物包括黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、青霉屬(Penicillium)及屈芽短梗菌(Aureobasidiumpullulans)等,其中米曲霉分泌和表達(dá)β-FTase能力較強(qiáng),且具有極高的食品安全性,被美國FDA 認(rèn)證為GRAS的菌種之一。2005年日本科學(xué)家[8]完成了米曲霉基因組測(cè)序工作,這為基因工程選育米曲霉β-FTase高效表達(dá)菌株奠定了基礎(chǔ)。目前,對(duì)米曲霉的β-FTase基因研究已成為國內(nèi)外熱點(diǎn)。王玉海[9]等把一株原始米曲霉菌株的β-FTase基因進(jìn)行了克隆并進(jìn)行了外源表達(dá),對(duì)于米曲霉的β-FTase基因尚未進(jìn)行信號(hào)肽、N-糖基化位點(diǎn)等生物信息分析;國外對(duì)米曲霉產(chǎn)β-FTase的研究主要集中在發(fā)酵條件優(yōu)化方面[10],在生物信息學(xué)分析和外源表達(dá)方面較少。本實(shí)驗(yàn)以前期篩選出的高產(chǎn)β-FTase的米曲霉A-F04為出發(fā)菌株,采用PCR和RT-PCR技術(shù)克隆[11]出β-FTase的基因,通過基因測(cè)序手段和DNA man軟件分析獲取得到β-FTase的DNA序列、RNA序列和內(nèi)含子序列。以此為基礎(chǔ),對(duì)β-FTase基因的生物信息學(xué)進(jìn)行分析,探究信號(hào)肽位置、構(gòu)建生物進(jìn)化樹,預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)的物化性質(zhì)、蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域,并進(jìn)行氨基酸疏水性分析和同源模型的構(gòu)建。以期為深入研究米曲霉A-F04表達(dá)β-FTase及其原核或真核的外源表達(dá)奠定良好的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

米曲霉(Aspergillusoryzae)A-F04南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏;大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α(含pPIC9K質(zhì)粒)中山大學(xué)贈(zèng)送;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α南昌大學(xué)中德食品工程中心保藏;PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200 g,加800 mL蒸餾水煮沸后雙層紗布過濾,取濾液,葡萄糖20 g,固體另加1.5%(m/v)的瓊脂,蒸餾水定容至1 L,自然pH;發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基酵母粉1.5 g,(NH4)2SO41.5 g,蔗糖4 g,NaCl 2 g,固體另加1.5%(m/v)的瓊脂,蒸餾水定容至1 L,pH7.0;LB培養(yǎng)基酵母粉5 g,胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,固體另加1.5%(m/v)的瓊脂,蒸餾水定容至1 L,pH調(diào)至7.0;酵母粉阿拉丁試劑,BR純度;瓊脂粉上海山浦,BR純度;胰蛋白胨北京奧博星;乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液北京百浩;PCR產(chǎn)物柱純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、dNTP、DNA Marker、SnabⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶大連Takara寶生物;AGAROSE G-10法國Biowest;GoldView北京博凌科為;T4DNA連接酶NEB;RNase酶、RNA提取試劑盒(批號(hào)DP432)和cDNA第一鏈合成試劑盒(批號(hào)M1125)、氨芐青霉素北京天根;(NH4)2SO4、氯化鈉、蔗糖、NaCl、SDS等國產(chǎn)分析純。

BA410光學(xué)顯微鏡Phenix;HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ZDX-35BI型座式蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;2720 Thermal Cycler美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;Thermo cell Cooling & Heating Block杭州博日科技有限公司;DYY-8C型電泳儀、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽北京市六一儀器廠;TGL-16B型高速離心機(jī)、NanaDrop 2000超微量分光光度計(jì)美國熱電;凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株A-F04形態(tài)學(xué)鑒定取用PDA斜面保藏的菌株A-F04在35 ℃(通過實(shí)驗(yàn)室前期探究,在此溫度下米曲霉A-F04生長速度適宜和菌絲體均勻)活化2～3 h后,在發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基平板上劃線,35 ℃,恒溫恒濕培養(yǎng)2～7 d,觀察菌株A-F04菌落、孢子菌絲體形態(tài),35 ℃，200 r/min進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),觀察米曲霉A-F04菌球。挑取單菌落孢子,乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液染色后制片,進(jìn)行鏡檢。

