Mycobacterium sp. BFZ304轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)9α-羥基雄烯二酮培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

柳相鶴,張瑞婕,趙樹欣,張保國,史吉平

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210 3.上?？萍即髮W(xué)生命學(xué)院,上海 201210)

?

Mycobacteriumsp. BFZ304轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)9α-羥基雄烯二酮培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

柳相鶴1,2,張瑞婕2,3,趙樹欣1,張保國2,*,史吉平2,3

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210 3.上海科技大學(xué)生命學(xué)院,上海 201210)

本研究以Mycobacteriumsp. BFZ304作為實驗菌株,研究了不同碳源、氮源、磷酸鹽等培養(yǎng)基成分對Mycobacteriumsp. BFZ304發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)9α-羥基雄烯二酮的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以9α-羥基雄烯二酮的產(chǎn)量為衡量指標,采用響應(yīng)面法優(yōu)化了轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的組成,并建立了玉米漿、葡萄糖、硝酸鈉、磷酸氫二銨變化的二次回歸方程,探討了各因子對9α-羥基雄烯二酮產(chǎn)量的影響。最終確定最適宜的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為葡萄糖10 g/L、玉米漿40 g/L、硝酸鈉6 g/L、磷酸氫二銨0.7 g/L。在此條件下,底物植物甾醇添加量為10 g/L時,9α-羥基雄烯二酮的產(chǎn)量可達到4.86 g/L,底物植物甾醇的轉(zhuǎn)化率比優(yōu)化前提高了近40%,具有極好的產(chǎn)業(yè)化前景。

Mycobacteriumsp. BFZ304,植物甾醇,9α-羥基雄烯二酮,響應(yīng)面

甾體藥物作為僅次于抗生素的第二大藥物,人們對其的需求量不斷增加[1-2]。目前,以生物轉(zhuǎn)化方法催化合成甾體藥物越來越受到重視,相較于傳統(tǒng)化學(xué)合成方法,生物轉(zhuǎn)化具有產(chǎn)率高、專一性強、條件較溫和且環(huán)境友好等多種優(yōu)勢,使其逐漸成為醫(yī)藥工業(yè)合成甾體藥物的先進技術(shù)手段[3-4]。9α-羥基雄烯二酮(9α-OH-AD)是一類重要的甾體醫(yī)藥中間體,利用9α-OH-AD作為前體物可以合成氫化可的松、17α-羥基黃體酮、依普利酮、β米松、地塞米松、可的松等多種重要的甾體原料藥,具有重要的商業(yè)價值[5-6]。利用分枝桿菌等微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)甾體醫(yī)藥中間體9α-OH-AD,是當下甾體醫(yī)藥工業(yè)體系的一條重要工藝路線。因此利用不同微生物轉(zhuǎn)化甾醇制備9α-OH-AD的研究逐漸成為甾體激素類行業(yè)中又一個研究熱點[7-10]。在甾體微生物轉(zhuǎn)化過程中,微生物菌株的生長與培養(yǎng)基組成密切相關(guān),培養(yǎng)基中的各種成分,對菌株的生長以及細胞內(nèi)酶的表達都具有很大的影響[11-12]。同時培養(yǎng)基成分是影響微生物甾體轉(zhuǎn)化活性的主要因素,因此對培養(yǎng)基進行優(yōu)化是提高微生物轉(zhuǎn)化甾醇生成9α-OH-AD的有效途徑。

考察培養(yǎng)基組分對產(chǎn)酶的影響通常采用的優(yōu)化手段多為單因素實驗。因其未考慮各因素之間的交互作用,故無法提供未考察區(qū)域的信息,以及進行預(yù)測和控制。響應(yīng)面法可同時對多因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價,并能快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最優(yōu)條件。近年來采用響應(yīng)面法對生物反應(yīng)過程進行優(yōu)化已有一些報道,并取得了較好的優(yōu)化結(jié)果[13-14]。

利用微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)9α-OH-AD的內(nèi)容在國內(nèi)卻鮮有報道,本文通過單因素和響應(yīng)面分析實驗優(yōu)化培養(yǎng)基成分來提高分支桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇的發(fā)酵轉(zhuǎn)化效率,本研究通過微生物轉(zhuǎn)化方法,以Mycobacteriumsp. BFZ304作為實驗菌種,植物甾醇為底物,通過單因素和響應(yīng)面分析實驗優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分來提高底物轉(zhuǎn)化效率和產(chǎn)物的得率,以期為進一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

