重度宮腔粘連子宮內(nèi)膜修復(fù)中微血管密度及VEGF的表達(dá)及其臨床意義

陳玉清　常亞杰　楊歡

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·臨床研究論著·

重度宮腔粘連子宮內(nèi)膜修復(fù)中微血管密度及VEGF的表達(dá)及其臨床意義

陳玉清常亞杰楊歡

目的探討宮腔鏡下宮腔粘連切除術(shù)(TCRA)前后微血管密度(MVD)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在重度宮腔粘連子宮內(nèi)膜表達(dá)的差異及其臨床意義。方法選擇60例重度宮腔粘連患者，其中Ⅳ度宮腔粘連37例、Ⅴ度宮腔粘連23例。所有宮腔粘連患者行TCRA后予雌激素為主的人工周期治療。檢測(cè)術(shù)前、術(shù)后3個(gè)月60例患者子宮內(nèi)膜中CD34標(biāo)記的MVD及VEGF表達(dá)水平。結(jié)果60例患者的手術(shù)過(guò)程均順利，術(shù)中無(wú)一例發(fā)生大量出血、水中毒、子宮穿孔等并發(fā)癥，術(shù)后隨訪均未見(jiàn)盆腔感染。TCRA術(shù)前、術(shù)后3個(gè)月，60例宮腔粘連患者的子宮內(nèi)膜組織中均有CD34及VEGF表達(dá)。TCRA術(shù)后3個(gè)月患者子宮內(nèi)膜的MVD、VEGF評(píng)分均高于術(shù)前(P均<0.01)。術(shù)后3個(gè)月，Ⅳ度宮腔粘連、月經(jīng)中期子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm、粘連無(wú)復(fù)發(fā)患者的子宮內(nèi)膜MVD、VEGF評(píng)分均相應(yīng)高于Ⅴ度宮腔粘連、子宮內(nèi)膜<7 mm、粘連復(fù)發(fā)患者(P均<0.01)。結(jié)論宮腔粘連子宮內(nèi)膜修復(fù)過(guò)程中MVD、VEGF表達(dá)上調(diào)，提示微血管的新生可能有利于TCRA術(shù)后子宮內(nèi)膜修復(fù)。

宮腔粘連；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；微血管密度

宮腔粘連主要是由于子宮內(nèi)膜基底層受損所致，是不孕癥和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的重要原因。隨著宮腔鏡技術(shù)的發(fā)展，宮腔鏡下宮腔粘連切除術(shù)(TCRA)成為宮腔粘連的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[1]。然而，術(shù)后宮腔再粘連的預(yù)防至今仍是臨床治療中的難點(diǎn)和重點(diǎn)。如何盡快促進(jìn)子宮內(nèi)膜創(chuàng)面修復(fù)，預(yù)防宮腔再粘連形成，是值得研究的課題。為此，我們觀察TCRA前后以CD34標(biāo)記的微血管密度(MVD)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在子宮內(nèi)膜表達(dá)的差異，并探討其臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、研究對(duì)象

收集2014年6月至2015年6月在我院經(jīng)宮腔鏡檢查確診為重度宮腔粘連患者，并排除以下情況：①既往性激素水平異常，或合并其他引起閉經(jīng)、月經(jīng)量減少、不孕癥等內(nèi)分泌因素；②存在其他引起異常陰道流血的病理情況；③合并有心血管疾病、糖尿病、肝病、血栓性疾病等雌、孕激素禁忌證者。共60例重度宮腔粘連患者納入研究，其年齡21～38歲、中位年齡29歲，清宮1～6次、中位數(shù)2次。本研究獲得中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書(shū)。

二、宮腔粘連診斷標(biāo)準(zhǔn)：

采用歐洲婦科內(nèi)鏡協(xié)會(huì)(ESGE)宮腔粘連分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，將宮腔鏡下所見(jiàn)的粘連分為Ⅰ～Ⅴ度[2]。

三、方法

1. 治療

所有患者均于卵泡早期行TCRA，對(duì)閉經(jīng)患者結(jié)合B超、性激素水平、是否有經(jīng)前期的乳房脹痛及經(jīng)期下腹脹綜合判斷手術(shù)擇期。術(shù)后患者均口服雌二醇9 mg/d，共21 d，后10 d加服安宮黃體酮10 mg/d，連續(xù)使用3個(gè)周期。術(shù)后第7日取出宮腔球囊。術(shù)后3個(gè)月復(fù)查宮腔鏡，了解宮腔恢復(fù)情況。