1.2.2菌株A-F04的β-FTase基因鑒定

1.2.2.1孢子懸浮液制備配制固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min,分裝試管冷卻后制成斜面?zhèn)溆?。用接種環(huán)接種菌株A-F04孢子,斜面劃線,35 ℃恒溫恒濕靜置培養(yǎng)72 h后,用滅菌生理鹽水洗脫斜面,制備菌株A-F04的孢子懸浮液,孢子懸浮液倒入100 mL含有滅菌玻璃珠的三角瓶中,充分搖勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.2.2米曲霉基因組提取、純化及質(zhì)量鑒定接種1%的米曲霉A-F04孢子懸浮液于液體發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中,在35 ℃,200 r/min培養(yǎng)96 h后,無菌條件下真空抽濾獲取菌絲體,液氮預(yù)冷研磨。米曲霉基因組的DNA提取采用SDS法;總RNA提取方法參照TIANGEN公司總RNA提取試劑盒步驟;參照TIANGEN公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。用NanaDrop 2000超微量分光光度計(jì)對(duì)提取的米曲霉菌株A-F04的DNA和RNA進(jìn)行檢測(cè),DNA和RNA樣品的A260/A280比值在1.8～2.0之間,則表示樣品中蛋白和酚類物質(zhì)污染少,DNA和RNA樣品的A260/A230比值大于2.0,則表明樣品中碳水化物和鹽物質(zhì)污染少,提取的DNA和RNA較純凈,達(dá)到PCR擴(kuò)增研究要求[12]。

隨著幼兒年齡的不斷增長，其閱讀的書籍也會(huì)隨之深入和量增，通過閱讀不同的書籍，從而產(chǎn)生不同的閱讀興趣，實(shí)現(xiàn)幼兒全面發(fā)展能力的提高。因此，綜上所述，在學(xué)生幼兒時(shí)期，運(yùn)用恰當(dāng)?shù)膶?shí)踐策略培養(yǎng)幼兒良好的閱讀習(xí)慣對(duì)于促進(jìn)幼兒各方面發(fā)展來說，具有重要的意義。

電泳壓力設(shè)定為100 V,電泳時(shí)間為35 min,采用1.2 %瓊脂糖凝膠[12]對(duì)核酸樣品進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析。

1.2.2.3引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的米曲霉AspergillusoryzaeN74[13]生物合成β-果糖基轉(zhuǎn)移酶的基因序列(登錄號(hào):GU145136),可知,β-FTase編碼區(qū)基因包括兩端的2個(gè)外顯子和中間的1個(gè)內(nèi)含子,結(jié)合質(zhì)粒pPIC9K的酶切位點(diǎn)和引物設(shè)計(jì)原則,分析設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性擴(kuò)增引物和1對(duì)AOX1基因的通用引物,引物的序列、酶切位點(diǎn)(SnabⅠ和NotⅠ)和保護(hù)堿基如表1(引物交由華大基因科技服務(wù)有限公司合成)。

表1　PCR擴(kuò)增引物

表2　PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件

1.2.2.4編碼區(qū)和編碼序列的克隆對(duì)于編碼區(qū)序列,以基因組DNA為模板,P1和P2為引物進(jìn)行PCR;對(duì)于編碼序列,以基因組RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板,P1和P2為引物進(jìn)行PCR。其PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件見表2。PCR產(chǎn)物送至華大基因反復(fù)測(cè)序,得到編碼區(qū)序列和編碼序列。運(yùn)用DNA man軟件,測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的米曲霉N74β-FTase基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì),進(jìn)行同源和差異性分析。

