關于“人紅細胞反定型試劑技術審查基本要求”的思考

董勁春

（國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械審評中心，北京100044）

·實驗室質量管理·

關于“人紅細胞反定型試劑技術審查基本要求”的思考

董勁春

（國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械審評中心，北京100044）

在“人紅細胞反定型試劑”技術審查中，有些紅細胞的基本評價指標對于明確試劑質量十分重要，但該產品各申報廠家的評價指標和方法均不同，難以對產品進行充分的評價。因此，本文對于該產品申報資料的基本要求，包括綜述資料、主要原材料、主要生產工藝及反應體系、分析性能評估、陽性判斷值、穩(wěn)定性、技術要求、說明書等資料進行了詳細的分析，并對臨床試驗的設計和要求進行了闡述?？傊疚闹荚诮o予申報企業(yè)一定的技術指導，使產品能夠最大程度地滿足臨床應用的要求。

ABO血型； 紅細胞； 注冊申報資料； 產品評價

在人紅細胞反定型試劑技術審查中，有些紅細胞的基本評價指標對于明確試劑質量十分重要，由于申報產品的廠家較多，每個廠家的評價指標和指標的評價方法均不完全一致，導致無法充分、客觀的對產品進行評價，如抗原性、抗原強度、特異性等，且沒有一個基本的評價標準，本文著重對于試劑紅細胞的一些基本要求進行分析、闡述，明確性能評價的基本方法和要求。同時對于臨床試驗的設計和基本要求也進行了闡述，以更好的指導生產企業(yè)評價產品。

1 適用范圍

人紅細胞反定型試劑用于人ABO血型的反定型，測定被檢者血清中有無相應的抗A或抗B抗體，輔助正定型結果判斷ABO血型。

本研究適用于不同的檢測方法，如試管法、柱凝集法、微孔板法等，但不適用于血源篩查用人紅細胞反定型試劑。

2 研究資料

2.1 綜述資料

綜述資料的撰寫應符合《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（總局2014年第44號公告）（以下簡稱“44號公告”）［1］的相關要求。應按照公告內容逐一詳細說明。而同類產品的批準上市情況介紹部分應著重從抗原性、特異性、親和力、溶血率、有效期等方面闡述擬注冊申報的產品與目前已獲批準的產品之間的異同。

2.2 主要原材料研究資料

主要原材料研究資料應包括主要組成成分（紅細胞及細胞保存液成分等）的選擇、制備及其質量標準的研究資料。

2.2.1 紅細胞的選擇及質量標準 需詳細描述紅細胞的來源。紅細胞來源應穩(wěn)定、可靠，采集時間期限明確。紅細胞的選擇應遵循以下原則：①如紅細胞Rh表型為陽性（D+、C+、E+），則應在A1、B紅細胞外增加Rh陽性的O型紅細胞。②如只包含A1、B紅細胞，則兩支紅細胞均應為Rh表型陰性（D-、E-、C-）的混合細胞懸液。

應對試劑紅細胞進行以下基本特性的研究：

紅細胞獻血員應進行血型正反定型檢測，只有在正反定型結果一致的情況下，其紅細胞才能用于生產。

①紅細胞的抗原性：反定型紅細胞至少要包括A1和B細胞，使用A2和O細胞測定可解決部分血型測定中的異常情況，A2細胞可測定A亞型，O細胞可在測定中作為抗原陰性對照。

②紅細胞的抗原強度：通過考察不同凝集強度時抗體試劑（抗-A、抗-B、抗-H）的稀釋度，說明試劑紅細胞的抗原強度。

③親和力：通過與相應抗體（抗-A、抗-B、抗-H）反應在多少秒（如15s）內出現凝集，3min內凝集塊達到1mm2以上（或凝集強度≥3+）等指標體現細胞親和力，可參照相關規(guī)定進行試驗及結果判斷?？贵w效價應符合國家規(guī)定。

