HRM探討IL-23R/IL-17基因多態(tài)性與大腸腫瘤關(guān)聯(lián)性研究

李丙生　許岸高　甘愛華　張曉慧　黃文峰　余中貴　陳曉龍

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·基礎(chǔ)研究論著·

HRM探討IL-23R/IL-17基因多態(tài)性與大腸腫瘤關(guān)聯(lián)性研究

李丙生許岸高甘愛華張曉慧黃文峰余中貴陳曉龍

目的運(yùn)用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(HRM) 探討IL-23/IL-17炎癥軸中IL-23R、IL-17基因多態(tài)性(GP)與大腸腫瘤的相關(guān)性。方法采用病例對(duì)照研究，選擇大腸癌組(CRC組)、大腸腺瘤組(AA組)和健康對(duì)照組(HC組)各50例患者，用HRM方法檢測(cè)組織 IL-23R(rs6682925、rs1884444、rs10889677)、IL-17 rs763780的GP，比較其在各組的分布差異。結(jié)果3組的IL-23R rs10889677基因型頻率分布存在差異(P=0.028)。CRC組和HC組間，在不喝酒亞組中，IL-23R rs6682925位點(diǎn)CC基因型患CRC風(fēng)險(xiǎn)比TT增加9.73倍(校正OR=10.73，95%CI1.02～112.50)；在吸煙亞組中，rs1884444位點(diǎn)TT基因型比TG患CRC風(fēng)險(xiǎn)增加4.47倍(校正OR=5.47，95%CI1.08～27.6)；在男性患者中，rs10889677位點(diǎn)AA基因型患CRC風(fēng)險(xiǎn)比AC基因型增加3.15倍(校正OR=4.15，95%CI1.02～16.91)，另外病變部位在結(jié)腸亞組中，攜帶rs10889677位點(diǎn)AA基因型的患者比攜帶AC基因型的患者患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.18倍(校正OR=3.18，95%CI1.04～9.71)；AA組和HC組間，IL-23R rs10889677位點(diǎn)攜帶AA基因型比攜帶AC基因型患者患AA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.40倍(校正OR=3.40，95%CI1.38～8.37)；在RCR組和AA組中，以上多態(tài)性基因位點(diǎn)基因頻率分布及分層分析結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-17 rs763780的GP在3組的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論IL-23R基因多態(tài)性與大腸癌、大腸腺瘤的發(fā)病相關(guān)，而IL-17基因多態(tài)性與大腸癌、大腸腺瘤均無(wú)關(guān)。

白介素-23R；白介素-17；基因多態(tài)性；大腸腫瘤

我國(guó)大腸癌的發(fā)病率及病死率呈逐年上升的趨勢(shì)。近年來，炎癥與大腸癌的關(guān)系越來越受到重視。發(fā)現(xiàn)許多炎癥因子的基因多態(tài)性(GP)參與大腸癌的發(fā)病進(jìn)程[1-8]。因此尋找出更多同大腸癌相關(guān)的細(xì)胞因子的GP位點(diǎn)，將可為大腸癌防治提供新的思路。已有不少研究發(fā)現(xiàn)IL-23/IL-17炎癥軸的相關(guān)細(xì)胞因子與腺瘤、大腸癌密切相關(guān)[9-12]，但目前國(guó)內(nèi)尚未見系統(tǒng)探討IL-23/IL-17炎癥軸中的關(guān)鍵細(xì)胞因子GP與大腸癌、腺瘤的易感性關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道。高分辨率熔解曲線分析(HRM)是新近開發(fā)的一種醫(yī)學(xué)分子診斷技術(shù)，具有高通量、經(jīng)濟(jì)、快捷、簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)[13]。因此，本研究將采用HRM法探討IL-23/IL-17炎癥軸中關(guān)鍵的細(xì)胞因子IL-23R、IL-17F位點(diǎn)的GP與大腸癌、大腸腺瘤的關(guān)聯(lián)性。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

