西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素對(duì)人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Hut78的影響及其分子機(jī)制

谷曉廣 吳芳妮 張芊 張春雷100191北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科

西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素對(duì)人皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Hut78的影響及其分子機(jī)制

谷曉廣 吳芳妮 張芊 張春雷100191北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科

目的 研究西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素對(duì)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，探討西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素治療CTCL的機(jī)制。方法 分別用0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L西達(dá)本胺，10 μmol/L姜黃素，1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素處理Hut78細(xì)胞24、48、72 h后，采用MTS法檢測(cè)Hut78細(xì)胞的生存率。用0.6、1.2 μmol/L西達(dá)本胺，10 μmol/L姜黃素，1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合 10 μmol/L姜黃素分別處理Hut78細(xì)胞24 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期，用實(shí)時(shí)PCR和Western印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Fas、caspase 8、NF-κB p65及細(xì)胞周期相關(guān)基因P21、CDK2、細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）mRNA和蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)測(cè)量方差分析、單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果 西達(dá)本胺能明顯抑制Hut78細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性（F=266.558，P＜0.001）和時(shí)間依賴性（F=564.966，P＜0.001）。培養(yǎng) 48 h和72 h時(shí)，1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用顯著強(qiáng)于1.2 μmol/L西達(dá)本胺及10 μmol/L姜黃素（均P＜0.001）。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，聯(lián)合組的凋亡細(xì)胞比例均顯著高于0.6、1.2 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001）。此外，聯(lián)合組和1.2 μmol/L西達(dá)本胺組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于0.6 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組，而其S期細(xì)胞比例及G2/M期細(xì)胞比例均明顯低于0.6 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.05），聯(lián)合組與1.2 μmol/L西達(dá)本胺組各細(xì)胞周期比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，聯(lián)合組和1.2 μmol/L西達(dá)本胺組Fas、caspase 8、P21 mRNA的表達(dá)均明顯高于 0.6 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001），而其 NF-κB p65、CDK2、cyclin E mRNA的表達(dá)均明顯低于0.6 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001）。聯(lián)合組Fas mRNA的表達(dá)明顯高于 1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組（P＜0.001），而 caspase 8、P21、NF-κB p65、CDK2、cyclin E mRNA 的表達(dá)與1.2 μmol/L西達(dá)本胺組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。Western印跡結(jié)果顯示，聯(lián)合組與0.6、1.2 μmol/L西達(dá)本胺、不加藥物的對(duì)照組比較，F(xiàn)as、caspase 8、P21蛋白的表達(dá)明顯增加，而 NF-κB p65、CDK2、CyclinE 蛋白的表達(dá)明顯降低，與以上基因mRNA的表達(dá)一致。結(jié)論 西達(dá)本胺通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制CTCL細(xì)胞系Hut78生長(zhǎng)，聯(lián)合姜黃素能明顯提高抑制CTCL細(xì)胞系Hut78的生長(zhǎng)率。

淋巴瘤，T細(xì)胞，皮膚；姜黃素；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；西達(dá)本胺；Hut78細(xì)胞

皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（cutaneous T-cell lymphoma，CTCL）是原發(fā)于皮膚的T淋巴細(xì)胞克隆性增生造成的疾病，其中蕈樣肉芽腫（MF）和Sézary綜合征（SS）是最常見的類型。但目前CTCL的治療方法十分有限，特別是進(jìn)展為腫瘤期MF及病變擴(kuò)散累及周圍淋巴結(jié)和內(nèi)臟器官，局部治療只能緩解癥狀，系統(tǒng)性化療也很難達(dá)到治愈［1-2］。西達(dá)本胺是我國具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和全新化學(xué)結(jié)構(gòu)的選擇性組蛋白去乙?；敢种苿℉DAC inhibitor，HDAC-I），特異性地針對(duì)與腫瘤發(fā)生和發(fā)展高度相關(guān)的第Ⅰ大類組蛋白去乙酰化酶（HDAC）的亞型，主要抑制HDAC2 和HDAC3［3］，具有高抗癌活性和低毒性。姜黃素在很多腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型中可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡。近年來的研究顯示，姜黃素能明顯誘導(dǎo)CTCL細(xì)胞系的凋亡并抑制其增殖［4］。本研究通過觀察西達(dá)本胺和姜黃素對(duì)CTCL細(xì)胞系Hut78增殖和凋亡的影響，檢測(cè)Hut78細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，探討西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素治療CTCL的分子機(jī)制。

