烏飯樹葉多酚的超聲輔助提取及其抗氧化活性

陳瑞嬌

（韶關學院英東生命科學學院，廣東韶關512005）

烏飯樹葉多酚的超聲輔助提取及其抗氧化活性

陳瑞嬌

（韶關學院英東生命科學學院，廣東韶關512005）

對烏飯樹葉多酚的超聲波輔助提取最佳工藝及其抗氧化活性進行研究。結果表明：烏飯樹葉多酚超聲波輔助提取最佳工藝條件為超聲溫度75℃、超聲時間40min、料液比1∶30（g/mL），在此條件下烏飯樹葉多酚提取量可達71.01 mg/g。烏飯樹葉多酚粗提物具有一定的還原力，對DPPH自由基具有較好的清除能力，且呈現(xiàn)良好的劑量-效應關系。

烏飯樹葉；多酚；超聲波輔助提取；抗氧化活性

烏飯樹（Vaccsnium bracreatum Thunb）屬于杜鵑花科越桔屬常綠灌木，又名南燭，是一種藥食兼用的植物。全國各地均有分布，尤其以長江流域以南山區(qū)分布最多?！侗静菔斑z》中記載“南燭枝葉，味苦平，無毒，止泄除睡，堅筋益氣力，久服輕身長年，令人不饑，變白去老”。烏飯樹葉富含花青素和槲皮素為代表的植物多酚類化合物［1］，眾多的研究表明，植物多酚類化合物具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抑制心血管疾病等等［2-3］。目前對烏飯樹葉多酚類物質的提取及抗氧化活性研究報道不多，余青［4-5］研究了烏飯葉多酚的提取及抗氧化活性，其研究結果表明烏飯葉多酚含量較高并具有一定的抗氧化活性。蔡凌云［6］等認為烏飯樹葉的醇提物的抗氧化活性強于VC。本試驗以廣東本地野生烏飯樹葉為原料，對超聲波輔助提取烏飯樹葉多酚的工藝進行了優(yōu)化，并進一步研究烏飯樹葉多酚的體外抗氧化活性，以期為烏飯樹葉資源的開發(fā)利用，同時，也為開發(fā)天然的抗氧化劑提供一定的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

烏飯樹葉：8月份采集于廣東韶關南雄市全安鎮(zhèn)，在55℃下烘干，粉碎，過35目篩備用。

沒食子酸：百靈威科技有限公司；1，1-苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本東京化成工業(yè)株式會社；乙醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、磷酸、無水碳酸鈉、濃鹽酸、過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸（VC）等均為分析純。

1.2儀器設備

FW177中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；B61-Version型超聲波清洗儀：英國Jencons-pls公司；Ultrospec 2000紫外可見光分光光度計：Amersham Pharmacia Biotech公司；BP221S電子分析天平：德國Sartorius公司；HH-S28S恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠。

1.3方法

1.3.1標準曲線的制備

采用Folin-Ciocalteu比色法［7］。精密稱取10.0 mg沒食子酸標準品，加蒸餾水適量，超聲溶解，放冷，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻，即得0.1 mg/mL的沒食子酸標準品溶液。精密量取上述標準品溶液0、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，各加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得到一系列不同濃度的標準品溶液。精密量取不同濃度的標準品溶液各1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加蒸餾水3 mL，再加0.5 mL福林試劑，充分搖勻，加入0.75 mL 20%碳酸鈉溶液，混勻，以蒸餾水定容至刻度。在40℃下水浴40 min，在760 nm處測定吸光度值，以標準品溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：y=108.77x+0.002 1，R=0.999 3，x指標準品的濃度，y指吸光度。

1.3.2烏飯樹葉多酚的的超聲波輔助提取及多酚含量的測定

準確稱取烏飯樹葉粉末2.0 g置于錐形瓶中，按預設的液料比加入預設濃度的乙醇溶液，充分混合后，置于預設的提取條件下進行超聲浸提，浸提結束后，真空抽濾，收集濾液，并用蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，即得烏飯樹葉多酚提取液。精密量取1 mL提取液定容至50 mL，再精密量取l mL置10 mL容量瓶中，按照1.3.1節(jié)方法測定提取液的吸光度，將所測得的吸光度代入上述回歸方程求得其多酚質量濃度，然后再按下面公式（1）計算多酚提取量：

式中：C為提取液多酚質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為用于提取的烏飯樹葉粉末質量，g。

1.3.3超聲輔助法提取烏飯樹葉多酚的單因素試驗和正交試驗

分別以乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）、超聲溫度（25、35、45、55、65℃）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）、料液比［1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）］為影響因素，設置4個因素的不同水平，以確定相關因素對提取液中多酚含量的影響。

在單因素試驗的基礎上，以超聲溫度、超聲時間、液料比作為考察的3個因素，每因素設3個水平，進行L9（34）正交試驗來優(yōu)化提取條件。試驗因素與水平設計見表1。