Mycobacteriumsp. BFZ304本研究室自主篩選后鑒定保存;植物甾醇HPLC純度95%，江蘇越紅飼料有限公司;玉米漿N上海西王淀粉糖有限公司;山梨醇、牛肉膏、葡萄糖、淀粉、蛋白胨、酵母粉、甘油等有機碳氮源上海生工生物工程有限公司;(NH4)2HPO4、NaNO3、甲醇、乙酸乙酯等化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(上海)化學(xué)試劑有限公司;平板培養(yǎng)基酵母粉15 g,葡萄糖6 g,NaNO35.4 g,(NH4)2HPO40.6 g,瓊脂20 g,定容到1 L,pH7.8;種子培養(yǎng)基酵母粉15 g,葡萄糖6 g,NaNO35.4 g,(NH4)2HPO40.6 g,定容到1 L,pH7.8;初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基葡萄糖5 g,蛋白胨5 g,NaNO36 g,NaH2PO40.5 g,定容到1 L,pH7.8。

RID-10A/SPD-20A型高效液相色譜儀日本島津公司;GC-2010Plus氣相色譜儀日本島津公司;PB-10型pH計德國Sartorius;BSA 224SCW型電子天平德國Sartorius;DU730型紫外分光光度計德國Beckman;BX51型顯微鏡日本OLYMPUS;ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2微生物培養(yǎng)及初始甾體轉(zhuǎn)化條件

將實驗室保藏的Mycobacteriumsp. BFZ304用平板培養(yǎng)基活化,于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)2～3 d后挑取單克隆接種到液體種子培養(yǎng)基中,30 ℃、130 r/min搖床培養(yǎng)48 h,獲得液體種子。實驗培養(yǎng)基中接入5%的液體種子,于30 ℃、130 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h后,補加10 g/L的植物甾醇進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化,每隔12 h取樣測定相關(guān)物質(zhì)的含量。植物甾醇轉(zhuǎn)化率計算公式如下:植物甾醇轉(zhuǎn)化率(%)=(產(chǎn)物9α-OH-AD濃度/投加底物植物甾醇濃度)×100

1.3培養(yǎng)基的優(yōu)化方法

1.3.1氮源單因素實驗本研究以40 g/L的含氮水平添加玉米漿、酵母粉、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨作為氮源,其他條件不變,與以蛋白胨為主要氮源的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基作比較,實驗平行三次。

1.3.2碳源單因素實驗本研究以20 g/L的含碳水平添加山梨醇、蔗糖、甘油、乳糖、淀粉作為碳源,其他條件不變,與以葡萄糖為主要碳源的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基作比較,實驗平行三次。

1.3.3磷酸鹽單因素實驗保持其他條件不變,以10 g/L的含磷水平分別添加磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨,進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化,根據(jù)9α-OH-AD濃度的大小確定最佳的磷酸鹽,實驗平行三次。

1.3.4響應(yīng)面分析實驗方法根據(jù)單因素的實驗結(jié)果,選用葡萄糖、玉米漿、磷酸氫二銨、硝酸鈉為考察因素,采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計實驗并進行響應(yīng)面分析,設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析實驗,實驗因子和編碼水平如表1。

表1　響應(yīng)面實驗因素水平表

1.4植物甾醇及9α-OH-AD的測定方法

對于一些自身結(jié)構(gòu)中存在共軛結(jié)構(gòu)的甾體化合物,如本研究中的目的產(chǎn)物9α-OH-AD可以利用高效液相色譜檢測該化合物在UV 254 nm下的吸收值,通過比對標準對照或者建立的標準曲線,可以測定產(chǎn)物的相對水平。對于在紫外光下無吸收的底物植物甾醇則可以通過氣相色譜檢測甾體化合物的含量。高效液相色譜(HPLC)檢測法:采用C18反相層析柱(Agilent Extend-C18,4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為70%甲醇:30%水(v/v),流速為1.0 mL/min;柱溫為32 ℃;紫外檢測波長為254 nm;進樣體積為20 μL。