資料和方法

一、資料及試劑

Hut78細(xì)胞系（ATCC號(hào) TIB-161），RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司），西達(dá)本胺（深圳微芯生物科技有限公司，批號(hào)H20140129），姜黃素（美國Sigma公司，批號(hào)C7727）。MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（美國Promega公司），cDNA合成試劑盒（立陶宛Fermentas公司），F(xiàn)ITC-Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒（美國CA公司），PI試劑盒（美國BD公司），兔抗人多克隆抗體Fas、兔抗人多克隆抗體caspase 8、兔抗人多克隆抗體NF-κB p65、鼠抗人單克隆抗體P21、鼠抗人單克隆抗體CDK2、兔抗人單克隆抗體GAPDH（美國Abcam公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

Hut78細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃5%CO2孵育箱中培養(yǎng)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不同濃度細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

三、MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hut78細(xì)胞（2×104/ml）接種于6孔板中，每孔1 ml。以西達(dá)本胺在人體內(nèi)的峰濃度1.2 μmol/L 為基點(diǎn)［5］，通過倍比稀釋和倍比增加，實(shí)驗(yàn)組分別每孔加入 0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L 西達(dá)本胺，10 μmol/L 姜黃素，1.2 μmol/L 西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素（聯(lián)合組），對(duì)照組加入 DMSO，每孔 10 μl，分別培養(yǎng) 24、48、72 h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)混勻細(xì)胞，取100 μl細(xì)胞混懸液至96孔板中，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔，每孔中加20 μl預(yù)先配置的MTS溶液，37℃孵箱中孵育2 h，在分光光度儀490 nm處測(cè)定吸光度（A值），重復(fù)測(cè)定3次。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hut78細(xì)胞（2×104/ml）接種于6孔板中，每孔1 ml。實(shí)驗(yàn)組分別每孔加入0.6、1.2 μmol/L西達(dá)本胺，10 μmol/L 姜黃素，1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素（聯(lián)合組），對(duì)照組加入 DMSO，每孔 10 μl，培養(yǎng) 24 h。

細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：每個(gè)濃度組計(jì)數(shù)5×105個(gè)細(xì)胞，以冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次，將106/ml細(xì)胞重懸在結(jié)合緩沖液中。取100 μl細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到5 ml培養(yǎng)管中，每管中加入FITC偶聯(lián)的AnnexinV 5 μl以及 PI 5 μl?；靹蚣?xì)胞，避光孵育 15 min。每管中加入400 μl結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用FlowJo 8.0軟件分析，計(jì)算FITC陽性細(xì)胞百分比。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

細(xì)胞周期檢測(cè)：每個(gè)濃度組計(jì)數(shù)106個(gè)細(xì)胞，離心并將其重新混懸在0.3 ml PBS緩沖液中。向細(xì)胞中逐滴加入0.7 ml冰無水乙醇以固定細(xì)胞，同時(shí)不斷振蕩混勻，置冰上1 h。1 200×g離心5 min去除固定液，用冰PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次。將細(xì)胞重新溶于500 μl PI溶液中，在室溫下避光孵育60 min。加入3 ml PBS緩沖液，室溫下1 200×g離心5 min。將上清液小心移除，并將細(xì)胞重新混懸在500 μl PBS中。用流式細(xì)胞儀PE/PI通道進(jìn)行分析，計(jì)算G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞所占的比例。重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

五、實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

分別取 0.6、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組，10 μmol/L姜黃素組，聯(lián)合組及對(duì)照組培養(yǎng)24 h的Hut78細(xì)胞4×105個(gè)，離心棄上清液，加入Trizol?Reagent提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，加入相應(yīng)目的基因的引物，各引物序列見表 1。采用powerSYBR?GreenPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，同時(shí)擴(kuò)增GAPDH基因作為定量PCR的內(nèi)參對(duì)照。各目的基因mRNA的表達(dá)值=（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值）/內(nèi)參基因Ct值×104，每個(gè)樣本分別重復(fù)3管，取均值為最終結(jié)果。

表1 凋亡相關(guān)基因Fas、NF-κB p65、caspase 8，細(xì)胞周期相關(guān)基因P21、CDK2、CyclinE和內(nèi)參GAPDH的引物序列

六、Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)