1.2.2.5米曲霉A-F04的β-FTase的載體基因庫的構(gòu)建為方便后續(xù)對(duì)β-FTase基因的研究,柱純化編碼序列的PCR產(chǎn)物,提取大腸桿菌DH5α-pPIC9K的質(zhì)粒pPIC9K,用SnabⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切后分別進(jìn)行電泳。用瓊脂糖回收試劑盒對(duì)電泳條帶進(jìn)行切膠回收純化,純化后分別用NanaDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)酶切后的pPIC9K和PCR產(chǎn)物的量,按照PCR產(chǎn)物量(mol)∶pPIC9K量(mol)=3∶1～6∶1配制酶連反應(yīng)體系。制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)[12],將連接產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化。使用氨芐青霉素抗性培養(yǎng),篩選陽性基因庫克隆子DH5α(pPIC9K-FTase),陽性克隆子DH5α(pPIC9K-FTase)用5′AOX1和3′AOX1通用引物進(jìn)行菌液PCR進(jìn)一步驗(yàn)證,電泳條帶切膠回收后送至華大基因反復(fù)測(cè)序進(jìn)行最終確認(rèn)。

1.2.3菌株A-F04的β-FTae基因的生物信息學(xué)分析在NCBI里檢索β-FTase基因序列,運(yùn)用MEGA 5.10工具對(duì)來源不同的菌種的β-FTase蛋白進(jìn)行同源性分析,構(gòu)建進(jìn)化樹。根據(jù)菌株 A-F04的β-FTase測(cè)序結(jié)果,運(yùn)用ExPASy中的ProtParam tool分析蛋白質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì),分析預(yù)測(cè)其分子量、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成、帶正負(fù)電荷的殘基數(shù)、分子元素和不穩(wěn)定系數(shù)。運(yùn)用美國CBS的TMHMM Server v. 2.0預(yù)測(cè)并分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。運(yùn)用ExPASy的ProtScale工具對(duì)β-FTase氨基酸序列進(jìn)行疏水性分析。運(yùn)用Signal P對(duì)β-FTase信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。運(yùn)用NetNGlyc 1.0 Server對(duì)Β-FTase進(jìn)行N-糖基化預(yù)測(cè)。運(yùn)用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL進(jìn)行β-FTase三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株A-F04形態(tài)學(xué)分析

菌株A-F04斜面培養(yǎng)初期1～2 d呈淺黃色,第3 d菌絲呈黃綠色,繼續(xù)培養(yǎng)菌體將逐漸變?yōu)樯罹G色,取培養(yǎng)了72 h的菌株A-F04示例,其斜面孢子形態(tài)如圖1A。對(duì)培養(yǎng)72 h的菌株A-F04孢子進(jìn)行沖洗,用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液染色后制片,進(jìn)行鏡檢,1000倍顯微鏡下可清晰地分辨出分生孢子、頂囊、分生孢子梗和足細(xì)胞等曲霉屬結(jié)構(gòu),如圖1B。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)菌株A-F04,菌球大小均在0.1～2.0 cm之間,其菌球形態(tài)如圖1C所示,菌球表面有米曲霉特征的刺突結(jié)構(gòu)。

圖1　A-F04菌體形態(tài)Fig.1　Morphology of A.oryzae A-F04注:A斜面孢子絲;B染色的孢子絲;C搖瓶培養(yǎng)菌球。

圖4　編碼序列PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與A.oryzae N74 FTase序列對(duì)比Fig.4　Comparison of CDS PCR products and A.oryzae N74 FTase sequence

2.2.1DNA和RNA質(zhì)量鑒定用NanaDrop 2000檢測(cè)DNA和RNA樣品,結(jié)果顯示菌株A-F04的DNA樣品濃度為(543.1±3.4) ng/μL,RNA樣品濃度(127.9±1.7) ng/μL,A260/A280在1.8～2.0之間,A260/A230大于2.0,達(dá)到PCR擴(kuò)增研究要求。對(duì)總RNA進(jìn)行電泳,如圖2所示,泳道1條帶清晰明亮,28 S條帶亮度為18 S條帶亮度的2倍左右,可知RNA質(zhì)量良好。以此總RNA為模板,合成cDNA文庫,步驟參照cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進(jìn)行。

