高效液相色譜法同時測定滋肝益氣丸中槲皮素和丹皮酚含量

童學(xué)飛，吳雪，楊智海

（1.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院神農(nóng)武當(dāng)中醫(yī)藥研究所，湖北十堰442012；2.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院肝病科，湖北十堰442012）

高效液相色譜法同時測定滋肝益氣丸中槲皮素和丹皮酚含量

童學(xué)飛1，吳雪1，楊智海2

（1.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院神農(nóng)武當(dāng)中醫(yī)藥研究所，湖北十堰442012；2.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院肝病科，湖北十堰442012）

目的建立同時測定滋肝益氣丸中槲皮素和丹皮酚含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為InertSustain C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 m），流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50），檢測波長為0～18.00 min時360 nm，18.01～25.00 min時274 nm，柱溫為30℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 L。結(jié)果槲皮素質(zhì)量濃度在20～100 g/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.87%，RSD為1.15%（n=5）；丹皮酚質(zhì)量濃度在6～30 g/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99.85%，RSD為1.02%（n=5）。結(jié)論該方法簡便可靠，重復(fù)性好，基本可用于滋肝益氣丸的質(zhì)量控制。

槲皮素；丹皮酚；滋肝益氣丸；高效液相色譜法；含量測定

滋肝益氣丸為醫(yī)院傳統(tǒng)院內(nèi)制劑（鄂藥制字Z20111468），是由金錢草、牡丹皮、白芍、板藍(lán)根、川芎等多味中藥制成的復(fù)方制劑，具有滋肝益氣、清利濕熱、消瘀導(dǎo)滯之功效，臨床主要用于治療乙型肝炎、早期肝硬化等。金錢草味苦、酸，性微寒，關(guān)于其化學(xué)成分的系統(tǒng)研究報道較少，綜合相關(guān)研究得出金錢草中含有酚性成分、黃酮類等。槲皮素及其衍生物是植物界分布廣泛且有多種生物活性的黃酮類化合物，近年來發(fā)現(xiàn)槲皮素有抗多種病毒的作用。金錢草乙醇提取物對抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物雷公藤多苷（TG）所致急性肝損傷具有保護(hù)作用，其保肝活性與其所含槲皮素的量有關(guān)［1-3］。牡丹皮不僅對四氯化碳和乙醇引起的小鼠干燥氧化損傷具有保護(hù)作用，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎性反應(yīng)，對卡介苗（BCG）+脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷也有一定保護(hù)作用。從牡丹皮中分離得到的化學(xué)成分較多，主要是以丹皮酚為母核所衍生的一系列苷類化合物，且含量較高。近年來，丹皮酚的藥理作用研究日趨深入，它被公認(rèn)為牡丹皮的主要藥效成分，丹皮酚對抗結(jié)核藥異煙肼和利福平所致的肝毒性有保護(hù)作用［4-6］。金錢草和牡丹皮為滋肝益氣丸中的君藥，為了更好地控制其質(zhì)量，確保臨床用藥安全有效，采用高效液相色譜法測定其中槲皮素和丹皮酚的含量。

1　儀器與試藥

1.1儀器

島津LC-2030型高效液相色譜儀，紫外檢測器（島津企業(yè)管理＜中國＞有限公司）。

1.2試藥

滋肝益氣丸（十堰市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號分別為20150726，20150816，20151011）；槲皮素對照品（批號為15090717）、丹皮酚對照品（批號為110708-201407）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；磷酸，純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）；檢測波長：0～18.00 min時360 nm，18.01～25.00 min時274 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.2溶液制備

供試品溶液：取滋肝益氣丸粉末約5 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，收集續(xù)濾液即得。

對照品溶液：分別精密稱取丹皮酚對照品3.0 mg和經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12 h后的槲皮素對照品10.0 mg，各置100 mL容量瓶中，加甲醇適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制得每1 mL含丹皮酚30 μg的對照品溶液及每1 mL含槲皮素100 μg的對照品溶液。

陰性對照品溶液：按處方分別除去金錢草和牡丹皮，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取每1 mL含槲皮素對照品100 μg、含丹皮酚對照品30 μg的對照品溶液各2，4，6，8，10 mL，定容至10 mL容量瓶中，各進(jìn)樣10 μL，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程槲皮素為A=197 320 C+35 710，r= 0.999 8；丹皮酚為A=762 950 C-31 120，r=0.999 9。結(jié)果槲皮素質(zhì)量濃度在20～100 μg/mL范圍內(nèi)，丹皮酚質(zhì)量濃度在6～30 μg/mL范圍與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：分別精密吸取每1 mL含槲皮素對照品100 μg的對照品溶液和每1 mL含丹皮酚對照品30 μg的對照品溶液各10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為0.62%（n=5），丹皮酚峰面積的RSD為0.69%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取批號為20150816的樣品5份，依法制備供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，測定樣品中槲皮素和丹皮酚的含量。結(jié)果的RSD分別為1.41%和1.13%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取批號為20150816的樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時進(jìn)樣10 μL，測定。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為0.51%（n=7），丹皮酚峰面積的RSD為0.70%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取批號為20150816的滋肝益氣丸5份，分別精密加入每1 mL含槲皮素對照品100 μg的對照品溶液5 mL，精密加入每1 mL含丹皮酚對照品30 μg的對照品溶液10 mL，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣測定，并計算回收率，結(jié)果見表1。

