貫葉金絲桃有效成分提取工藝研究

羅旭，唐小龍，楊宋琪，陳海燕，柯瀟

（四川濟(jì)生堂藥業(yè)有限公司，四川成都611930）

貫葉金絲桃有效成分提取工藝研究

羅旭，唐小龍，楊宋琪，陳海燕，柯瀟

（四川濟(jì)生堂藥業(yè)有限公司，四川成都611930）

目的優(yōu)化貫葉金絲桃中有效成分的提取工藝。方法采用正交試驗(yàn)法，以金絲桃苷、黃酮總量（蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素）、干浸膏收率為考察指標(biāo)，考察加乙醇量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素，優(yōu)選貫葉金絲桃的最佳提取工藝。結(jié)果貫葉金絲桃最佳提取工藝為提取2次，一煎加10倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，二煎加8倍量70%乙醇，每次煎煮1 h。結(jié)論該提取工藝對(duì)金絲桃苷及總黃酮有效成分的提取率高，重復(fù)性好，穩(wěn)定可行。

舒肝解郁膠囊；貫葉金絲桃；正交試驗(yàn)；金絲桃苷；高效液相色譜法

舒肝解郁膠囊為我國首個(gè)治療輕、中度抑郁癥的中成藥，主要功能為疏肝解郁、健脾安神，貫葉金絲桃為其主要成分之一。2015年版《中國藥典（一部）》貫葉金絲桃質(zhì)量控制指標(biāo)為金絲桃苷?，F(xiàn)代文獻(xiàn)報(bào)道，貫葉金絲桃主要含黃酮類、苯駢二蒽酮類、間苯三酚類、揮發(fā)油類、香豆素等多種化學(xué)成分，其中黃酮類以蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等為主要存在形式，也是主要的黃酮類化學(xué)成分［1-2］。現(xiàn)代藥理研究證明，貫葉金絲桃黃酮類化學(xué)成分是舒肝解郁膠囊抗抑郁的主要活性成分之一［3-4］。本研究中利用正交試驗(yàn)法，采用高效液相色譜（HPLC）法，在同一色譜條件下測(cè)定金絲桃苷、黃酮總量（金絲桃苷、蘆丁、異槲皮苷、槲皮素），并結(jié)合干浸膏得率作為主要考察指標(biāo)，對(duì)貫葉金絲桃的提取工藝進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀，Agilent Chemstation化學(xué)工作站（美國安捷倫公司）；BP-211D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ250DE型超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司）。

1.2試藥

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)為100080-201409，供含量測(cè)定用，純度為91.9%），金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)為111521-201406，供含量測(cè)定用，純度為92.5%），異槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)為111809-201403，供含量測(cè)定用，純度為92.9%），槲皮素對(duì)照品（批號(hào)為100081-201408，供含量測(cè)定用，純度為99.1%），以上對(duì)照品均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈（美國Fisher公司）為色譜純；水為超純水；甲醇、乙醇、磷酸等為分析純；貫葉金絲桃藥材采于甘肅禮縣，由成都康弘藥業(yè)集團(tuán)國家企業(yè)技術(shù)中心葉亮教授鑒定為藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericum perforatum L.的干燥地上部分（批號(hào)分別為151101，151102，151103，151104）。

2　方法與結(jié)果

2.1含量測(cè)定［5-6］

2.1.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B，0～26 min時(shí)A 16%，B 84%；26～40 min時(shí)A 16%→65%，B 84%→35%；檢測(cè)波長為360 nm。理論板數(shù)（N）按金絲桃苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.1.2溶液制備

對(duì)照品溶液：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素各30 μg的混合溶液，即得。

供試品溶液：取本品工藝下浸膏約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素混合對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度依次為0.324，0.232， 0.321，0.344 mg/mL），用移液管精密量取0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取5 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為Y=1 623.3 X+1.691 2，r=0.999 9；Y=2 174.4 X-1.766 7，r=0.999 9；Y=2 188.6 X+ 1.865 0，r=0.999 9；Y=3 845.3X+31.650，r=0.999 9。結(jié)果表明，進(jìn)樣量蘆丁在0.081～1.62 μg范圍內(nèi)，金絲桃苷在0.058～1.16 μg范圍內(nèi)，異槲皮苷在0.081～1.62 μg范圍內(nèi)，槲皮素在0.086～1.72 μg范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1　高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述混合對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定峰面積。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.10%，0.15%，0.14%，0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取貫葉金絲桃浸膏粉樣品，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，測(cè)定峰面積。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.41%，1.32%，1.36%，1.45%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)，測(cè)定峰面積。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.21%，0.18%，0.24%，0.19%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取本品已知含量的浸膏粉樣品，研細(xì)，取約0.1 g，共6份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入相應(yīng)的對(duì)照品適量，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.1.4樣品含量測(cè)定