④紅細胞的特異性：使用抗-A、抗-A1、抗-B、抗-H抗體進行特異性驗證。不與ABO血型系統非對應抗體發(fā)生陽性反應。

⑤直接抗人球蛋白試驗：使用抗-IgG和抗-補體或使用多特異性抗人球蛋白試劑對試劑紅細胞進行直接抗人球蛋白試驗（DAT）時，結果應為陰性。

⑥溶血率（性）：明確溶血率的試驗方法、實驗所需物品及溶血率的要求。可采用溶血率或游離血紅蛋白濃度的作為評價指標。

⑦紅細胞濃度的確定：說明紅細胞懸浮液的濃度和限度（如3%±0.2%）。

2.2.2 紅細胞保存液的選擇 說明紅細胞保存液的選擇過程，提交試驗數據說明最終確定的保存液在保證細胞的抗原性（抗原減弱）、減少溶血等方面的性能。需明確保存液中各組分的基本作用，如何防止溶血、抗原減弱、補體激活等。另外應對紅細胞保存液的以下性能進行研究：①PH值。②在選定的保存液環(huán)境中進行試劑紅細胞穩(wěn)定性的研究，進行詳細的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性的研究。

2.2.3 生物安全性

2.3 主要生產工藝以及反應體系的研究資料

2.3.1 資料中的主要生產工藝的介紹 可采用流程圖的方式表示，同時應該簡要說明本產品的主要生產工藝的確定的相關依據，包括法規(guī)和實際生產過程的要求等等。

2.3.2 產品基本反應原理介紹

2.3.3 主要生產工藝過程的研究資料、每一步生產工藝的確認資料及試驗數據

2.3.4 主要反應體系（不同的實驗原理、實驗方法）的研究資料、每一步反應體系的確認資料及試驗數據

反應體系的設置應符合《全國臨床檢驗操作規(guī)程》等公認標準操作規(guī)范、指南或標準的要求。

3 評價資料

3.1 分析性能評估資料

分析性能評估資料是生產者在其產品研制階段或者成品驗證階段對試劑的所有性能進行全面驗證的研究資料。提供的資料中應包括每項分析性能的評價，并且應包括具體的研究目的、研究材料、研究方法、實驗設計、實驗數據、結果分析（包括可接受標準、統計方法）等詳細資料。還應包括具體的實驗地點（如實驗室或臨床機構）、使用的儀器型號、試劑的規(guī)格及批號、臨床樣本包括其來源、屬性、基礎信息等有關背景信息。而相關的實驗方法可以參考國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的或國際有關體外診斷產品性能評估的指導原則進行［2］。

其中有關產品性能部份的研究所采用的各種儀器、試劑或其他物品如可能則均應采用境內或境外已批準上市的產品，如抗-A、抗-B、抗-H、抗-人球蛋白試劑等。

分析性能評估試驗中應明確所有試驗每種試劑的用量、試劑紅細胞的濃度、采用的試驗方法（試管法、柱凝集法、微孔板法等）。所有試驗方法應符合配合使用的血型試劑的具體操作要求。

應對申報的反定型紅細胞試劑聲稱適用的所有試驗方法進行分析性能評估，如試管法、柱凝集法、微孔板法等。不同試驗方法的性能研究均應采用至少三批產品進行。

人紅細胞反定型試劑還應著重對以下分析性能進行研究。

3.1.1 紅細胞的抗原性 以表1的反應格局說明紅細胞的抗原性。

表1 紅細胞的抗原性

3.1.2 紅細胞的抗原強度 紅細胞的抗原強度應不低于表2要求。

表2 紅細胞的抗原強度（效價）

3.1.3 親和力 抗-A、抗-B、抗-H與試劑紅細胞A1、A2、B、O混合后，應在多少秒內（如15s內）出現肉眼可見的凝集，3min內凝集塊達到1mm2以上（或凝集強度≥3+）。

3.1.4 紅細胞的特異性 以表3的反應格局說明紅細胞的特異性。

表3 紅細胞的特異性

3.1.5 直接抗人球蛋白試驗 使用抗-IgG和抗-補體或多特異性抗-人球蛋白試劑進行試劑紅細胞直接抗-人球蛋白試驗時，結果應為陰性。

3.1.6 溶血率（性） 明確每種試劑紅細胞溶血率的試驗方法、使用物品、測量方法、結果計算方法等內容。

可采用百分比進行結果報告，也可采用濃度單位報告結果。

3.1.7 樣本抗凝劑的選擇

3.1.8 溶血、脂血、黃疸等樣本的干擾評價

3.1.9 無菌試驗

3.2 陽性判斷值

給出不同凝集強度的研究方法，并明確不同凝集強度代表的具體意義，并應包含溶血、混合視野雙群等情況，明確具體的試驗方法、實驗步驟，提供不同凝集強度的圖例或相片。

3.3 穩(wěn)定性研究資料

對于人紅細胞反定型試劑，穩(wěn)定性資料主要涉及申報的紅細胞試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究兩部分內容。紅細胞試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（即試劑的有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性等內容，實驗項目應至少包括紅細胞抗原性、凝集強度、特異性、溶血率、無菌試驗。