分別取 0.6、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組，10 μmol/L姜黃素組，聯(lián)合組及對(duì)照組培養(yǎng)24 h的Hut78細(xì)胞107個(gè)，離心棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入蛋白裂解液，混勻。4℃振蕩孵育1 h，4℃18 000×g離心10 min。收集上清液，采用BSA法蛋白定量試劑盒，對(duì)待測(cè)蛋白進(jìn)行蛋白定量。取一定體積的總蛋白，加入5×蛋白電泳上樣緩沖液，充分混勻后，水浴99℃變性5min。加樣孔注入等量20μg總蛋白和5 μl marker，80 V 恒壓 30 min 后，120 V 恒壓 SDSPAGE電泳90 min。200 mA 120 min將電泳條帶電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%BSA封閉1 h后，分別加入一抗1∶1 000稀釋兔抗人Fas多克隆抗體、1∶800稀釋兔抗人caspase8多克隆抗體、1∶800稀釋兔抗人NF-κB p65多克隆抗體、1∶1 000稀釋鼠抗人P21單克隆抗體、1∶1 000稀釋鼠抗人CDK2單克隆抗體、1∶1 000稀釋兔抗人GAPDH單克隆抗體4℃過夜。TBST洗滌后加入1∶2 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗，室溫孵育0.5 h，TBST漂洗，加入顯色底物顯色3 min。

圖1 西達(dá)本胺和姜黃素單用或聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞體外增殖的影響 24、48、72 h，與對(duì)照組相比，各濃度西達(dá)本胺組、姜黃素組和西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素組的細(xì)胞增殖均有不同程度降低，西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)。24 h時(shí)，聯(lián)合組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用與1.2 μmol/L西達(dá)本胺組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在48、72 h時(shí)，聯(lián)合組比1.2 μmol/L西達(dá)本胺組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制明顯加強(qiáng)

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、西達(dá)本胺和姜黃素對(duì)Hut78細(xì)胞體外增殖的影響

如圖 1所示，與對(duì)照組相比，0.3、0.6、1.2、2.4μmol/L西達(dá)本胺組、10 μmol/L姜黃素組、聯(lián)合組的細(xì)胞增殖均有不同程度降低。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，各處理組細(xì)胞增殖的A值隨時(shí)間變化的趨勢(shì)（F=564.966，P＜0.001），且不同處理對(duì)細(xì)胞的增殖抑制差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=266.558，P＜0.001）。LSD-t檢驗(yàn)顯示，24h時(shí)，聯(lián)合組細(xì)胞增殖的A值與1.2μmol/L西達(dá)本胺組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.499），但低于10 μmol/L姜黃素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。48h時(shí)，聯(lián)合組細(xì)胞增殖A值低于1.2μmol/L西達(dá)本胺及10 μmol/L姜黃素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），而1.2 μmol/L西達(dá)本胺組顯著低于10 μmol/L姜黃素組（P＜0.001）。72 h時(shí)，聯(lián)合組細(xì)胞增殖的A值仍低于1.2 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001），且1.2 μmol/L西達(dá)本胺組細(xì)胞仍顯著低于10 μmol/L姜黃素組（P＜0.001）。

表2 西達(dá)本胺和姜黃素作用Hut78細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞周期的影響（%，±s）

表2 西達(dá)本胺和姜黃素作用Hut78細(xì)胞24 h后對(duì)細(xì)胞周期的影響（%，±s）

注：n=3。聯(lián)合組為1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素

組別 G0/G1期 S期 G2/M期0.6 μmol/L西達(dá)本胺 53.96±5.06 34.13±4.04 12.59±2.53 1.2 μmol/L西達(dá)本胺 63.36±5.95 25.38±2.86 10.83±2.47 10 μmol/L姜黃素 55.90±3.11 32.64±3.33 11.30±1.25聯(lián)合組 69.72±5.57 22.90±1.62 6.22±2.16對(duì)照組 40.80±5.18 40.84±4.11 18.28±1.92 F值 22.476 18.219 19.492 P值＜0.01＜0.01＜0.01