連續(xù)收集2013年10月至2014年6月惠州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科和胃腸外科就診的大腸癌組(CRC組)、大腸腺瘤組(AA組)、健康對(duì)照組(HC組)各50例的組織標(biāo)本并抽提基因組DNA，同時(shí)收集患者的相關(guān)臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理組織學(xué)檢查(均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的胃腸道病理學(xué)專家閱片判定)確診為大腸癌與大腸腺瘤患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①家族性或遺傳性結(jié)直腸腺瘤或腫瘤；②其他系統(tǒng)或器官腫瘤；③大腸癌或大腸腺瘤患者同時(shí)患有炎癥性腸??；④術(shù)前有放射治療或化學(xué)治療史；⑤妊娠或有嚴(yán)重肝腎功能不全者；⑥非原發(fā)癌灶者及不能確診等其他情況。病例組患者均經(jīng)腸鏡及活檢病理或手術(shù)活檢病理確診為大腸癌或大腸腺瘤性息肉。其中CRC組男23例、女27例，年齡(58.5±15.6)歲；AA組男33例、女17例，年齡(55.7±14.3)歲。HC組為健康體檢人群，其中男24名、女26名，年齡(57.2±13.9)歲，3組的性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入研究人員均簽訂知情同意書，本研究通過倫理委員會(huì)審查。

二、PCR-HRM檢測(cè)

根據(jù) NCBI 的IL-23R、IL-17的參考基因序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(IL-23Rrs6682925, F: GCCCAAACATGGAAATAACATT, R:CCTTCCT-TTTTATGGCTGCAT; IL-23Rrs1884444, F: GTCTT-TTCCTGCTTCCAGACAT, R: ACACCATACCTCCAT-GACACCA；IL-23Rrs10889677, F: GCTCCATGCC-TTTTTAATTTTAG, R: CCTTCGGGACCTTAATTC-TCTA; IL-17rs763780, F: AGCTGAGTGGATATGCA-CCTCT, R: TGGAGAAGGTGCTGGTGACT), 引物由上海生工生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增與HRM檢測(cè)均在LightCycler480 PCR儀上操作。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 min; 95℃變性10 s, 60/61℃退火/延伸30 s共40個(gè)循環(huán)；HRM分析95℃ 5 min,40℃ 1 min,65℃ 1 s,95℃。每秒檢測(cè)熒光25次；冷卻40℃ 30 s 進(jìn)行反應(yīng)。

三、DNA測(cè)序

為了驗(yàn)證PCR方法的準(zhǔn)確性，我們按照每個(gè)位點(diǎn)不同的熔解曲線所分出的基因型，挑選不同熔解曲線所對(duì)應(yīng)的樣本各2～3個(gè)的PCR產(chǎn)物送至廣州英濰捷基公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定各組曲線的基因型。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)比較人口學(xué)特征和 Hardy-Weinberg平衡定律；使用χ2檢驗(yàn)分析病例組與對(duì)照組的基因頻率及等位基因頻率分布差異，兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)；SNP與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系采用Logistic回歸分析，用校正性別、年齡、發(fā)病部位、吸煙和喝酒狀況后的OR和95%CI表示。P<0.05或校正后P<0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、CRC組、AA組和HC組一般資料比較

CRC組、AA組及HC組的性別、年齡、發(fā)病部位、吸煙、飲酒比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。IL-23R(rs6682925、rs1884444、rs10889677)、IL-17 rs763780的GP在正常對(duì)照組基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

表1CRC組、AA組和HC組的一般情況比較

項(xiàng) 目CRC組(50例)AA組(50例)HC組(50名)P值年齡(歲)<50121213≥503838370.965性別男233324女2717260.649吸煙a吸煙212120不吸2929300.923飲酒b喝酒192218不喝3128320.695部位直腸293628結(jié)腸2114220.199

注：a吸煙史陽(yáng)性的定義為每天至少吸煙1支，連續(xù)吸煙1年以上，長(zhǎng)期吸煙或者戒煙少于半年；b飲酒史陽(yáng)性定義為平均每日酒精攝入量>25 g,長(zhǎng)期飲酒持續(xù)時(shí)間>1年或者戒酒時(shí)間<3個(gè)月

二、CRC組、AA組和HC組IL-23R、IL-17的4個(gè)位點(diǎn)基因型頻率分布比較

3組的IL-23R rs6682925、rs1884444、IL-17F rs763780的基因型頻率分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IL-23R rs10889677基因型頻率分布存在差異(χ2=7.18，P=0.028)，經(jīng)過兩兩比較，僅AA組與HC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.90，P=0.009)。A/C等位基因分布，在AA組與HC組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.01，P=0.025，OR=2.20, 95%CI1.04～4.44)，見表2。

