苯并［a］芘對大鼠自主活動及運動協(xié)調(diào)能力的影響*

粟秋平，楊凱，涂白杰

（重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生與勞動衛(wèi)生教研室，重慶400016）

·論著·

苯并［a］芘對大鼠自主活動及運動協(xié)調(diào)能力的影響*

粟秋平，楊凱，涂白杰△

（重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生與勞動衛(wèi)生教研室，重慶400016）

目的探討苯并［a］芘（B［a］P）亞慢性染毒對大鼠自主活動及運動協(xié)調(diào)能力的影響。方法選取30只雄性SD幼鼠，鼠齡3～4 d，隨機(jī)分為空白組，溶劑組（1.00 mL/kg植物油），B［a］P染毒低劑量組（0.02 mg/kg）、中劑量組（0.20 mg/kg）及高劑量組（2.00 mg/kg），每組6只。適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后按相應(yīng)濃度持續(xù)灌胃7周。染毒結(jié)束后測量SD大鼠體質(zhì)量變化。通過記錄其在曠場實驗中的爬行總格子數(shù)、直立次數(shù)和糞便顆粒數(shù)，以及在足跡實驗中的后跟腳印軌跡等相應(yīng)指標(biāo)，評估SD大鼠自主活動及運動協(xié)調(diào)能力。結(jié)果染毒結(jié)束后，B［a］P各劑量染毒組SD大鼠生長發(fā)育遲緩，表現(xiàn)為體質(zhì)量均明顯低于空白組和溶劑組，爬行總格子數(shù)及直立次數(shù)較空白組和溶劑組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而五組大鼠在足跡實驗中步寬、步長、步態(tài)及角度變化4項參數(shù)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 B［a］P可抑制SD幼鼠的生長發(fā)育，促進(jìn)其自主活動，但對其運動協(xié)調(diào)能力作用不明顯。

苯并芘類/毒性；神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)；自主活動；運動協(xié)調(diào)能力；大鼠，Sprague-Dawley

苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，B［a］P）及其衍生物是國際公認(rèn)的化學(xué)誘變劑和人類致癌物［1］，其主要來源于有機(jī)物的不完全燃燒。B［a］P除具有致癌性外，還具有一定的神經(jīng)毒性。B［a］P可以透過血-腦屏障進(jìn)入腦組織，當(dāng)暴露于高水平時，B［a］P及其代謝物可在血液和大腦中累積［2］，從而對機(jī)體產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，可通過行為表現(xiàn)［3］。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，B［a］P的神經(jīng)毒性作用主要表現(xiàn)為對學(xué)習(xí)記憶能力的影響，而對自主活動及運動協(xié)調(diào)能力的影響研究甚少。故本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過對SD幼鼠B［a］P亞慢性染毒的觀察，進(jìn)一步探討B(tài)［a］P的神經(jīng)毒性，并初步探討其對動物自主活動及運動協(xié)調(diào)能力的影響。

1　材料與方法

1.1動物與試劑健康雄性SD幼鼠30只，鼠齡3～4 d，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。B［a］P購自美國Sigma公司（純度98%）。

1.2方法

1.2.1試劑準(zhǔn)備將B［a］P（純度98%）溶于植物油4℃超聲30 min后配制成1 mg/mL溶液備用。

1.2.2實驗動物及處理30只健康雄性SD幼鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動物房，動物房自然采光，室溫（22±2）℃，濕度（50±10）%，幼鼠自由進(jìn)食和飲水。將幼鼠按B［a］P 0.02、0.20、2.00 mg/kg隨機(jī)分為低、中、高3個劑量染毒組及空白對照組（空白組）和溶劑對照組（溶劑組），每組6只。適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后，染毒組按B［a］P低、中、高3個劑量，溶劑組按1.00 mL/kg植物油持續(xù)灌胃處理7周，空白組不做處理。動物斷乳前與母鼠一起，斷乳后分籠飼養(yǎng)，不影響實驗。每天記錄幼鼠體質(zhì)量變化及一般活動情況。

1.2.3行為學(xué)實驗灌胃染毒7周后，參照文獻(xiàn)［4-7］方法并做適當(dāng)調(diào)整，對每組SD大鼠進(jìn)行行為學(xué)實驗以檢測其自主活動及運動協(xié)調(diào)能力。

1.2.3.1曠場實驗自制長61 cm、寬41 cm、高26 cm的木箱，在底部刻出8 cm×8 cm方格35個。先讓各組SD大鼠在木箱中適應(yīng)5 min，移除木箱中的糞便，噴灑75%乙醇掩蓋氣味。每次實驗將SD大鼠輕放入木箱同一端的中間位置，記錄其1 min內(nèi)活動情況并記錄以下指標(biāo)：爬行總格子數(shù)、直立次數(shù)及排泄糞便顆粒數(shù)。每次實驗后將糞便清除，并噴灑75%乙醇。