2. 標(biāo)本采集

分別于手術(shù)前和術(shù)后3個(gè)月于宮腔鏡下定位取得子宮內(nèi)膜組織，大小約1～1.5 cm2，經(jīng)10%甲醛固定和石蠟常規(guī)包埋，待免疫組織化學(xué)染色檢查(免疫組化)。

3. 檢測(cè)方法

子宮內(nèi)膜組織石蠟標(biāo)本切片，行蘇木素-伊紅染色，光鏡觀察篩選。采用美國(guó)R&D公司鼠抗人CD34單克隆抗體濃縮液 (1∶100稀釋)及兔抗人VEGF單克隆抗體濃縮液(SP28)(1∶100稀釋)， 進(jìn)行鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)(SP)法染色分別對(duì)組織內(nèi)MVD及VEGF染色定位。

4. 免疫組化結(jié)果判定

CD34以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，MVD計(jì)數(shù)依據(jù)文獻(xiàn)[3]的計(jì)算方法:在低倍鏡下(100倍)尋找富含血管的“熱點(diǎn)區(qū)”，于高倍鏡下(400倍)計(jì)數(shù)其內(nèi)的血管數(shù)目。VEGF采用免疫組化半定量法評(píng)分，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例及相應(yīng)染色強(qiáng)度評(píng)分判斷每片的染色強(qiáng)度，分為0(陰性)～4級(jí)(最大染色強(qiáng)度)；為便于分析，轉(zhuǎn)換為百分比表示，即0～4級(jí)依次分別為 0%、25%、50%、75%、100%。免疫組化評(píng)分：Hscor=∑pi (i+1)，i為著色強(qiáng)弱，p為同一染色強(qiáng)度細(xì)胞所占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分比[4]。由2位病理科醫(yī)師雙盲讀片，取各視野平均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、手術(shù)情況

60例患者的手術(shù)過(guò)程均順利，手術(shù)時(shí)間(20.2±5.3)min，術(shù)中出血量(17.6±3.1)ml，住院時(shí)間(3.4±1.7)d。術(shù)中無(wú)一例發(fā)生大量出血、水中毒、子宮穿孔等并發(fā)癥，術(shù)后隨訪均未見(jiàn)盆腔感染。

二、MVD與VEGF的染色情況

1. MVD的染色結(jié)果

TCRA前、術(shù)后3個(gè)月，60例宮腔粘連患者的子宮內(nèi)膜組織中均有CD34的棕色顯色，主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，見(jiàn)圖1。

2. VEGF的染色結(jié)果

TCRA前、術(shù)后3個(gè)月，60例宮腔粘連患者的子宮內(nèi)膜組織中均有VEGF的棕黃色顯色，主要定位于子宮內(nèi)膜腺上皮胞漿，間質(zhì)的表達(dá)較弱，見(jiàn)圖2。

三、宮腔粘連患者術(shù)后MVD、VEGF評(píng)分及其與預(yù)后的關(guān)系

1. MVD評(píng)分及其與預(yù)后的關(guān)系

60例宮腔粘連患者在TCRA術(shù)后3個(gè)月的子宮MVD評(píng)分為(25.47±1.62)分，高于術(shù)前的(37.02±1.64)分，t=38.786、P<0.001。術(shù)后3個(gè)月，Ⅳ度宮腔粘連、月經(jīng)中期子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm、粘連無(wú)復(fù)發(fā)患者的子宮內(nèi)膜MVD評(píng)分相應(yīng)高于Ⅴ度宮腔粘連、子宮內(nèi)膜<7 mm、粘連復(fù)發(fā)患者(P均<0.01)，見(jiàn)表1。

圖1　TCRA術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月子宮內(nèi)膜中CD34的免疫組化結(jié)果(SP染色，×100)

A：術(shù)前； B：術(shù)后3個(gè)月；箭頭：CD43陽(yáng)性顯色

圖2　TCRA術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月子宮內(nèi)膜中VEGF的免疫組化結(jié)果(SP染色，×100)