樣本穩(wěn)定性研究，主要研究不同溫度下保存一定時間對樣本的影響，應主要包括室溫、冷藏和冷凍條件下的有效期研究和驗證。應在一定的溫度范圍內選擇實驗點（溫度范圍），并每隔一定時間進行全性能的分析測試。對于冷凍保存的樣本須對凍融次數進行評價。

兩部分穩(wěn)定性內容的研究結果應體現在說明書中。

4 臨床資料

臨床試驗［3-5］應符合《體外診斷試劑臨床試驗指導原則》、《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）［6］、“44號公告”的規(guī)定，以下僅結合人紅細胞反定型試劑的具體特點對其臨床試驗中應重點關注的內容進行闡述。

4.1 研究方法

該類試劑應按照法規(guī)要求選擇境內已經批準上市、并且目前臨床普遍認為質量較好的同類產品進行比較研究試驗，證明本品與已上市產品等效。

4.2 臨床試驗單位的選擇

應按照法規(guī)要求選擇臨床試驗機構，不得選擇血站或采供血機構進行臨床試驗。

4.3 病例選擇

臨床總病例數應不少于3000例。應采用臨床患者進行臨床研究，應包括對反定型檢測易產生干擾的病例，如選擇各種疾病患者（腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）、老人、兒童（不同年齡段）、正反定型不一致的病例等。

4.4 實驗過程

在進行反定型紅細胞試劑臨床試驗的過程中除與對比試劑進行比較外，應同時給出該樣本的正定型試驗結果，以進一步判斷反定型結果的準確性。

產品如適用于不同的試驗方法（如試管法、柱凝集法、微孔板法等），每種試驗方法均應分別進行至少3000例的臨床試驗，并明確配合使用的試劑產品，配合使用的產品均應是境內已上市產品。

4.5 統計學分析

應分別進行正反定型結果、考核試劑與對比試劑的陽性符合率、陰性符合率、總符合率的計算，結果以四格表的形式處理，并進行定性結果的Kappa檢驗。

4.6 結果不一致樣本的驗證

兩種試劑檢測結果不一致（包括正反定型結果不一致、考核試劑與對比試劑結果不一致、與對比試劑凝集強度差異較大）的樣本，應采用第三種同類試劑進行確認試驗，同時應結合樣本的正定型結果進行綜合分析，最終應采用適合的方法進行樣本血型的最終確認。

4.7 臨床試驗數據記錄表

臨床試驗數據記錄表應作為臨床試驗報告附件提交。臨床試驗數據記錄表應列明所有病例的具體臨床診斷信息、凝集強度和血型正反定型結果，如有不符樣本應列明第三方確認的結果。

5 其他資料

5.1 產品風險分析資料

產品風險分析資料應符合“44號公告”的基本要求，并參照相應的行業(yè)標準進行風險分析。風險分析中應充分考慮到各種可能影響檢測結果的因素，如某些樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）在進行血型反定型檢測時可能存在一定的干擾、影響試劑紅細胞穩(wěn)定性的諸多因素可能導致的細胞抗原性減弱、新生兒或老年人可能因為抗體較弱影響檢測結果等，申請人應根據這些不確定的因素分析產品應用可能存在的風險。

5.2 產品技術要求

申請人應按照《醫(yī)療器械產品技術要求編寫指導原則》（總局2014年第9號通告）的有關要求，編寫產品技術要求。產品技術要求應符合《辦法》和“44號公告”的相關規(guī)定。

如果人紅細胞反定型試劑有相應的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于上述標準要求。

產品技術要求的性能指標應至少包括紅細胞的抗原性、紅細胞的抗原強度、紅細胞的特異性、直接抗人球蛋白試驗、溶血率（性）、親和力。

5.3 產品注冊檢驗報告

應根據《辦法》要求提供連續(xù)三個生產批次樣品的注冊檢驗。

5.4 產品說明書

產品說明書應根據《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（總局2014年第17號通告）［7］的要求進行編寫，以下內容僅對人紅細胞反定型試劑說明書的重點內容進行詳細說明。