氣相色譜(GC)檢測法:將發(fā)酵樣品用乙酸乙酯萃取后,與同體積的濃度為1 g/L的膽固醇內(nèi)標參照物混合用于GC分析。采用島津2010 Plus氣相色譜儀進行GC分析;檢測器為FID檢測器,色譜柱為二甲基聚硅氧烷柱(30 m×0.25 mm× 0.25 μm);入口溫度為300 ℃,柱溫箱為320 ℃,FID檢測器溫度為300 ℃;載氣為氮氣,壓力為81.7 kPa,柱流量為1 mL/min,氫氣流量為40 mL/min,空氣流量為400 mL/min,氮氣流量為9.3 mL/min;進樣體積為1 μL;洗針溶液為乙酸乙酯。

1.5數(shù)據(jù)處理

本實驗通過Design-Expert 8.0軟件進行響應(yīng)面實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)分析并對最優(yōu)結(jié)果進行預(yù)測驗證,采用Origin Pro8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1氮源的優(yōu)化氮源主要用來構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物,是微生物細胞需要量非常大的元素。不同氮源對Mycobacteriumsp. BFZ304轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的影響如圖1所示。從圖1中可以看出,在多種氮源存在下,Mycobacteriumsp. BFZ304都可以轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD,幾種有機氮源中以玉米漿作為氮源時9α-OH-AD濃度最高達到2.98 g/L?？赡苁且驗橛衩诐{中含有豐富的可溶性蛋白和生長素,能為菌體生長提供更多的營養(yǎng)物質(zhì),有利于甾醇側(cè)鏈降解酶的合成。在無機氮源中以硝酸鈉為氮源時,9α-OH-AD的產(chǎn)量最大達到2.632 g/L,而以硫酸銨時,9α-OH-AD濃度最低?？赡苁且驗楫敯备x子被代謝后,培養(yǎng)基中生成H2SO4,導(dǎo)致pH降低,不利于反應(yīng)的進行。由此實驗結(jié)果可知,微生物Mycobacteriumsp. BFZ304在轉(zhuǎn)化過程中既需要有機氮源的參與也需要無機氮源,其能夠較快利用無機氮源,在利用無機氮源的基礎(chǔ)上分解利用有機氮源,因此本實驗選擇玉米漿和硝酸鈉同時作為氮源用于后續(xù)的研究。

圖1　氮源對9α-OH-AD濃度的影響Fig.1　Effect of nitrogen source type on the concentration of 9α-OH-AD

2.1.2碳源的優(yōu)化碳源作為分支桿菌培養(yǎng)基的基本成分之一,能夠為分支桿菌的生長代謝提供能量。同時它也是菌體細胞組成的原料,是菌體生長發(fā)育必需的能源物質(zhì),某些碳源是分支桿菌側(cè)鏈降解相關(guān)酶的誘導(dǎo)物,選擇適宜的碳源有利于定向促進某些酶的合成,增強分支桿菌的活性[15]。本研究中添加的不同碳源對Mycobacteriumsp. BFZ304轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的影響如圖2所示。Mycobacteriumsp. BFZ304可以利用不同的碳源,但不同碳源類型對9α-OH-AD產(chǎn)量影響較大。當以葡萄糖為碳源時,9α-OH-AD的產(chǎn)量為2.21 g/L,高于其他的幾種碳源。因為葡萄糖是單糖,所以Mycobacteriumsp. BFZ304相對更容易利用葡萄糖,故選用葡萄糖作為Mycobacteriumsp. BFZ304轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖2　不同碳源對9α-OH-AD濃度的影響Fig.2　Effect of carbon source type on the concentration of 9α-OH-AD

2.1.3磷酸鹽的優(yōu)化磷是核酸、蛋白質(zhì)和輔酶的主要成分,可改變菌體的能荷狀態(tài),磷酸鹽也是培養(yǎng)基中重要的緩沖鹽,使得培養(yǎng)基中pH不會隨菌體產(chǎn)酸而引起劇烈的變化[16]。Mycobacteriumsp. BFZ304對不同的磷酸鹽利用效果不盡相同,由圖3可知添加磷酸氫二銨的發(fā)酵液中9α-OH-AD含量最高,達到2.308 g/L,因此,選擇磷酸氫二銨作為最適磷酸鹽用于后續(xù)的研究。