圖2　菌株A-F04總RNA電泳圖Fig.2　Agarose gel electrophoresis of A.oryzae A-F04 RNA

2.2.2編碼區(qū)和編碼序列的克隆分析以菌株A-F04的DNA和cDNA為模板,P1和P2為引物進(jìn)行PCR,克隆β-FTase的編碼區(qū)和編碼序列,電泳結(jié)果如圖3所示。泳道2為以DNA為模板的β-FTase基因編碼區(qū)的條帶,泳道1是以cDNA為模板的β-FTase基因編碼序列條帶,泳道2處條帶約1630 bp,泳道1處條帶約為1578 bp,符合預(yù)期。

圖3　菌株A-F04的β-FTase基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3　β-FTase gene PCR products from A-F04 strain注:泳道1為以cDNA為模板β-FTase基因的PCR產(chǎn)物,泳道2為以DNA為模板PCR產(chǎn)物。

2.2.3PCR產(chǎn)物測(cè)序和BLAST比對(duì)鑒定取編碼區(qū)和編碼序列的PCR產(chǎn)物,根據(jù)華大基因反饋的測(cè)序結(jié)果,減去引物和保護(hù)堿基的長度即為米曲霉β-FTase基因的長度。對(duì)比DNA和cDNA的PCR產(chǎn)物的長度,可知米曲霉A-F04的編碼區(qū)長度為1630 bp,編碼序列長度為1578 bp,在位置為173～224 bp之間含有一個(gè)長度為52 bp的內(nèi)含子,將其序列與AspergillusOryzaeN74 FTase 的mRNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì),如圖4,分析可知其同源性為100%,未發(fā)現(xiàn)堿基突變,成功鑒定本實(shí)驗(yàn)中米曲霉A-F04菌株具有β-FTase基因。

2.2.4pPIC9K-β-FTase載體基因庫的構(gòu)建SnabⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切質(zhì)粒pPIC9K和純化后的編碼序列PCR產(chǎn)物,電泳如圖5所示,圖5-A泳道1為雙酶切后的質(zhì)粒pPIC9K,大小為9000 bp左右,符合預(yù)期,圖5-B泳道1為雙酶切后的編碼序列PCR產(chǎn)物,大小為1570 bp左右,符合預(yù)期。

圖5　質(zhì)粒pPIC9K雙酶切(A)及編碼序列PCR產(chǎn)物雙酶切(B)Fig.5　Electrophoretogram of pPIC9K after double enzyme digestion(A),Electrophoretogram of PCR product after double enzyme digestion(B)

用T4DNA連接酶并成功轉(zhuǎn)入至大腸桿菌DH5α,在含有氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選,用5′AOX1和3′AOX1通用引物進(jìn)行陽性重組子菌液PCR初步驗(yàn)證,進(jìn)行電泳,如圖6所示,泳道1條帶為1900 bp左右,符合預(yù)期。

圖6　重組菌菌液PCR驗(yàn)證電泳Fig.6　Electrophoretogram of recombinantE.coli-pPIC9K-FTase PCR products

提取重組菌的質(zhì)粒,用SnabⅠ和NotⅠ酶進(jìn)行雙酶切,酶切后進(jìn)行電泳,如圖7所示,條帶有2條,分別在9000 bp和1570 bp左右位置,符合質(zhì)粒pPIC9K-FTase的大小要求,進(jìn)一步驗(yàn)證了重組菌為陽性。

圖7　重組質(zhì)粒pPIC9K-FTase雙酶切驗(yàn)證Fig.7　Double enzymes digestion of recombinant plasmid pPIC9K-FTase