A：術(shù)前； B：術(shù)后3個(gè)月；箭頭：VEGF陽(yáng)性顯色

2. VEGF評(píng)分及其與預(yù)后的關(guān)系

60例宮腔粘連患者在TCRA術(shù)后3個(gè)月的子宮MVD評(píng)分為(3.38±0.56)分，高于術(shù)前的(5.24±0.49)分，t=19.259、P<0.001。術(shù)后3個(gè)月，Ⅳ度宮腔粘連、月經(jīng)中期子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm、粘連無(wú)復(fù)發(fā)患者的子宮內(nèi)膜VEGF評(píng)分相應(yīng)高于Ⅴ度宮腔粘連、子宮內(nèi)膜<7 mm、粘連復(fù)發(fā)患者(P均<0.01)，見(jiàn)表1。

表1　60例宮腔粘連患者在術(shù)后3個(gè)月的子宮內(nèi)膜MVD和VEGF表達(dá)比較±s)

討　　論

宮腔粘連被認(rèn)為是由于子宮內(nèi)膜基底層破壞發(fā)展而來(lái)的，可引起女性月經(jīng)少、閉經(jīng)和不育[5]。重度宮腔粘連患者的子宮內(nèi)膜基底層破壞較嚴(yán)重，子宮內(nèi)膜及腺體的再生能力低下且子宮內(nèi)膜的容受性差。近年來(lái)，宮腔鏡成為診斷和治療宮腔粘連的標(biāo)準(zhǔn)方法，宮腔粘連治療目的是恢復(fù)宮腔形態(tài)和容積、防止粘連復(fù)發(fā)、促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)、恢復(fù)正常生殖功能，而術(shù)后再粘連的預(yù)防至今仍是臨床治療中的難題。目前多采用術(shù)后放置宮腔球囊和應(yīng)用大劑量雌激素，預(yù)防術(shù)后新的粘連形成，并促進(jìn)子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)[6-7]。但目前宮腔粘連的臨床治療預(yù)后并不理想，宮腔粘連行TCRA術(shù)后再粘連現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮。資料顯示，宮腔粘連治療后的復(fù)發(fā)率高達(dá)28.7%，其治療仍然為臨床的棘手問(wèn)題[8]。

正常月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜功能層可見(jiàn)周期性的螺旋動(dòng)脈生長(zhǎng)過(guò)程，增殖期間質(zhì)中螺旋小動(dòng)脈逐漸發(fā)育、管壁增厚、管腔增大；于分泌期螺旋動(dòng)脈繼續(xù)增生并卷曲，血管網(wǎng)重塑成熟并改變了血管阻力，為胚胎著床做準(zhǔn)備[9]。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，增生期螺旋動(dòng)脈和上皮下毛細(xì)血管的生長(zhǎng)發(fā)生在整個(gè)功能層[10]。Demir等[11]在獼猴動(dòng)物模型中觀察到：在孕激素撤退后單獨(dú)使用雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管增生的作用在增殖中期最為明顯，而不給予雌激素和孕激素后，便不再出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的高峰。子宮內(nèi)膜受到破壞是宮腔粘連發(fā)病的主要原因，子宮內(nèi)膜損傷后的修復(fù)和重建除雌激素的刺激外，同樣需要新血管生成的支持。本研究著眼于探討術(shù)后子宮內(nèi)膜修復(fù)過(guò)程中子宮內(nèi)膜血管生長(zhǎng)情況，探討子宮內(nèi)膜局部血液循環(huán)的重建在宮腔粘連患者子宮創(chuàng)面修復(fù)意義。

MVD是測(cè)量毛細(xì)血管生成數(shù)量的定量指標(biāo)，是衡量微血管形成的客觀指標(biāo)，多用于評(píng)價(jià)組織中血管的生長(zhǎng)情況。國(guó)外有研究對(duì)切除卵巢的老鼠給予雌二醇(100 ng) ，24 h后子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯增殖，血管密度與間質(zhì)細(xì)胞密度比值增加[12]。同時(shí)B超監(jiān)測(cè)術(shù)后子宮內(nèi)膜顯示內(nèi)膜厚度是增加的。提示雌激素上調(diào)MVD，并且促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)。另有研究提出，子宮內(nèi)膜厚度至少要為7 mm才有利于胚胎種植[13]。因此，本研究選擇內(nèi)膜7 mm為臨界值。本研究顯示，TCRA后予雌、孕激素人工周期3個(gè)月，子宮內(nèi)膜中CD34表達(dá)上調(diào)，而且在子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm及宮腔粘連無(wú)復(fù)發(fā)者的子宮內(nèi)膜中，CD34表達(dá)均明顯上調(diào)，即MVD升高。提示新生血管的形成及局部微循環(huán)的改善可能是促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)的一個(gè)重要因素。