圖3　磷酸鹽對9α-OH-AD濃度的影響Fig.3　Effect of phosphate on the concentration of 9α-OH-AD

2.2響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化結(jié)果

2.2.1模型的建立及顯著性檢驗利用Design-Expert 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。根據(jù)表2的實驗結(jié)果,對表中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到Mycobacteriumsp. BFZ304發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)9α-OH-AD濃度(Y)對葡萄糖(X1)、玉米漿(X2)、硝酸鈉(X3)、磷酸氫二銨(X4)的多項回歸方程為:

Y=-6.8742+8.1052+2.0416+5.7826+69.8081+0.1090-1.2287+8.2500+0.4995-4.600+23.9889-4.3684-0.2744-6.8099-572.1833。

對實驗結(jié)果進行方差分析,結(jié)果如表3所示。

表2　響應(yīng)面分析實驗結(jié)果

從表3可以看出建立的回歸模型極顯著(p<0.0001)說明方程擬合度較好;失擬項p=0.1007>0.05,說明失擬項不顯著,殘差由隨機誤差引起,模型選擇正確;復(fù)相關(guān)系數(shù)=0.9531,表明預(yù)測值和實測值之間具有很高的相關(guān)性;調(diào)整性決定系數(shù)=0.9062,表明方程模型可信度較高,能夠較好地描述實驗結(jié)果。

由表3可知,四因素中對9α-OH-AD產(chǎn)量影響從大到小的順序為X1、X4、X3、X2。X2對9α-OH-AD產(chǎn)量影響不顯著,X3對9α-OH-AD產(chǎn)量影響顯著,X1、X4的影響為極顯著,4因子的交互及二次項的影響均為極顯著。

2.2.2相應(yīng)面優(yōu)化及分析4因子的交互圖見圖4～圖9。

葡萄糖和玉米漿對9α-OH-AD產(chǎn)量的影響如圖4所示,當葡萄糖的添加量一定時,9α-OH-AD的產(chǎn)量隨著玉米漿添加量的增加而增大,但當玉米漿的添加量大于40 g/L時,9α-OH-AD的產(chǎn)量呈下降趨勢。當玉米漿的添加量一定時,隨著葡萄糖添加量的增加,9α-OH-AD的產(chǎn)量隨之增大,但當葡萄糖的添加量繼續(xù)增大時,9α-OH-AD產(chǎn)量逐漸降低。其他圖所反映出來的升降趨勢與圖4一致,故分析略。

三維圖反映出的結(jié)果與方差分析表所反映出的結(jié)果一致。在此基礎(chǔ)上,通過Design-Expert8.0軟件,進行分析計算,可得到Mycobacteriumsp. BFZ304發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)9α-OH-AD的最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖10.00 g/L、玉米漿40.00 g/L、硝酸鈉6.00 g/L、磷酸氫二銨0.70 g/L,在此條件下9α-OH-AD的產(chǎn)量預(yù)測值可達4.96 g/L。

圖4　葡萄糖和玉米漿對9α-OH-AD產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.4　Response surface for the effect of cross-interaction between corn steep liquor and glucose on the yield of 9α-OH-AD

圖5　葡萄糖和硝酸鈉對9α-OH-AD產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.5　Response surface for the effect of cross-interaction between NaNO3 and glucose on the yield of 9α-OH-AD

圖6　葡萄糖和磷酸氫二銨對9α-OH-AD產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.6　Response surface for the effect of cross-interaction between (NH4)2HPO4 and glucose on the yield of 9α-OH-AD

表3　9α-OH-AD產(chǎn)量多項式回歸模型方差分析

圖7　玉米漿和硝酸鈉對9α-OH-AD產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.7　Response surface for the effect of cross-interaction between NaNO3 and corn steep liquor the yield of 9α-OH-AD

圖8　玉米漿和磷酸氫二銨對9α-OH-AD產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.8　Response surface for the effect of cross-interaction between (NH4)2HPO4and corn steep liquor on the yield of 9α-OH-AD