PCR菌液測(cè)序所得的序列與FTase基因在DNA man軟件上比對(duì)結(jié)果顯示一致,最終確認(rèn)pPIC9K-FTase載體基因庫構(gòu)建成功。

2.3菌株A-F04的β-FTae基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1同源進(jìn)化樹分析在NCBI檢索到產(chǎn)FTase菌有放線菌(Actinomycesnaeslundii)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、曲霉(AspergillusruberCBS135680)、聚多曲霉(Aspergillussydowii)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)、Phleumpratense、酵母菌(Schwanniomycesoccidentalis)和鏈球菌(Streptococcusmutans)等。運(yùn)用MEGA 5.10進(jìn)行這些菌的同源性分析和進(jìn)化樹構(gòu)建,如圖8所示,米曲霉的β-FTase基因在進(jìn)化樹上的位置處于酵母菌和細(xì)菌的β-FTase基因之間,合成β-FTase的米曲霉與同屬曲霉的紅曲霉親源較近,與酵母菌次之。除了以上微生物具有β-FTase基因,其他合成β-FTase的物種均屬于植物。

圖8　產(chǎn)β-FTase菌系同源性和統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8　Homology and phylogenetic tree of β-FTase-producing strains

2.3.2物化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析運(yùn)用ExPASy 中的ProtParam tool工具預(yù)測(cè)β-FTase理化性質(zhì),可知β-FTase分子量為57.4653 ku,理論等電點(diǎn)為4.83,由525個(gè)氨基酸組成(6.9% Ala、6.9% Arg、5.1% Asn、6.3% Asp、0.2% Cys、3.8% Gln、4.0% Glu、8.8% Gly、2.5% His、3.8% Ile、5.7% Leu、3.2% Lys、1.0% Met、6.9% Phe、5.9% Pro、10.7% Ser、8.4% Thr、2.5% Trp、4.0% Tyr、7.8% Val),帶正電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)數(shù)為54個(gè),帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)為31個(gè)。FTase分子元素組成為C2597H3834N670O802S6,其不穩(wěn)定指數(shù)為34.37,可知FTase為穩(wěn)定蛋白。

2.3.3結(jié)構(gòu)和性質(zhì)預(yù)測(cè)分析運(yùn)用TMHMM Server v.2.0 分析蛋白序列跨膜區(qū)分析得知,FTase是膜外蛋白,沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用ExPASy的ProtScale分析FTase親疏水性,可知FTase脂溶指數(shù)為66.65、總平均親水性為-0.292,可知FTase為親水性蛋白。

運(yùn)用Signal P預(yù)測(cè)β-FTase的信號(hào)肽,如圖9所示,1～17位置處的氨基酸S值較高(每個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)1個(gè)S值,信號(hào)肽區(qū)域的S值較高);在17位置處的氨基酸C值和Y值最高,可知17位置處氨基酸為信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。

圖9　Signal P對(duì)β-FTase信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.9　Prediction of β-FTase signal peptide

運(yùn)用NetNGlyc 1.0 Server 對(duì)FTase進(jìn)行N-糖基化預(yù)測(cè),結(jié)果如圖10,可知β-FTase有6處可能性(>0.5)的N-糖基化位點(diǎn),在氨基酸位置為59和204位置處幾率最大,其次是261和399位置處,107和437位置可能性稍弱。

圖10　β-FTase N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.10　Prediction of β-FTase N-Glycosylation sites

運(yùn)用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL進(jìn)行FTase三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),預(yù)測(cè)出3種可能性結(jié)構(gòu),如圖11所示,模型A、B和C對(duì)應(yīng)的模板分別是3kf3.1.A、3u75.1.A和3kf5.1.A。模型A對(duì)應(yīng)的GMQE值和QMEAN4值分別為0.68和-7.16,模型B對(duì)應(yīng)的GMQE值和QMEAN4值分別為0.68和-7.15,模型C對(duì)應(yīng)的GMQE值和QMEAN4值分別為0.68和-8.86,構(gòu)建的3個(gè)模型的GMQE(全球性模型質(zhì)量估測(cè))接近1,QMEAN4值小于0,評(píng)估結(jié)果表明3個(gè)模型立體結(jié)構(gòu)上合理,模型質(zhì)量較高[14-15]。通過同源模建獲得β-FTase的三維結(jié)構(gòu),有利于研究β-FTase的結(jié)構(gòu)和功能,預(yù)測(cè)其催化反應(yīng)的相互作用方式。