VEGF是重要的促血管生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂和血管通透性的作用。多項(xiàng)研究表明，VEGF及其受體在人體子宮內(nèi)膜均有表達(dá)，且呈周期性變化，受雌、孕激素水平的調(diào)節(jié)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜較薄患者子宮內(nèi)膜中的VEGF表達(dá)下調(diào)[15]。在人類(lèi)子宮內(nèi)膜的體外培養(yǎng)試驗(yàn)中，雌激素明顯刺激VEGF表達(dá)[9]。本研究顯示，VEGF在宮腔粘連子宮內(nèi)膜中，主要定位于腺上皮胞漿，間質(zhì)的表達(dá)較弱。TCRA后予雌、孕激素人工周期3個(gè)月，子宮內(nèi)膜中VEGF表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步分析，在子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm及宮腔粘連無(wú)復(fù)發(fā)者的子宮內(nèi)膜中，VEGF表達(dá)上調(diào)較子宮內(nèi)膜厚度<7 mm及宮腔粘連復(fù)發(fā)者明顯。這從另一角度說(shuō)明VEGF表達(dá)上調(diào)，可能是通過(guò)促進(jìn)子宮內(nèi)膜毛細(xì)血管生長(zhǎng)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)。

綜上所述，宮腔粘連治療后子宮內(nèi)膜修復(fù)過(guò)程中MVD及VEGF表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了子宮內(nèi)膜毛細(xì)血管生長(zhǎng)，改善了子宮內(nèi)膜局部缺氧狀況，從而有利于新鮮創(chuàng)面的子宮內(nèi)膜和受損的子宮內(nèi)膜再生，使粘連切開(kāi)部位子宮內(nèi)膜再次正常上皮化，從而防止術(shù)后再次粘連形成，達(dá)到較好的臨床療效。既然局部血管新生參與了宮腔粘連子宮內(nèi)膜的修復(fù)，那么可否在口服雌激素情況下同時(shí)服用改善局部血供、促進(jìn)血管新生及局部循環(huán)恢復(fù)的藥物協(xié)助術(shù)后子宮內(nèi)膜的修復(fù)？可否通過(guò)其他促進(jìn)血管新生的新技術(shù)來(lái)治療、預(yù)防宮腔粘連形成呢？這有待我們進(jìn)一步的研究和探索。

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(本文編輯：林燕薇)

Clinical significance of VEGF expression and microvessel density in severe intrauterine adhesion patients before and after transcervical resection of adhesion

ChenYuqing,ChangYajie,YangHuan.

DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

,ChenYuqing,E-mail:fangchenyq@163.com

ObjectiveTo explore the clinical significance of microvessel density (MVD) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in endometrium with severe intrauterine adhesion before and after transcervical resection of adhesion (TCRA). MethodsSixty patients diagnosed with severe intrauterine adhesion including 37 cases of grade Ⅳ intrauterine adhesion and 23 of grade V intrauterine adhesion were recruited in this study. All patients underwent TCRA and subsequently received estrogen artificial cycle therapy. The expression levels of CD34-marked MVD and VEGF were quantitatively measured before and 3 months after TCRA. ResultsAll 60 patients underwent TCRA successfully. Intraoperatively, no patient developed massive hemorrhage, water poisoning, uterine perforation or alternative complications. No pelvic inflammation was observed during follow-up. Both CD34 and VEGF were expressed in the endometrium of intrauterine adhesion patients before and 3 months after TCRA. At postoperative 3 months, the MVD and VEGF scores were significantly higher compared with preoperative scores (bothP<0.01). The MVD and VEGF scores in patients with grade Ⅳ intrauterine adhesion, endometrial thickness≥7 mm at the middle of the menstrual cycle and no recurrence of intrauterine adhesion were significantly higher than those in their counterparts with grade V intrauterine adhesion, endometrial thickness<7 mm and no recurrent intrauterine adhesion (bothP<0.01). ConclusionThe expression levels of MVD and VEGF in endometrium are up-regulated after TCRA, prompting that angiogenesis probably contributes to the repair of endometrium.

Intrauterine adhesion; Vascular endothelial growth factor; Microvessel density

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.10.005

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800237)；廣東省自然科學(xué)基金(2016A030313187)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201300000169)

510080 廣州，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(陳玉清，楊歡)；510600 廣州，中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院婦產(chǎn)科(常亞杰)

，陳玉清， E-mail：fangchenyq@163.com

2016-08-08)