三、IL-23R位點(diǎn)GP與CRC、AA患病易感關(guān)聯(lián)性分析

通過調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、病變部位因素的進(jìn)一步分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在男性患者與在病變位于結(jié)腸亞組中，與AC基因型相比，AA基因型是大腸癌危險(xiǎn)因素；IL-23R rs1884444位點(diǎn)GP在吸煙人群中，與TG基因型相比，TT基因型是大腸癌危險(xiǎn)因素，見表3。

表2　CRC組、AA組和HC組IL-23R、IL-17的4個(gè)位點(diǎn)基因型頻率分布比較　例(%)

討　　論

大量研究證據(jù)表明，促炎細(xì)胞因子對(duì)維持慢性炎癥，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成，腫瘤微環(huán)境擴(kuò)張以及抑制腫瘤免疫監(jiān)視具有重要作用[14]。其中，IL-23/IL-17炎癥軸中的關(guān)鍵細(xì)胞因子與腫瘤關(guān)系備受關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)IL-23、IL-17促炎癥細(xì)胞因子GP與消化道腫瘤密切相關(guān)，但與大腸腫瘤的相關(guān)性研究報(bào)道少見[15]。因此，深入全面探討IL-23/IL-17炎癥軸中關(guān)鍵的細(xì)胞因子GP與大腸腫瘤的關(guān)系非常重要。

目前，Chen[16]等在一項(xiàng)包含了1 043例胃癌患者和1 089例健康對(duì)照的病例對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)IL-23R rs6682925位點(diǎn)GP與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性，但rs1884444的G等位基因可以降低腸型胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.75，95%CI0.65～0.87)；Chu等[12]研究表明IL-23R rs6682925的TC/CC基因型和rs1884444位點(diǎn)TG/GG基因型和食管癌的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)探討IL-23R rs6682925 GP與大腸腫瘤相關(guān)性研究報(bào)道，本研究我們首次發(fā)現(xiàn)，在不喝酒人群中，與HC組比，攜帶rs6682925 CC基因型患者患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加9.73倍，這與Chu等[12]的研究結(jié)果相類似，但我們的研究并未顯示該位點(diǎn)GP在AA發(fā)病的相關(guān)性，也沒有在大腸癌與AA組間發(fā)現(xiàn)他們間的相關(guān)性；在吸煙人群中rs1884444 TT基因型患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加4.47倍。但未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)GP在AA的發(fā)病及在“腺瘤-大腸癌”的過程中的作用。鑒于目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究數(shù)據(jù)，因此，我們的研究結(jié)果率先提供非常有意義的理論依據(jù)，但由于地域的局限性及樣本量的不足，尚需更強(qiáng)論證強(qiáng)度的大樣本量研究深入探討。

表3　IL-23R位點(diǎn)SNP與CRC、AA患病易感關(guān)聯(lián)性分析

Nemati等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IL-23R rs10889677位點(diǎn)的GP與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性，但I(xiàn)L-17A rs2275913攜帶AG基因型可以增加患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)，相反，rs763780攜帶TT基因型或T等位基因可以顯著降低患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在男性患者中，CRC組比HC組攜帶IL-23R rs10889677AA基因型患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加3.15倍，在發(fā)病部位位于結(jié)腸患者中，攜帶該基因型比攜帶AC基因型大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加2.18倍，但A/C等位基因間未能表現(xiàn)相關(guān)性；AA組比HC組攜帶該基因型患AA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.40倍，這提示rs10889677位點(diǎn)GP與AA的發(fā)病存在相關(guān)性，進(jìn)一步對(duì)該位點(diǎn)的等位基因進(jìn)行分析結(jié)果提示，與攜帶C等位基因相比，攜帶A等位基因可以增加大腸腺瘤性息肉的風(fēng)險(xiǎn)。未發(fā)現(xiàn)IL-23R rs10889677位點(diǎn)GP在其他組間相關(guān)性。這與Nemati等[15]的研究結(jié)果不同，其可能的原因是不同地域的人群大腸癌易感基因型不同，另外還可能的原因是樣本量不足。然而，在我們的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果中，IL-23R rs10889677 AA即是大腸癌的易感基因，又是大腸腺瘤的易感基因，根據(jù)前面提到的大腸癌發(fā)展的模式“早期腺瘤-晚期腺瘤-癌”來看，我們推測(cè)IL-23R rs10889677 AA可能在大腸腺瘤性息肉發(fā)展為大腸癌的過程中起到作用，但我們的數(shù)據(jù)卻未提供這方面的證據(jù)，而是得出該基因型與該進(jìn)程無(wú)關(guān)的結(jié)果，這可能需要更大的樣本量的數(shù)據(jù)來尋找并證明該基因型與上述腫瘤進(jìn)程的關(guān)系。