圖11　SWISS-MODEL同源建模預(yù)測(cè)β-FTase三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.11　Tertiary structure of β-FTaseby homology tool SWISS-MODEL

3　結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的高產(chǎn)β-FTase的米曲霉菌株A-F04為基礎(chǔ),對(duì)該米曲霉菌株進(jìn)行了β-FTase基因的克隆鑒定,成功驗(yàn)證出菌株A-F04具有β-FTase的基因。對(duì)β-FTase基因進(jìn)行了克隆,構(gòu)建了β-FTase的質(zhì)?；驇霦.coli-pPIC9k-FTase,對(duì)β-FTase基因的編碼區(qū)和編碼序列進(jìn)行了測(cè)序,成功獲取了β-FTase基因的編碼區(qū)、編碼序列和內(nèi)含子序列。對(duì)菌株A-F04的β-FTase基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,菌株A-F04的β-FTase基因編碼區(qū)長度為1630 bp,含有一個(gè)52 bp的內(nèi)含子,位于173 bp與224 bp之間;編碼序列的開放閱讀框總長為1578 bp;軟件分析得知β-FTase為親水性的穩(wěn)定蛋白,其分子量為57.4653 ku,理論等電點(diǎn)為4.83,由525個(gè)氨基酸組成;可能的N-糖基化位點(diǎn)有6處;信號(hào)肽分析軟件得知其編碼的1～17位置處的氨基酸為信號(hào)肽;SWISS-MODEL構(gòu)建的3個(gè)模型質(zhì)量較高。

本文克隆鑒定了菌株A-F04的β-FTase基因,并進(jìn)行了序列分析及基因的功能預(yù)測(cè),為深入研究該基因功能打下了良好的基礎(chǔ)。

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Cloning,identification and bioinformatics analysis ofβ-fructosyltransferase fromAspergillusoryzaeA-F04

GAO Bin1,2,3,LI Bang3,LI Ya3,LI Bin1,2,3,LIU Cheng-mei1,2,3,FU Gui-ming1,2,3,*

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Sino-German Food Engineering Center,Nanchang University,Nanchang 330047,China;3.Food Science and Technology College,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

Based on the efficient expressingAspergillusoryzaestrain A-F04,the DNA and RNA of strain A-F04 were extracted,PCR and RT-PCR strategies were used to obtainβ-FTase sequences,thus,β-FTase gene bank was constructed. Evolutionary tree was built,and physicochemical property including formula weight,isoelectric point and amino acid composition were predicted,the possible glycosylation sites were predicted. SWISS MODEL tool was used to predictβ-FTase tertiary structure. Experimental results showed thatβ-FTase gene was successfully identified in strain A-F04. Strain A-F04’s coding region was 1630 bp,including an intron,between 173 bp and 224 bp,CDS were 1578 bp. Bioinformatics analysis program analysis showed thatβ-FTase was hydrophilic stable protein,its formula weight was 57.4653 ku,isoelectric point was 4.83,composed by 525 amino acids,within 6 possible glycosylation sites. Signal P program showed that the amino acids at 1 to 17 sites were signal peptide. The tertiary structure model constructed by SWISS-MODEL contributes to theβ-FTase’s structure and function exploration.

AspergillusoryzaeA-F04;β-fructosyltransferase;gene identification;bioinformatics analysis

2015-10-26

高斌(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:82083790@qq.com。

付桂明(1972-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)、發(fā)酵工程研究,E-mail:fuguiming@ncu.edu.cn。

食品與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題(SKLF-22B-201313)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.035