1.2.3.2足跡實驗在測試盒的底層墊1張長60 cm、寬9 cm的吸水白紙，將SD大鼠兩后足蘸適量無毒墨水后放入盒中，使SD大鼠從紙的一端走到另一端，形成一串連續(xù)的腳印。參照文獻(xiàn)［5-6］測定以下指標(biāo)：從右側(cè)腳印中點做一條垂直于行進(jìn)方向的直線，用①表示，相鄰兩右側(cè)腳印之間的連線與①之間所形成的角為α，表示連續(xù)右側(cè)腳印連線與①之間夾角的角度變化，即計算連續(xù)各角之間差值絕對值的平均值用△α表示，從第1個右腳腳印開始計算；相鄰兩右腳印之間的距離用②表示；左右兩腳印之間的距離用③表示；β表示步態(tài)變化，用④表示，描述步態(tài)交替的均勻性，即β=0.5-③/②絕對值的平均值；步態(tài)寬度用⑤表示，是相對左右步之間的平均橫向距離，即左側(cè)腳印到右側(cè)相鄰兩腳印連線的垂直距離。步長=總共步行的距離/步數(shù)。計算腳印時前面2個和最后2個腳印不用于本實驗分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理運用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，則采用非參數(shù)Kruskal-WallisH秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1動物體質(zhì)量基本情況染毒結(jié)束后，B［a］P低、中、高各劑量染毒組SD大鼠的體質(zhì)量［（142.60±3.72）、（124.73±4.14）、（116.33±5.81）g］較空白組和溶劑組［（170.20±7.50）、（152.80±7.33）g］明顯減輕，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2動物行為學(xué)表現(xiàn)

2.2.1五組SD大鼠曠場實驗中各行為學(xué)指標(biāo)比較五組SD大鼠爬行總格子數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各劑量染毒組SD大鼠爬行總格子數(shù)分別較空白組增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與溶劑組比較，高劑量組SD大鼠爬行總格子數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。五組SD大鼠直立次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各劑量染毒組SD大鼠直立次數(shù)分別較空白組明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且中、高劑量組SD大鼠直立次數(shù)分別與溶劑組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。五組SD大鼠的糞便顆粒數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖1　B［a］P亞慢性染毒后對照組與各劑量染毒組體質(zhì)量箱式圖

表1　五組SD大鼠曠場實驗中各行為學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1　五組SD大鼠曠場實驗中各行為學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與溶劑組比較，bP＜0.05。

組別空白組溶劑組低劑量組中劑量組高劑量組爬行總格子數(shù)（格）直立次數(shù)（次）糞便顆粒數(shù)（顆）20.72±7.03 26.56±11.44 34.33±8.67a36.06±15.35a43.28±10.20ab5.77±1.03 5.88±2.75 8.89±1.87a9.00±3.47ab9.39±3.02ab1.00±1.67 1.17±1.17 1.50±1.23 1.83±2.04 3.17±2.23

2.2.2五組SD大鼠足跡實驗中各行為學(xué)指標(biāo)比較五組SD大鼠在足跡實驗中步寬、步長及步態(tài)、角度變化4個參數(shù)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2　五組SD大鼠足跡實驗中各行為學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表2　五組SD大鼠足跡實驗中各行為學(xué)指標(biāo)比較（±s）

組別空白組溶劑組低劑量組中劑量組高劑量組步寬（mm）步長（mm）步態(tài)變化（β）角度變化（△α）31.87±9.07 31.74±10.33 22.03±2.78 25.15±6.65 27.53±10.10 47.93±12.26 48.71±9.25 47.78±14.09 43.01±4.39 47.31±9.29 0.28±0.19 0.17±0.10 0.12±0.04 0.15±0.07 0.16±0.10 1.25±0.85 1.13±0.89 1.29±1.11 0.29±0.29 0.17±0.33

3　討論

人體接觸有機(jī)污染物主要通過食物和飲水，故本實驗采取灌胃法染毒模擬人體接觸外界污染物的方式進(jìn)行實驗觀察。本實驗設(shè)計的B［a］P染毒劑量為0.02、0.20、2.00 mg/kg，與人體接觸環(huán)境污染水平相對應(yīng)［8］，也與以往研究劑量一致［9-10］。通過SD幼鼠7周灌胃染毒后發(fā)現(xiàn)，各劑量染毒組SD大鼠均出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩現(xiàn)象，表現(xiàn)為體質(zhì)量較空白組和溶劑組明顯減輕，提示B［a］P亞慢性染毒可抑制SD幼鼠的生長發(fā)育。

神經(jīng)和行為學(xué)的研究方法很多，其中行為測試方法作為神經(jīng)系統(tǒng)功能的敏感測量方法，能反映神經(jīng)系統(tǒng)整合的輸出情況［11］。行為學(xué)評估內(nèi)容主要包括動物的自主行為、肌力和協(xié)調(diào)運動能力，以及學(xué)習(xí)和記憶能力。