圖1　高效液相色譜圖

表1　槲皮素及丹皮酚加樣回收試驗結(jié)果（n=5）

2.4樣品含量測定

取批號分別為20150726，20150816，20151011的滋肝益氣丸3份，按擬訂方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測定槲皮素及丹皮酚的含量。結(jié)果見表2。

表2　樣品中槲皮素及丹皮酚含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

3　討論

3.1提取溶劑選擇

因本品為丸劑，采用超聲30 min的方法提取，結(jié)果提取效果較好，干擾成分較少，且牡丹皮中的丹皮酚已基本提盡［7-8］。在選擇過程中，比較了水、50%甲醇和甲醇3種溶劑的提取效果，經(jīng)高效液相色譜法分析，甲醇提取得到的供試品溶液目標(biāo)樣品峰響應(yīng)值大，雜質(zhì)干擾小，提取率高，故選用甲醇為提取溶劑。由于丹皮酚具有揮發(fā)性，應(yīng)避光冷藏保存，在試驗中供試品溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)用［9］。

3.2測定波長選擇

經(jīng)紫外分光光度計掃描，槲皮素在254 nm和360 nm波長處有最大吸收，經(jīng)高效液相色譜法測定比較，當(dāng)測定波長為360 nm時，供試品溶液色譜中峰形較好，雜質(zhì)干擾較少，故選擇360 nm為測定波長［10］。而丹皮酚的最大吸收波長為274 nm，兩者最大吸收波長不一致，因此經(jīng)反復(fù)探索，在測定過程中，0～18.00 min采用360 nm，18.01～25.00 min采用274 nm作為測定波長，使槲皮素和丹皮酚在相同測定條件下均能達(dá)到最大吸收。

3.3流動相選擇

對于滋肝益氣丸中的丹皮酚，甲醇-水即能實現(xiàn)很好的分離，但槲皮素會出現(xiàn)拖尾峰，故更換流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液，此時槲皮素和丹皮酚峰形均良好。

在本試驗過程中，探索高效液相色譜法同時測定滋肝益氣丸中槲皮素和丹皮酚含量的色譜條件，槲皮素和丹皮酚峰形良好，保留時間適宜，能與雜質(zhì)實現(xiàn)基線分離，分離度良好。該分析方法簡便可靠、重復(fù)性好，基本可用于滋肝益氣丸的質(zhì)量控制。

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Simultaneous Content Determination of Quercetin and Paeonol in Ziganyiqi Pills by HPLC

Tong Xuefei1，Wu Xue1，Yang Zhihai2
（1.Shennong Wudang Institute of TCM，Shiyan TCM Hospital，Shiyan，Hubei，China442012；2.Department of Liver，Shiyan TCM Hospital，Shiyan，Hubei，China442012）

ObjectiveHPLC was used to determinate the contents of quercetin and paeonol in Ziganyiqi pills.M ethodsThe analysis was performed on InertSustain C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），the detection was with a mobile phase of methanol-0.4% phosphoric acid solution（50∶50）at the flow rate of 1 mL/min by isocratic elution，the detection wavelength was 360 nm in 0-18.00 min and 274 nm in 18.01-25.00 min，and the column temperature was 30℃.ResultsThe calibration curve of quercetin an paeonol showed good linear relationship in the range of 20-100 μg/mL and 6-30 μg/mL，respectively.And the average recovery was 99.87%，RSD=1.15%（n=5）for quercetin，and 99.85%，RSD=1.02%（n=5）for paeonol.ConclusionThe method is simple reliable and reproducible for the quality control of Ziganyiqi pills.

quercetin；paeonol；Ziganyiqi pills；HPLC；content determination

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2016）16－0067－03

2014年湖北省十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目，項目編號：14K71。

童學(xué)飛（1975-），男，漢族，湖北鄂州人，碩士研究生，副主任藥師，研究方向為中藥材及其制劑質(zhì)量控制，（電子信箱）13797822055@163.com；楊智海（1973-），男，漢族，河南林州人，大學(xué)本科，副主任醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療肝病，本文通訊作者，（電子信箱）syyzh2005@tom.com。

（2016－05－01）