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    GST融合蛋白活性測定條件的優(yōu)化*

    2016-11-08 07:47:56斌,謝
    關(guān)鍵詞:谷胱甘肽底物緩沖液

    梁  斌,謝  琦

    (桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院,廣西桂林 541004)

    技術(shù)方法

    GST融合蛋白活性測定條件的優(yōu)化*

    梁斌,謝琦△

    (桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院,廣西桂林541004)

    谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶;分光光度法;活性測定

    谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST,EC2.5.1.18)是一種廣泛分布于動植物和微生物體內(nèi),具有多種生理功能的同工酶家族。在醫(yī)學(xué)研究中,由于它是生物體內(nèi)重要的解毒酶系,其在體內(nèi)活性的高低與代謝環(huán)境致癌物和化療藥物能力之間的關(guān)系受到人們的關(guān)注[1]。在基因工程研究中,GST的基因已被克隆和表達,GST可被作為一種融合表達蛋白來提高重組蛋白的可溶性表達,與GST融合的重組蛋白很容易利用GST標(biāo)簽,通過親和層析進行純化,所以各種帶有GST標(biāo)簽的重組蛋白被大量表達。在各種與GST相關(guān)的研究中,都涉及到GST酶活性的測定。目前,建立的GST酶活性測定方法有分光光度法、熒光底物法、滴定法、重疊氮法、氰化物法、對硝基酚法等。張丹參等[2]比較了上述方法后認為,以1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和還原型谷胱甘肽(GSH)為底物的分光光度法具有操作簡便,靈敏度高,穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。我學(xué)院在參照Habdous等[3-4]建立的以CDNB和GSH為底物的分光光度法的基礎(chǔ)上,針對基因工程研究中大量使用的帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白的酶活測定條件進行了優(yōu)化。

    1 材料與方法

    1.1材料大腸桿菌BL21(DE3)[PGEX-4T-1],攜帶重組胸腺肽Tα1-TP5基因, 由本實驗室構(gòu)建[5]。CDNB(1-氯-2,4-二硝基苯), 購自SIGMA公司。GSH(還原型谷胱甘肽),購自上海生工。大腸肝菌培養(yǎng)基:酵母粉2.4%,蛋白胨1.2%,甘油0.4%,磷酸二氫鉀17mmol/L,磷酸氫二鉀72mmol/L,硫酸鎂1mmol/L,高壓滅菌時磷酸鹽和硫酸鎂與其它組分分開,待溶液冷卻至60℃以下后混合。

    1.2實驗方法

    1.2.1GST-Tα1-TP5融合蛋白的粗提:500ml三角瓶裝大腸桿菌培養(yǎng)基100ml,接種量0.5%,37℃、250r/ min搖床培養(yǎng),2.5h后加終濃度1g/L乳糖誘導(dǎo),繼續(xù)培養(yǎng)6h后離心收集菌體。用0.1mol/LPBS重懸菌體,冰浴超聲破碎10min(工作30s,間歇30s),破碎后在14000r/min下冷凍離心10min,所得上清中含有GST-Tα1-TP5融合蛋白,即為粗酶液。

    1.2.2GST活性測定:

    1.2.2.1酶活測定步驟:樣品管和空白管分別配底物溶液4ml,混勻,在設(shè)定的溫度中保溫5min; 樣品管加入酶樣20μl,立刻計時,空白管加入PBS 20μ l,5min 時分別向樣品管、空白管加入終止劑后混勻。用1cm的石英比色杯于340nm處測定樣品管和空白管的OD值,計算差值△OD。

    1.2.2.2GST活性計算:在特定條件下,每分鐘催化1μmol/L的CDNB與GSH結(jié)合的GST的量為 GST活力。

    GST活力(U/L)=(△OD/t)×TV×106/(ε×d×SV)

    上式中,t:反應(yīng)時間(min); TV:反應(yīng)總體積(ml);106:摩爾分子換算成微摩爾分子;ε:產(chǎn)物在340nm處摩爾吸光系數(shù)為9.6×103mol/cm;d:比色杯光徑(cm);SV:樣品量(ml)。

    1.2.3GST酶活測定反應(yīng)條件優(yōu)化:

    1.2.3.1酶促反應(yīng)終止方法的選擇:根據(jù)GST酶促反應(yīng)的機制,催化反應(yīng)的第一步是GSH的去質(zhì)子化,生成H+和GS-,酸性條件可抑制GSH的去質(zhì)子化,不利于反應(yīng)的進行,而且在pH值較小的情況下,GST酶變性失活,酶促反應(yīng)終止。因此采用加酸的方法終止酶促反應(yīng):選擇5mol/L的鹽酸和5mol/L的硫酸作為酶促反應(yīng)終止劑,按1.2.2.1的方法,在酶促反應(yīng)5min后加入5μ l,10μ l,15μ l,20μ l,40μ l,100μ l的鹽酸或硫酸,30min內(nèi)每隔30秒測定吸光值的變化情況。

    1.2.3.2底物濃度的選擇:根據(jù)1.2.3.1的結(jié)果,終止劑選擇5mol/L的鹽酸,加入量為40 μl。以下實驗采用此條件。反應(yīng)體系采用0.1mol/L,pH6.5的PBS緩沖液,反應(yīng)溫度30℃,固定酶量和固定一個底物濃度,另一個底物的濃度分別選擇1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L,按1.2.2.1的方法測定酶活,觀察不同底物濃度與酶活性的關(guān)系。

    1.2.3.3反應(yīng)溫度的選擇:按1.2.2.1的方法,采用最佳的底物濃度,單因素改變反應(yīng)溫度,分別為25℃、30℃、37℃、45℃,觀察不同反應(yīng)溫度與酶活性的關(guān)系。

    1.2.3.4 pH的選擇:按1.2.2.1的方法,采用以上實驗確定的最優(yōu)反應(yīng)條件,單因素改變PBS緩沖液的pH,分別為6.5、7.0、7.5,觀察不同反應(yīng)pH條件與酶活性的關(guān)系。

    1.2.3.5反應(yīng)體系緩沖液濃度的選擇:按1.2.2.1的方法,采用以上實驗確定的最優(yōu)反應(yīng)條件,單因素改變反應(yīng)體系緩沖液的終濃度,分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L,觀察反應(yīng)體系的離子強度與酶活性的關(guān)系。

    1.2.3.6反應(yīng)條件優(yōu)化前后GST酶活測定結(jié)果的比較:文獻[2-5]中采用以CDNB和GSH為底物的分光光度法測定GST酶活的反應(yīng)條件各有不同,其中常用的反應(yīng)條件是:底物濃度CDNB和GSH均為1mmol/L,緩沖溶液采用pH=6.5,0.1mol/L磷酸鹽緩沖液,溫度采用30℃,反應(yīng)時間5min。本實驗也是在此基礎(chǔ)上進行優(yōu)化。取兩份酶樣,分別用上述反應(yīng)條件和優(yōu)化后的反應(yīng)條件測定,比較測定結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1酶促反應(yīng)終止方法的選擇在4ml的反應(yīng)體系中,當(dāng)加入5mol/L的鹽酸≧40μl或5mol/L的硫酸≧20μl后,反應(yīng)體系的吸光值基本保持不變,且在30min內(nèi)保持穩(wěn)定,說明當(dāng)反應(yīng)體系的pH小于1后,CDNB與GSH混合后發(fā)生的不論是自發(fā)反應(yīng)還是酶促反應(yīng)均有效終止。在340nm處,硫酸和鹽酸的光吸收近似為零,對產(chǎn)物的測定無影響??紤]到應(yīng)盡量不往反應(yīng)體系里增加新的離子或基團,因此選擇鹽酸為終止劑。

    2.2最適底物濃度:通過對兩種底物在不同濃度下進行交叉實驗發(fā)現(xiàn),GSH濃度與CDNB濃度越大對應(yīng)的GST酶活力也越大,但是當(dāng)CDNB濃度>3mmol/L時,反應(yīng)體系開始變渾濁。當(dāng)CDNB的濃度為2.5mmol/L,GSH濃度>3mmol/L時,樣品與空白對應(yīng)的吸光度的差值△OD不再穩(wěn)定,而當(dāng)GSH濃度與CDNB濃度各為2.5mmol/L時,對應(yīng)的GST酶活性值最大且穩(wěn)定。因此,最適底物濃度為GSH 2.5mmol/L,CDNB 2.5mmol/L。實驗結(jié)果見圖1。

    圖1 底物濃度對GST酶活的影響

    2.3最適反應(yīng)溫度在25℃-37℃范圍內(nèi),隨著溫度升高,GST酶的活性也隨之升高,45℃時由于酶失活速率加快等因素,酶活性下降,選擇該酶的最適反應(yīng)溫度為37℃。結(jié)果見圖2。