曠場實驗又稱敞箱實驗，由美國心理學(xué)家Hall于1934年首次研究設(shè)計，是一種評價嚙齒類實驗動物自主運動行為、探究行為與緊張焦慮程度的方法。本研究參照以往研究方法，利用自制木箱，人工記錄SD大鼠的自發(fā)活動及變化，根據(jù)文獻(xiàn)［4-5］計算出相應(yīng)指標(biāo)，對各項指標(biāo)進(jìn)行分析。糞便顆粒主要反映SD大鼠在木箱中的焦慮程度［12］，本研究結(jié)果顯示，各劑量染毒組與對照組糞便顆粒數(shù)比較無明顯變化，提示B［a］P可能對其焦慮無明顯影響。水平運動及垂直運動次數(shù)主要用于衡量嚙齒類實驗動物自主活動的強(qiáng)弱［5］。本研究對大鼠水平運動及垂直運動指標(biāo)的分析結(jié)果顯示，各劑量染毒組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示B［a］P染毒對SD大鼠自主活動及探索行為有影響；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，染毒組大鼠的水平運動及垂直運動較空白組呈增加趨勢，說明B［a］P染毒對SD大鼠自主活動及探索行為有促進(jìn)作用。與文獻(xiàn)［9］報道的B［a］P亞慢性處理幼鼠在出生36 d后自發(fā)活動明顯增加，在69 d自發(fā)活動增加最為明顯的結(jié)果一致。

足跡實驗是通過步態(tài)模式和步長異常來反映動物共濟(jì)運動能力［5］。本研究根據(jù)文獻(xiàn)［6-7］計算并分析出各個實驗動物的步寬、步長、步態(tài)變化及角度變化（△α），結(jié)果顯示，對照組與各劑量染毒組4項參數(shù)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示B［a］P對動物的共濟(jì)運動能力影響不明顯。其原因可能是B［a］P在體內(nèi)的蓄積還未達(dá)到臨床“疾病”的程度，尚處于亞臨床狀態(tài)。目前國內(nèi)外有關(guān)B［a］P對嚙齒類動物共濟(jì)運動能力的相關(guān)研究報道較少，本研究雖發(fā)現(xiàn)各組間共濟(jì)運動能力表現(xiàn)不明顯，但若要進(jìn)一步探索，尚需進(jìn)行更長時間的染毒實驗觀察。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，B［a］P亞慢性染毒可抑制SD幼鼠的生長發(fā)育，促進(jìn)其自主活動，但對其運動協(xié)調(diào)能力無明顯影響。B［a］P對共濟(jì)運動能力的影響有待通過更長時間的染毒實驗并結(jié)合人群流行病學(xué)調(diào)查進(jìn)一步確認(rèn)。

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Effects of benzo［a］pyrene on autonomic activity and motor coordination in rats*

Su Qiuping，Yang Kai，Tu Baijie△
（Teaching and Researching Section of Environment Health and Labor Hygiene，School of Public Health and Management，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo explore the effect of subchronic exposure to benzo［a］pyrene（B［a］P）on autonomic activity and motor coordination in rats.MethodsThirty male juvenile rats，aged 3-4 d，were randomly divided into the blank group，solvent group（1.00 mL/kg plant oil），B［a］P low-dose group（0.02 mg/kg），B［a］P medium-dose group（0.20 mg/kg）and B［a］P high-dose group（2.00 mg/kg），6 cases in each group.After acclimatizing the feeding environment，the rats were intragastrically administrated for 7 consecutive weeks according to corresponding concentration.After exposure to toxicant，the body weight of rat was measured. The open field test and foot printing test were conducted to evaluate the autonomic activity and motor coordination of rats，respectively.The total number of crawling lattice，up-right times and fecal particles number in the open field test were recorded.Meanwhile，the heel footprints track in the foot printing test were also recorded.ResultsAfter exposure to toxicant，the growth and development of SD rats in each contamination group were delayed，which showed that the body weight of each contamination group was significantly lower than that in the blank group and the total number of crawling lattice and upright times in each contamination group was significantly increased when compared with the blank group and the solvent group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.However，there were no statistically significant differences in the step width，step size，gait changes and angle changes among the five groups（P＞0.05）.ConclusionB［a］P can inhibit the growth and development of juvenile rats and promotes their autonomic activity，but has not obvious effect on the motor coordination.

Benzopyrenes/toxicity；Neurobehavioral manifestations；Autonomic activity；Motor coordination；Rats，sprague-dawley

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.003

A

1009-5519（2016）20-3103-03

國家自然科學(xué)基金資助項目（81372957）。

粟秋平（1989-），在讀碩士研究生，主要從事職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究?！?/p>

，E-mail：baijietu@hotmail.com。

（2016-09-05）