二、西達(dá)本胺和姜黃素對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡影響

0.6、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組、10 μmol/L 姜黃素組、聯(lián)合組、對(duì)照組凋亡細(xì)胞比例分別為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=186.324，P=0.00）。兩兩比較顯示，0.6、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組、10 μmol/L 姜黃素組、聯(lián)合組的凋亡細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組（均P＜0.01）；而 0.6 μmol/L 西達(dá)本胺組與 1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組、10 μmol/L姜黃素組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；1.2 μmol/L西達(dá)本胺組凋亡細(xì)胞比例明顯高于 10 μmol/L姜黃素組（P＜0.01）；聯(lián)合組的凋亡細(xì)胞比例均高于0.6、1.2 μmol/L西達(dá)本胺組、10 μmol/L姜黃素組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）。見圖 2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)西達(dá)本胺和姜黃素單用或聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡的影響 各組Hut78細(xì)胞處理24 h后，西達(dá)本胺及姜黃素均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素組對(duì)細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用最強(qiáng)

三、西達(dá)本胺和姜黃素對(duì)Hut78細(xì)胞周期影響

0.6、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺，10 μmol/L 姜黃素，聯(lián)合組及對(duì)照組分別作用Hut78細(xì)胞24 h后，G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例及G2/M期細(xì)胞比例明顯降低（均P＜0.05）。聯(lián)合組和1.2 μmol/L西達(dá)本胺組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于0.6 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組，而其S期細(xì)胞比例及G2/M期細(xì)胞比例明顯低于0.6 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.05）。而聯(lián)合組與1.2 μmol/L 西達(dá)本胺組，0.6 μmol/L 西達(dá)本胺組與10 μmol/L姜黃素組各細(xì)胞周期比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

四、西達(dá)本胺和姜黃素對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

0.6、1.2 μmol/L 西達(dá)本胺，10 μmol/L 姜黃素，聯(lián)合組及對(duì)照組分別作用Hut78細(xì)胞24 h后，凋亡相關(guān)基因 Fas、caspase 8、NF-κB p65，細(xì)胞周期相關(guān)基因P21、CDK2、CyclinE mRNA的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為265.439、121.476、67.340、487.653、59.129、34.385，均P＜0.01）。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組 Fas、caspase 8、P21 mRNA 的表達(dá)均明顯增加，而 NF-κB p65、CDK2、CyclinE mRNA 的表達(dá)明顯降低（均P＜0.05）。聯(lián)合組和1.2 μmol/L西達(dá)本胺組Fas、caspase 8、P21 mRNA的表達(dá)明顯高于0.6 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001），而其 NF-κB p65、CDK2、CyclinE mRNA的表達(dá)均明顯低于0.6 μmol/L西達(dá)本胺組和10 μmol/L姜黃素組（均P＜0.001）。聯(lián)合組 Fas mRNA的表達(dá)明顯高于1.2 μmol/L西達(dá)本胺組（P＜0.001）， 而 caspase 8、P21、NF-κB p65、CDK2、CyclinE mRNA的表達(dá)與1.2 μmol/L西達(dá)本胺組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。0.6 μmol/L西達(dá)本胺組與10 μmol/L姜黃素組相比，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期各相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖3。

圖3 西達(dá)本胺和姜黃素單用或聯(lián)合對(duì)Hut78細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的影響 1～5分別為對(duì)照組、0.6 μmol/L西達(dá)本胺組、1.2 μmol/L西達(dá)本胺組、10 μmol/L姜黃素組，1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素組。與對(duì)照組及各單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合組顯著增強(qiáng)了Fas、caspase 8、P21 mRNA 的表達(dá)，抑制了 NF-κB p65、CDK2、CyclinE mRNA 的表達(dá)

五、西達(dá)本胺和姜黃素對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照組相比，0.6、1.2 μmol/L西達(dá)本胺，1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素分別作用 Hut78細(xì)胞 24 h 后，F(xiàn)as、caspase 8、P21 蛋白的表達(dá)明顯增加，而 NF-κB p65、CDK2、CyclinE蛋白的表達(dá)明顯降低。

圖4 西達(dá)本胺和姜黃素對(duì)Hut78細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響 1～4分別為對(duì)照組、0.6、1.2 μmol/L西達(dá)本胺組、1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素組。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組作用Hut78細(xì)胞24 h后，F(xiàn)as、caspase 8、P21蛋白條帶灰度逐漸增加，NF-κB p65、CDK2、CyclinE 蛋白條帶灰度逐漸減弱，GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照。與對(duì)照組和各單獨(dú)用藥組相比，1.2 μmol/L西達(dá)本胺聯(lián)合10 μmol/L姜黃素顯著增強(qiáng)了Fas、caspase 8、P21蛋白表達(dá)，抑制了NF-κB p65、CDK2、CyclinE 的蛋白表達(dá)