    圖2 溫度對GST酶活的影響

    2.4最適pH通過測定pH為6.5、7.0、7.5時對應(yīng)的樣品與空白實驗的吸光值,發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增大,不論是自發(fā)反應(yīng)還是酶促反應(yīng),反應(yīng)速率都隨之增大。但二者的吸光度的差值在pH7.0時最大,可見,pH7.0為本實驗所用酶的最適反應(yīng)pH。結(jié)果見圖3。

    圖3 pH對GST酶活的影響

    2.5PBS緩沖液濃度的選擇反應(yīng)體系的離子強度是影響酶促反應(yīng)速率的因素之一。通過測定在酶活性測定的時間內(nèi)反應(yīng)體系的pH,發(fā)現(xiàn)當(dāng)PBS緩沖液的濃度大于0.05 mol/L時,反應(yīng)體系的pH保持不變。本實驗通過改變磷酸鹽緩沖液的濃度,研究反應(yīng)體系的離子強度對酶促反應(yīng)速率的影響,PBS緩沖液的濃度為0.1mol/L時最優(yōu)。結(jié)果見圖4:

    圖4 離子強度對GST酶活的影響

    2.6反應(yīng)條件優(yōu)化前后GST酶活測定結(jié)果的比較取兩份酶樣,分別用優(yōu)化前后兩種反應(yīng)條件進行酶活測定。從實驗結(jié)果可知,在優(yōu)化后的酶活測定條件下,測定結(jié)果的酶活性要高于優(yōu)化前3-4倍,可提高檢測結(jié)果的靈敏度。結(jié)果見圖5。

    圖5 優(yōu)化前后酶活測定結(jié)果的比較

    3 討論

    谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于各種生物組織細胞液中,是一個具有多種同工酶的超基因Ⅱ相代謝酶家族,參與外來化學(xué)物質(zhì),包括致癌物、致突變物和藥物等的代謝,具有多種生理功能。人們對不同來源的GST酶展開了各種研究,對其活性進行測定是研究的重要組成部分。由于不同來源的GST酶具有不同的理化性質(zhì),可表現(xiàn)出不同的催化特性,在催化以CDNB和GSH為底物的反應(yīng)時,最適反應(yīng)條件也會有差異。因此,不同的研究人員在研究如:人的血清[3]、海洋雙殼類動物[6]、大鼠的肝臟[2]等來源的GST酶時,優(yōu)化后的最適反應(yīng)條件是各不相同的。

    本實驗研究的是在基因工程領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用的GST融合表達載體,攜帶的是日本血吸蟲GST基因,其表達的GST融合蛋白具有完全的GST酶活。通過實驗優(yōu)化了GST融合蛋白活性測定的反應(yīng)條件,提高了測定的靈敏度。本實驗測定酶活時采用的是固定時間法,通過添加一定量的鹽酸來終止反應(yīng),與連續(xù)動態(tài)測定法相比,優(yōu)點是操作簡單,對儀器設(shè)備要求不高。優(yōu)化后的酶活性測定方法具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等特點,為GST融合蛋白的進一步系統(tǒng)研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

    [1]蔡群芳,鄔強.谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的研究進展[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2 011,17(12):1735-1738.

    [2]張丹參,張?zhí)焯钌剌?,?谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抑制劑的高通量篩選[J].藥學(xué)學(xué)報,2008,43(1):108-112.

    [3]Habdous M, Vincent-Viry M, Visvikis S, et al. Rapid spectrophotometric method for serum glutathione S-transferases activity(1 items) [J]. Clin Chim Acta, 2002,326(1-2):131-142.

    [4]蔡俊,邱雁臨,馬輝文.含谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因工程菌表達條件研究[J].微生物學(xué)雜志,2004,24(4):18-22.

    [5]謝琦,李娟,王鳳山.乳糖誘導(dǎo)胸腺融合肽Ta1-TP5在大腸桿菌中的表達[J].中國生化藥物雜志,2012,33(3):229-232.

    [6]陳穎,陳榮.海洋雙殼類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測定條件的優(yōu)化[J].海洋環(huán)境科學(xué),2007,26(4):386-389.

    Q78

    A

    1004-6879(2016)05-0413-03

    *廣西教育廳高??蒲谢鹳Y助項目(200103YB091)

    (2016-01-15)

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