表1　正交試驗因素及水平Table 1Factors and levels for orthogonal experiment

1.3.4烏飯樹葉多酚粗提物抗氧化活性的測定

稱取烏飯樹葉粉末樣品30.0 g，按1.3.3中正交試驗獲得的最佳提取工藝進行提取，提取液減壓濃縮后，置真空干燥箱減壓干燥獲得烏飯樹葉多酚粗提物。將該粗提物配制成不同質量濃度樣品溶液，以VC作為陽性對照，分別進行總還原力和DPPH自由基清除能力的測定。

1.3.4.1還原力的測定

取1 mL不同質量濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/ mL）的樣品溶液，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）溶液，混勻后于50℃水浴中保溫20 min，迅速冷卻至室溫，再加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，以4 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10 min后于700 nm波長處測吸光度。以VC（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL）為陽性對照。

1.3.4.2DPPH自由基清除率的測定

精密量取2 mL不同質量濃度（2、4、6、8、10、12 μg/ mL）的樣品溶液于10 mL試管中，加入2 mL濃度為1× 10-4mol/L的DPPH溶液，混勻，室溫避光放置30 min后，于波長517 nm處測定吸光度為Ai；另取2 mL不同質量濃度的樣品溶液與2 mL 95%乙醇混勻后測定吸光度為Aj；量取2 mL DPPH溶液加入2 mL 50%乙醇混勻后測定吸光度為A0。用同樣濃度系列的VC溶液作陽性對照。根據(jù)下面公式（2）計算DPPH自由基清除率。

2　結果與分析

2.1超聲波輔助提取烏飯樹葉多酚的單因素試驗

2.1.1乙醇濃度對烏飯樹葉多酚提取量的影響

設定料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度45℃、超聲時間30 min、提取次數(shù)1次，研究乙醇濃度對烏飯樹葉多酚提取量的影響，結果見圖1。

圖1　乙醇濃度對多酚提取量的影響Fig.1Effect of alcohol concentration on the extraction yield of polyphenols

由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，烏飯樹葉多酚提取量呈先增加后減少的趨勢，乙醇濃度在50%時多酚的提取量達到最大。這可能是由于50%乙醇溶液的極性與烏飯樹葉中多酚類物質的極性最相近，此時多酚的溶解度最高，有利于多酚的提取。因此在后續(xù)試驗中，以50%乙醇溶液來提取烏飯樹葉多酚。

2.1.2超聲溫度對烏飯樹葉多酚提取量的影響

設定乙醇濃度50%、料液比1∶20（g/mL）、超聲時間30 min、提取次數(shù)1次，研究超聲溫度對烏飯樹葉多酚提取量的影響，結果見圖2。

圖2　超聲溫度對多酚提取量的影響Fig.2Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of polyphenols

由圖2可知，當溫度較低時，烏飯樹葉多酚的提取量較低，隨著溫度的不斷升高，多酚的提取量不斷增加，當達到55℃時，提取量達最大值，繼續(xù)升溫，多酚提取量的變化不明顯。所以超聲溫度選擇55℃左右為宜。

2.1.3超聲時間對烏飯樹葉多酚提取量的影響

設定乙醇濃度50%、料液比1∶20（g/mL）、超聲溫度45℃、提取次數(shù)1次，研究超聲時間對烏飯樹葉多酚提取量的影響，結果見圖3。

圖3　超聲時間對多酚提取量的影響Fig.3Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polyphenols

從圖3可見，在10 min～40 min范圍內，隨著超聲提取時間的延長烏飯樹葉多酚提取量不斷增加，超過40 min后，多酚提取量反而呈下降趨勢。說明在提取40 min時，提取液內多酚溶解已經(jīng)達到平衡，繼續(xù)增加提取時間，由于受氧化和其他雜質的干擾，導致提取量下降。因此超聲時間控制在40 min較為合適。

2.1.4料液比對烏飯樹葉多酚提取量的影響

設定乙醇濃度50%、超聲溫度45℃、超聲30 min，提取次數(shù)1次，研究料液比對烏飯樹葉多酚提取量的影響，結果見圖4。

圖4　料液比對多酚提取量的影響Fig.4Effect of solid to liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

由圖4可知，當料液比較低時，烏飯樹葉多酚的提取量較低，隨著料液比的不斷增大，多酚提取量不斷增加，當料液比達到1∶20時，即可達到較高的多酚提取量，繼續(xù)提高溶劑用量，多酚提取量增加并不明顯，且會增加后續(xù)的分離回收工作量，因此從經(jīng)濟成本上考慮，較適宜的料液比為1∶20（g/mL）。

2.2超聲波輔助提取烏飯樹葉多酚的正交試驗結果

烏飯樹葉多酚超聲波輔助提取的正交試驗結果見表2。

表2　正交試驗設計與結果Table 2Design and results for orthogonal experiment

根據(jù)單因素試驗結果，選定50%乙醇溶液作為提取溶劑，由表2正交試驗結果分析可知，最佳提取工藝組合為A3B2C3，即超聲溫度75℃、超聲時間40 min、料液比1∶30（g/mL）。由極差分析可知，各因素對烏飯樹葉多酚提取量影響大小為料液比＞超聲時間＞超聲溫度。在正交試驗設計的9個試驗中沒有最佳提取工藝組合A3B2C3，按照此最佳提取工藝進行3次平行驗證試驗，結果烏飯樹葉多酚的平均提取量為71.01 mg/g，表明該最佳提取工藝穩(wěn)定、可靠。