討 論

近年來，表觀遺傳學(xué)調(diào)控藥物-HDAC-Ⅰ逐漸應(yīng)用于MF的治療［6］。HDAC-Ⅰ可以通過上調(diào)染色質(zhì)中組蛋白的乙?；交罨虮磉_(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［1］。非選擇性HDAC-I伏立諾他（vorinostat）是針對(duì)HDAC表觀遺傳的小分子藥物，現(xiàn)已被美國FDA批準(zhǔn)用于CTCL的治療。臨床試驗(yàn)顯示，口服伏立諾他對(duì)2次系統(tǒng)治療失敗的CTCL患者總體有效率可達(dá)到29%和42%，患者的瘙癢和生活質(zhì)量也顯著改善［7-8］。西達(dá)本胺是選擇性HDAC抑制劑，與伏立諾他相比，它可特異性地針對(duì)與腫瘤發(fā)生和發(fā)展高度相關(guān)的第Ⅰ大類 HDAC 亞型，主要抑制 HDAC2和HDAC3［3］，具有高抗癌活性和低毒性。有研究［9］顯示，西達(dá)本胺能通過誘導(dǎo)P21表達(dá)明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，且呈濃度和時(shí)間依賴性，并且能協(xié)同增加吉他西濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和增殖抑制。Dong等［10］用西達(dá)本胺對(duì)進(jìn)展期實(shí)體腫瘤Ⅰ期進(jìn)行臨床研究，結(jié)果顯示31例實(shí)體腫瘤中的5例非霍奇金淋巴瘤有4例達(dá)到部分緩解，部分緩解率達(dá)90%。我們的研究顯示，西達(dá)本胺作用Hut78細(xì)胞后，可明顯抑制細(xì)胞增殖并呈時(shí)間和濃度依賴性，還可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期抑制，呈明顯的濃度依賴性。

細(xì)胞表面的死亡受體Fas是細(xì)胞凋亡的主要受體，當(dāng)死亡配體FasL表達(dá)增加并與Fas結(jié)合，或者細(xì)胞受到某種刺激其表面Fas表達(dá)增加并與FasL結(jié)合，都可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路的激活，然后凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路中的caspase 8被剪切活化，從而激活下游的效應(yīng)caspase引起DNA鏈斷裂等一系列的細(xì)胞凋亡反應(yīng)［11］。NF-κB與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。大量研究表明，NF-κB激活能夠阻斷細(xì)胞死亡通路，保護(hù)細(xì)胞免于TNF和其它凋亡刺激因子誘導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)［12］。本研究顯示，西達(dá)本胺在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)可引起凋亡相關(guān)基因Fas、caspase 8表達(dá)的升高，及NF-κB p65表達(dá)的降低。P21是細(xì)胞周期中非常重要的負(fù)性調(diào)節(jié)子，通過抑制CDK1和CDK2的活性而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制［13］。本研究顯示，西達(dá)本胺在導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞周期停滯的同時(shí)，引起細(xì)胞周期相關(guān)基因P21表達(dá)的升高和細(xì)胞周期正性調(diào)節(jié)基因CDK2和CyclinE表達(dá)的降低。因此，我們推測(cè)，西達(dá)本胺可能通過上調(diào)Hut78細(xì)胞表面的Fas表達(dá)觸發(fā)了細(xì)胞的FasL-Fas細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，并同時(shí)通過上調(diào)負(fù)性細(xì)胞周期相關(guān)基因P21的表達(dá)進(jìn)而抑制CDK2和CyclinE的活性表達(dá)，從而引起細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的抑制。

姜黃素是從植物姜黃的根莖中分離的天然黃色顏料，在很多腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡。人體臨床試驗(yàn)［4］顯示，當(dāng)姜黃素的劑量達(dá)到12 g/d時(shí)也不存在劑量限制性毒性，并揭示姜黃素可通過抑制NF-κB信號(hào)選擇性誘導(dǎo)CTCL細(xì)胞凋亡。在CTCL中，NF-κB的活性對(duì)細(xì)胞存活和對(duì)凋亡抵抗是必須的［14-15］。本研究顯示，與單用西達(dá)本胺相比，西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素對(duì)Hut78細(xì)胞的增殖抑制、凋亡誘導(dǎo)和周期抑制作用更加明顯，并對(duì)凋亡相關(guān)基因Fas、caspase 8表達(dá)的升高，NF-κB p65表達(dá)的降低和細(xì)胞周期相關(guān)基因P21表達(dá)的升高，CDK2和CyclinE表達(dá)的降低作用均明顯高于單用西達(dá)本胺，顯示西達(dá)本胺聯(lián)合姜黃素能明顯提高抑制CTCL細(xì)胞系Hut78的生長(zhǎng)率。