對(duì)于IL-17F基因外顯子區(qū)域的rs763780位點(diǎn)，本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與大腸癌或大腸腺瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，這與 Nemati等[15]的研究結(jié)果不同。出現(xiàn)上述兩個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果與類似研究人員研究結(jié)果不同的可能原因是：①基因分型檢測(cè)方法結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽(yáng)性，而本研究采用HRM基因分析技術(shù)，準(zhǔn)確率較高，假陽(yáng)性率較低，并經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證部分樣本，結(jié)果更可信；②不同種族人群的遺傳差異也可能導(dǎo)致研究結(jié)果不一致；③樣本量偏小導(dǎo)致結(jié)果的偏倚。

綜上所述，本研究探討IL-23R rs6682925 GP與大腸腫瘤相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)IL-23R rs6682925、rs1884444、rs10889677位點(diǎn)與大腸腫瘤遺傳易感相關(guān)，而IL-17基因多態(tài)性與大腸癌、大腸腺瘤均無(wú)關(guān)。

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(本文編輯：楊江瑜)

Application of high resolution melting assay to explore the correlation between the single nucleotide polymorphisms of IL-23/IL-17 gene and colorectal cancer

LiBingsheng,XuAngao,GanAihua,ZhangXiaohui,HuangWenfeng,YuZhonggui,ChenXiaolong.

HuizhouFirstHospital，Huizhou516003,China

,XuAngao，E-mail：angao62@21cn.com

ObjectiveTo explore the correlation between the gene polymorphisms (GP) of IL-23R/IL-17 gene, which is located in the IL-23/IL-17 axis, and the risk of colorectal cancer by using the high resolution melting (HRM) assay. MethodsIn this case-control study, 50 patients with colorectal cancer (CRC group), 50 with colorectal adenoma (AA group) and 50 healthy controls (HC group) were recruited. The GP and distribution of IL-23R (rs6682925, rs1884444 and rs10889677) and IL-17 rs763780 were detected and statistically compared among three groups using HRM assay. ResultsAmong three groups, the genotype frequency of IL-23R rs10889677 significantly differed (P=0.028). In the non-drinking subgroup between the CRC and HC groups, the risk of CRC in subjects with IL-23R rs6682925 CC genotype was 10.73 times higher than that of their counterparts with TT genotype (adjustedOR=10.73, 95%CI1.02-112.50). In the smoking subgroup, the risk of CRC in patients with rs1884444 TT genotype was 5.47 times higher compared with that of their counterparts with TG genotype (adjustedOR=5.47, 95%CI1.08-27.6). For male subjects, the risk of CRC with rs10889677 AA genotype was 4.145 times higher than that of their counterparts with AC genotype (adjustedOR=4.15, 95%CI1.02-16.91). In the colon cancer subgroup, the risk of CRC with rs10889677 AA genotype was 3.175 times higher than that of AC genotype counterparts (adjustedOR=3.18, 95%CI1.04-9.71). Comparing between the AA and HC groups, the risk of AA in subjects with rs10889677 AA genotype was 3.40 times higher compared with that in those with AC genotype (adjustedOR=3.40, 95%CI1.38-8.37). No significant difference was documented in the gene frequency and distribution between the CRC and AA groups.There was no significant difference in the distribution of IL-17 rs763780 GP among the three groups. ConclusionIL-23R GP is correlated with the incidence of CRC and AA, but IL-17 GP is not a relevant factor.

Interleukin-23R; Interleukin-17; Gene polymorphism; Colorectal cancer

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.10.003

廣東省自然基金(2015A030310057)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2103B021800079)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)基金(A2014812)

516003 惠州，惠州市第一人民醫(yī)院

，許岸高，E-mail：angao62@21cn.com

2016-06-06)