2.3烏飯樹葉多酚的抗氧化能力

2.3.1烏飯樹葉多酚的還原力

烏飯樹葉多酚還原力測定結果見圖5。

圖5　烏飯樹葉多酚的還原力Fig.5Reducing power of polyphenols extracted from Vaccinium bracteatum Thunb leaves

還原力是評價物質抗氧化活性的一個重要指標，一般而言，還原力的強弱與抗氧化能力的大小呈正比。根據(jù)1.3.4.1中的方法，若樣品在700 nm波長處的吸光度越大，其還原力則越強。因此通過測定樣液的還原力來反映物質的抗氧化活性。由圖5可知，隨著烏飯樹葉多酚濃度的增加，吸光度不斷增大，也即表明其還原力不斷增強。與陽性對照VC相比，在試驗質量濃度范圍內，烏飯樹葉多酚的還原力低于同濃度的VC。當濃度為0.25 mg/mL時，其還原力是VC的52.2%。這說明烏飯樹葉多酚粗提液具有一定的還原能力。

2.3.2烏飯樹葉多酚對DPPH自由基的清除能力

烏飯樹葉多酚對DPPH自由基的清除能力見圖6。

圖6　烏飯樹葉多酚對DPPH自由基的清除作用Fig.6DPPH free radical scavenging effects of polyphenols extracted from Vaccinium bracteatum Thunb leaves

由圖6可知，烏飯樹葉多酚粗提物對DPPH自由基具有較好的清除作用，隨著濃度的增加，其對DPPH自由基的清除能力逐漸增強，說明烏飯樹葉多酚粗提物對DPPH自由基的清除能力與其濃度存在著一定的量效關系。與陽性對照VC相比，烏飯樹葉多酚粗提物對DPPH自由基的清除能力稍低于同質量濃度的VC，在最大試驗質量濃度（12 μg/mL）時，VC對DPPH自由基的清除率為57.53%，而烏飯樹葉多酚粗提物的清除率為45.8%，即烏飯樹葉多酚粗提物對DPPH自由基的清除率是VC的80%，表明烏飯樹葉多酚粗提物對DPPH自由基具有較好的清除能力。

3　結論

本研究得到了烏飯樹葉多酚超聲波輔助提取的最佳工藝：超聲溫度75℃、超聲時間40 min，料液比1∶30（g/mL），在此條件下烏飯樹葉多酚提取量為71.01 mg/g。極差分析表明，料液比這一因素對多酚提取量的影響較大。體外抗氧化試驗表明，烏飯樹葉多酚粗提物具有一定的抗氧化能力，且呈現(xiàn)良好的劑量-效應關系，與同濃度的VC相比，其還原力是VC的 52.2%，對DPPH自由基的清除率是VC的80%。由于本試驗樣品為烏飯樹葉多酚粗提物，如果進一步對多酚粗提物進行純化，提高多酚物質的純度，其抗氧化活性會得到加強。因此烏飯樹葉多酚是潛在的天然抗氧化劑資源，具有較高的研究開發(fā)價值。

［1］陳重明，張寧，王鳴.烏飯樹的民族植物學［J］.植物資源與環(huán)境，1998，7（1）：45-48

［2］尹志娜.植物多酚分離提取方法和生物功能研究進展［J］.生命科學儀器，2010，8（6）：43-49

［3］劉運榮，胡健華.植物多酚的研究進展［J］.武漢工業(yè)學院學報，2005，24（4）：63-65

［4］余清.烏飯葉多酚提取工藝的研究［J］.福建輕紡，2011（6）：27-31

［5］余清.烏飯葉多酚提取物抗氧化能力初探［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33（3）：10-11

［6］蔡凌云，石敏，夏薛梅，等.烏飯樹葉醇提物體外抗氧化活性［J］.食品科技，2011，36（6）：222-225

［7］周媛，喻玲玲，李新蘭，等.苧麻葉中總多酚的含量測定［J］.食品科技，2009，34（4）：193-197

Ultrasonic-assisted Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Vaccinium bracteatum Thunb Leaves

CHEN Rui-jiao
（Yingdong College of Biological Sciences，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

The purpose of this study was to investigate the optimum ultrasonic-assisted extraction process and antioxidant activity of polyphenols from Vaccinium bracteatum Thunb leaves.The results showed that the optimum conditions for ultrasonic-assisted extraction were determined，such as ultrasonic temperature for 75℃，ultrasonic time for 40 min，solid to liquid ratio for 1∶30（g/mL）.Under these conditions，the maximum yield of polyphenols was 71.01 mg/g.Crude extract of polyphenols from vaccinium bracteatum Thunb leaves had certain reducing power and good scavenging ability to DPPH free radical.Reducing power and scavenging ability to DPPH free radical were in apparent dose-effect relationship with the concentration of the sample.

Vaccinium bracteatum Thunb leaves；polyphenols；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.015

陳瑞嬌（1968—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：食品生物技術。

2015-12-14