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Effects of chidamide combined with curcumin on human cutaneous T-cell lymphoma cell line Hut78 and their molecular mechanisms

Gu Xiaoguang,Wu Fangni,Zhang Qian,Zhang Chunlei
Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of chidamidecombined with curcumin on the proliferation of cutaneous T-cell lymphoma（CTCL）cell line Hut78,as well as their promotive effect on its apoptosis,and to explore their therapeutic mechanisms in CTCL.MethodsSome Hut78 cells were treated with different concentrations of chidamide（0.3,0.6,1.2,2.4 μmol/L）and 10 μmol/L curcumin alone or the combination of 1.2 μmol/L chidamide and 10 μmol/L curcumin for 24,48 and 72 hours separately.MTS assay was conducted to estimate cell viability at each time point.After selection of chidamide concentrations,some Hut78 cells were treated with chidamide （0.6 and 1.2 μmol/L）and curcumin（10 μmol/L）alone or in combination（1.2 μmol/L chidamide and 10 μmol/L curcumin）for 24 hours,then,flow cytometry was performed to detect cell apoptosis and analyze cell cycle,real-time（RT）-PCR and Western-blot analysis were conducted to quantify the mRNA and protein expressions of apoptosis-associated genes Fas,caspase 8,nuclear factor（NF）-κB p65 as well as cell cycle-associated genes P21,CDK2 and cyclin E respectively.Statistical analysis was carried out by repeated-measures analysis of variance,one-way analysis of variance and the least significant difference （LSD）-ttest.ResultsChidamide could significantly inhibit the proliferation of Hut78 cells in a dosedependent and time-dependent manner（F=266.558,564.966,respectively,bothP＜0.001）.After 48-and 72-hour culture,the combination of 1.2 μmol/L chidamide and 10 μmol/L curcumin showed significantly stronger inhibitory effect on cell proliferation compared with 1.2 μmol/L chidamide or 10 μmol/L curcumin alone （allP＜0.001）.As flow cytometry showed,the percentage of apoptotic cells was significantly higher in the combined treatment group than in the 0.6-,1.2-μmol/L chidamide groups and 10-μmol/L curcumin group （allP＜0.001）.Compared with the 0.6-μmol/L chidamide group and 10-μmol/L curcumin group,the combined treatment group and 1.2-μmol/L chidamide group both showed significantly increased proportion of cells at G0/G1 phase and mRNA expressions of Fas,caspase 8 and P21,but decreased proportion of cells at S phase or G2/M phase and mRNA expressions of NF-κB p65,CDK2 and cyclin E （P＜0.05 for proportion of cells at different phases,P＜0.001 for mRNA expressions of different genes）.Furthermore,the mRNA expression of Fas was significantly higher in the combined treatment group than in the 1.2-μmol/L chidamide group （P＜0.001）,while no significant differences were observed in the mRNA expressions of caspase 8,P21,NF-κB p65,CDK2 and cyclin E or the proportion of cells at any phase between the combined treatment group and 1.2-μmol/L chidamide group （allP＞ 0.05）.Western-blot analysis showed that protein expressions of Fas,caspase 8 and P21 significantly increased,but those of NF-κB p65,CDK2 and cyclin E significantly decreased in the combined treatment group compared with the 0.6-,1.2-μmol/L chidamide groups and blank control group receiving no treatment,which were in accordance with the above changes in mRNA expressions of these genes.ConclusionChidamide can inhibit the growth of the CTCL cell line Hut78 by directly decelerating cell proliferation and inducing cell apoptosis,and the combibation with curcumin can markedly enhance the inhibitory effect of chidamide on the growth of Hut78 cells.

Lymphoma,T-cell,cutaneous;Curcumin;Cell proliferation;Apoptosis;Chidamide;Hut-78 cell

Zhang Chunlei,Email：zhangchunleius@163.com

2015-04-09）

（本文編輯：周良佳 顏艷）

張春雷，Email：zhangchunleius@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.008

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