5.4.1 預期用途 ①寫明本試劑用于人血型的反定型檢測，同時明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗。②明確產品的檢測結果必須結合正定型的檢測結果才能進行ABO血型的準確定型。

5.4.2 樣本要求 明確溶血、脂血、黃疸樣本是否可以使用，或提供可以使用此類樣本的最低要求；依據穩(wěn)定性研究結果寫明樣本穩(wěn)定性；明確適用的抗凝劑的要求；明確具體的樣本采集、處理方法及過程。

5.4.3 陽性判斷值 明確各種試驗方法的結果判斷方法及標準，并通過不同凝集強度的圖例或照片進行詳細解釋。

5.4.4 檢驗方法［8-9］如適用于不同的試驗方法請分別寫明具體方法及操作步驟。如配合其他試劑進行試驗，需注明試驗方法應完全符合配合試劑的試驗操作要求。

質控要求：為確保試劑測定的準確性，每天要使用已知弱反應性抗血清測定試劑細胞的反應性。每次測定時用自身細胞進行同步對照是有意義的。應根據相關規(guī)定進行每日質控試驗。

5.4.5 檢驗方法的局限性 ①老年人及兒童ABO抗體弱，某些疾病患者如腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、消化道疾病等反定型會出現弱反應，甚至陰性反應，結果應慎重解釋。②必須與正定型血型檢測同時進行，正反定型結果一致才能確定ABO血型。正反定型不一致時需要進一步檢測，單獨的反定型結果不能作為判斷ABO血型的依據。③絕大多數A、B和O型血的ABO抗體凝集強度均較強，如凝集強度為2+以下，應對弱陽性反應進行確認，以排除干擾或亞型，確保正確的ABO定型。

總之，通過對于產品原材料、生產工藝、陽性判斷值、性能評估、臨床試驗以及產品說明書等基本要求的闡述，希望能給與申報企業(yè)一定的指導，可以從產品設計之初一直到產品設計定型均能通過科學和完善的評價保證產品的質量，使產品能夠最大程度的滿足臨床應用的要求。

［1］國家食品藥品監(jiān)督管理總局.關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告（總局2014年第44號公告）.2014年9月5日.

［2］衛(wèi)生部.中國生物制品規(guī)程.2000.

［3］國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則（2014年第16號通告）.2014年9月11日.

［4］申子瑜，李萍.臨床實驗室管理學（供醫(yī)學檢驗專業(yè)用）.第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社.2007.

［5］馮仁豐.臨床檢驗質量管理技術基礎.滬科文獻出版社.2003.

［6］國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊管理辦法（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）.2014年7月30日.

［7］國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑說明書編寫指導原則（2014年第17號通告）.2014年9月11日.

［8］樊綺詩.分子生物學檢驗技術（供醫(yī)學檢驗專業(yè)用）.第2版.人民衛(wèi)生出版社.2008.

［9］Robert FWeaver.分子生物學（Molecular Biology）.第3版.科學出版社.2008.

（潘子昂編輯）

Thinking About“The Basic Requirements for Technical Evaluation of ABO Reverse Grouping Kit（Human Red Blood Cells）”

DONG Jing-chun
（Center for Medical Device Evaluation，China Food and Drug Administration，Beijing 100044，China）

During technical evaluation of Kit for ABO Reverse Grouping（Human Red Blood Cells），some basic evaluation indicators are very important for the quality of kit.However，since the evaluation index and method from eachmanufacturer is different，it is hard to evaluate the product properly.Therefore，this papar is aimed to fully analyze the basic requirement of the product，including the review ing the raw materials，the production technology，the analytical performance，the reference value，the stability，the technical requirements and the instruction book.And we also explained the design and requirement of clinical trial.In conclusion，the papar aimed to guide themanufacturers to produce the products thatmeet the requirement of clinical application.

ABO blood group； Red blood cells； Registration information； Product evaluation

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.08.028

2016-05-03；

2016-06-27

董勁春。E-mail：dongjch@cmde.org.cn