圖9　硝酸鈉和磷酸氫二銨對9α-OH-AD產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖Fig.9　Response surface for the effect of cross-interaction between(NH4)2HPO4 and NaNO3 on the yield of 9α-OH-AD

2.2.3響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果的驗證考慮到實際操作的方便性,將以上組合校正為葡萄糖10 g/L、玉米漿40 g/L、硝酸鈉6 g/L、磷酸氫二銨0.7 g/L,在此條件下進行驗證實驗,結(jié)果如圖10所示。發(fā)酵轉(zhuǎn)化96 h時,產(chǎn)物9α-OH-AD的產(chǎn)量達到最大,為4.86 g/L,此時底物植物甾醇的殘留量為2.99 g/L,植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為70.12%。

圖10　分支桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的轉(zhuǎn)化過程Fig. 10　Time-course of the accumulation of products during phytosterol conversion by Mycobacterium sp.

3　結(jié)論

通過單因素優(yōu)化實驗進行了培養(yǎng)基成分的篩選,確定了Mycobacteriumsp. BFZ304發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)9α-OH-AD的培養(yǎng)基配方成分。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面實驗設(shè)計,對Mycobacteriumsp. BFZ304發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)9α-OH-AD培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,通過實驗數(shù)據(jù)進行分析與評價,得到影響9α-OH-AD產(chǎn)量的二次多項式回歸模型,并對該模型進行顯著性檢驗。最終得到優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:葡萄糖10 g/L、玉米漿40 g/L、硝酸鈉6 g/L、磷酸氫二銨0.7 g/L,在此條件下9α-OH-AD的產(chǎn)量最高,預(yù)測值為4.96 g/L。對優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行驗證實驗,得到的結(jié)果為9α-OH-AD的產(chǎn)量為4.86 g/L,底物植物甾醇的殘留量為2.99 g/L,基本接近理論預(yù)測值,證明該模型合理。Mycobacteriumsp. BFZ304發(fā)酵轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)9α-OH-AD的培養(yǎng)基通過單因素及響應(yīng)面的優(yōu)化后,底物植物甾醇的轉(zhuǎn)化率達到70.12%,與初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基植物甾醇轉(zhuǎn)化率(31.54%)相比提高了近40%。

目前國內(nèi)外對微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的研究很少。其中袁家代等在分枝桿菌中異源表達3-甾酮-9α-羥基化酶基因,構(gòu)建了9α-OH-AD菌株,植物甾醇經(jīng)過該菌轉(zhuǎn)化后,發(fā)酵液中9α-OH-AD的含量僅為0.453 mg/L[17]。楊亞力等利用篩選到的偶發(fā)分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇,9α-OH-AD的含量也小于1 g/L[18]。雖然本研究已經(jīng)將底物的轉(zhuǎn)化率大大提高,但是還有很多底物未能被微生物所利用而損失掉,因此下一步工作可通過添加一些促進劑增大底物植物甾醇與菌體細胞的接觸面積進一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化工藝,提高植物甾醇的轉(zhuǎn)化率。

[1]齊香君.現(xiàn)代生物制藥工藝學(xué)[M].北京:北京化學(xué)工業(yè)出版社,2003:259-261.

[2]童望宇,章亭州,傅向陽.制藥微生物技術(shù)-基礎(chǔ)與應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006,243-265.

[3]楊亞力,楊順凱,吳中柳.偶發(fā)分枝桿菌發(fā)酵甾醇側(cè)鏈積累9α-羥基雄烯二酮[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2015,21(2):256-262.

[4]魏長龍,趙樹欣,王珊,等. Nocardia canicruria BF313催化甾體9α-羥基化發(fā)酵工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2014,35(18):320-323.

[5]VanRheenen V,Shephard K. New synthesis of corticosteroids

from 17-keto steroids:Application and stereochemical study of the unsaturated sulfoxide-sulfenate rearrangement[J].Journal of Organic Chemistry,1979,44(9):1582-1584.

[6]林彥良.甾體化合物微生物轉(zhuǎn)化的研究[D].濟南:山東大學(xué),2009:19-22.