按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，精密吸取5 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的百分含量，并計(jì)算黃酮總量。結(jié)果見表2。

表2　含量測(cè)定結(jié)果（%）

2.2提取工藝正交試驗(yàn)［7-9］

取同一批貫葉金絲桃藥材（批號(hào)為151101）4.5 kg，分成9批，每批0.5 kg，粉碎成粗粉，用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇加熱回流提取，過濾，減壓濃縮，回收乙醇，干燥，得貫葉金絲桃提取物，稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率，同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。以金絲桃苷含量、黃酮總量及出膏率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。根據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，提取前應(yīng)先浸泡0.5 h，再選擇乙醇量（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）4個(gè)試驗(yàn)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，按L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平、正交試驗(yàn)結(jié)果、方差分析分別見表3、表4、表5。

表3　正交試驗(yàn)因素水平表

2.3數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)指標(biāo)為金絲桃苷和總黃酮，并兼顧出膏率，故分別對(duì)金絲桃苷含量、黃酮總含量、出膏率進(jìn)行方差分析，并用綜合評(píng)分法進(jìn)行分析和比較。綜合評(píng)分計(jì)算方法：以得率最大者為100%，將其他組別結(jié)果換算為最高值的百分比，以出膏率、金絲桃苷含量和黃酮總量權(quán)重分別占30%，35%，35%的比例進(jìn)行相加后所得的值。

由表4可見，各影響效果依次為D＞B＞A＞C。由表5可見，因素D提取次數(shù)有顯著性差異（P＜0.05），其他因素?zé)o顯著性差異。綜合分析得最佳工藝為A2B2C3D2，即每次加10倍量70%乙醇，煎煮1.5 h，提取2次。由于乙醇量和提取時(shí)間不是顯著性因素，根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況，最終確定貫葉金絲桃提取2次，一煎加10倍量70%乙醇，二煎加8倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，每次煎煮1 h。

表4　L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

表5　方差分析結(jié)果

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

為確定工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，取3批貫葉金絲桃藥材（批號(hào)分別為151102，151103，151104），對(duì)以上工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表6?？梢姡斯に嚪€(wěn)定可靠，合理可行。

表6　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

本試驗(yàn)中采用正交優(yōu)化試驗(yàn)法，以金絲桃苷含量、黃酮總量和出膏率的加權(quán)平均進(jìn)行綜合評(píng)分，以加醇量、乙醇濃度、提取次數(shù)和提取時(shí)間為因素優(yōu)選貫葉金絲桃的提取工藝。對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析表明，提取次數(shù)對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)分有顯著性影響（P＜0.05），而乙醇量、乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)分無顯著性影響。因此，最終優(yōu)選工藝為提取2次，一煎加10倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，二煎加8倍量70%乙醇，每次煎煮1 h。驗(yàn)證結(jié)果表明，該工藝合理、穩(wěn)定、可靠。

采用乙腈-磷酸系統(tǒng)，在同一色譜條件下梯度洗脫，對(duì)貫葉金絲桃中的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果證明，該4個(gè)黃酮類成分分離度好，峰形尖銳，對(duì)稱性好，理論板數(shù)高。同時(shí)證明該含量測(cè)定方法也適用于舒肝解郁膠囊成品中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的含量測(cè)定。

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Process of Extracting Effective Ingredients of Hypericum Perforatum

Luo Xu，Tang Xiaolong，Yang Songqi，Chen Haiyan，Ke Xiao
（Sichuan Jishengtang Pharmaceutical Co.Ltd.，Chengdu，Sichuan，China611930）

ObjectiveTo optimize the extraction technology of active ingredients inHypericum perforatum.MethodsOrthogonal test method was used.Hyperin，total flavonoids（rutin，hyperoside，isoquercitrin，quercetin），dry extract yield were the indexes，and the amount of ethanol，ethanol concentration，extraction time，extraction times were observed for the optimized extraction technology of Hypericum perforatum.ResultsThe optimum extraction was extracted twice，added 10 times the amount of 70%ethanol in the first decocting，soaked for 0.5 h，added 8 times the amount of 70%ethanol in the second decocting，each time decocting 1 h.ConclusionThe extraction rate of total flavonoids and hyperoside in this extraction technology is high，and the method is reproducible，stable and feasible.

Shugan Jieyu Capsules；hypericum perforatum；orthogonal test；hyperin；HPLC

TQ461；R284．2；R282．71

A

1006－4931（2016）16－0030－05

四川省重大產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)，項(xiàng)目編號(hào)：2012CD00082；四川科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：2012SC0029。

羅旭（1980-），男，大學(xué)本科，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電話）028-64287669（電子信箱）lx99346@163.com；柯瀟（1983-），男，碩士研究生，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幮滤帲疚耐ㄓ嵶髡?，（電子信箱）Txzz@cnkh.com。

（2016－05－18）