[7]楊順楷,楊亞力,吳中柳,等.微生物發(fā)酵降解植物甾醇側(cè)鏈生產(chǎn)17-酮甾體研究進展[J]. 生物加工過程,2010,8(5):69-77.

[8]Rodina NV,Molchanova MA,Voishvillo NE,et al.Conversion of phytosterols into androstenedione byMycobacteriumneoaurum[J].Prikl Biokhim Mikrobiol,2008,44(1):56-62.

[9]Andriushina VA,Rodina NV,Stytsenko TS,et al. Conversion of soybean sterols into 3,17-diketosteroids using actinobacteriaMycobacteriumneoaurum,PimelobactersimplexandRhodococcuserythropolis[J]. Prikl Biokhim Mikrobiol,2011,47(3):297-301.

[10]Rodina NV,Andryushina VA,Stytsenko TS,et al. The introduction of the 9α-hydroxy group into androst-4-en-3,17-dione using a newActinobacteriumstrain[J]. Prikl Biokhim Mikrobiol,2009,45(4):439-445.

[11]Donova MV,Gulevskaya SA,Dovbnya DV.Mycobacteriumsp. Mutant strain producing 9α-hydroxy-androstenedione from sitosterol[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2005,67:671-678.

[12]徐陽光.分枝桿菌降解植物甾醇側(cè)鏈過程基礎(chǔ)研究[D]. 杭州:浙江大學(xué),2014:28-29.

[13]康遠軍,楊華,李欣,等.基于響應(yīng)面法的魯氏酵母發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J].中國釀造,2015,34(4):25-29.

[14]喬君,趙祥穎,馬欽元,等.響應(yīng)曲面優(yōu)化檸檬酸淀粉清料發(fā)酵培養(yǎng)基[J].生物工程,2015,36(2):231-234.

[15]劉波,鄔應(yīng)龍,張霞,等.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2014,35(1):254-258.

[16]楊英. 徽生物轉(zhuǎn)化植物甾醇制備甾體藥物關(guān)健中間體研究[D].合肥:合肥工業(yè)大學(xué),2009:64-67.

[17]袁家代,陳貴英,程世君,等. 3-甾酮-9α-羥基化酶基因在分枝桿菌中的異源表達與9α-羥基雄烯二酮的制備[J]. 生物工程學(xué)報,2015,31(4):523-533.

[18]楊亞力,楊順楷,吳中柳. 偶發(fā)分枝桿菌發(fā)酵斷甾醇側(cè)鏈積累9α-羥基雄烯二酮[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2015,21(2):256-262.

Optimization of medium composition ofMycobacteriumsp. BFZ304 for the transformation of phytosterol to 9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione by response surface analysis

LIU Xiang-he1,2,ZHANG Rui-jie2,3,ZHAO Shu-xin1,ZHANG Bao-guo2,*,SHI Ji-ping2,3

(1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China;3.College of Biotechnology,Shanghai Tech University,Shanghai 201210,China)

The influence of different carbon sources,nitrogen source,phosphate on 9α-OH-AD producted byMycobacteriumsp. BFZ304 was studied. On the base of single factors experiments,using 9α-OH-AD production as index response surface analysis was applied to optimize the fermentation medium composition. The quadratic regression analysis was applied to get the optimal level of main factors(corn steep liquor,glucose,NaNO3、(NH4)2HPO4). Finally determined the optimal medium were as follows:corn steep liquor 40 g/L,glucose 10 g/L,NaNO36 g/L,(NH4)2HPO40.7 g/L. Under these optimal conditions,the production of the 9α-OH-AD was high up to 4.86 g/L when the concentration of the feeding was 10 g/L,increased by 40% compared with the original medium. It would have a disirable prosfect.

Mycobacteriumsp. BFZ304;phytosterol;9α-hydroxy-4-androstene-3,17-dione;response surface analysis

2016-03-04

柳相鶴(1989-),女,碩士研究生,研究方向:甾體藥物微生物轉(zhuǎn)化,E-mail:liuxianghe2013@163.com。

張保國(1979-),男,博士,研究方向:甾體藥物微生物轉(zhuǎn)化,E-mail:zhangbg@sari.ac.cn。

國家自然科學(xué)基金(41106125)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)16-0172-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.026