靶向納米材料作為大鼠單個(gè)核細(xì)胞基因載體的研究*

董亞賢，堯慧燕，梁　兵，鐘高賢，刁芳明，石紅婷

(廣州醫(yī)科大學(xué)　1.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東　廣州　510000)

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靶向納米材料作為大鼠單個(gè)核細(xì)胞基因載體的研究*

董亞賢1，堯慧燕2，梁兵3，鐘高賢2，刁芳明2，石紅婷2

(廣州醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州510000)

目的:探討納米材料聚乙二醇-聚乙烯亞胺(PEG-PEI)作為基因載體的可行性研究，研究其負(fù)載質(zhì)粒DNA(pDNA)的能力，分析所形成納米材料/pDNA復(fù)合物的特性，以及體外對(duì)細(xì)胞的毒性大小及其轉(zhuǎn)染效率。方法:以PEI為對(duì)照，合成PEG-PEI，采用MTT法檢測(cè)所形成納米材料/DNA復(fù)合物對(duì)大鼠單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞毒性，再采用倒置熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果:N/P<10時(shí)，PEG-PEI和PEI的存活率分別為82.7%及81.3%(P﹥0.05)；N/P=10時(shí)，PEG-PEI是81%，PEI為59% (P<0.05)；N/P﹥10時(shí)，PEG-PEI的細(xì)胞存活率比PEI低(P<0.05)。N/P=10時(shí)，用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)PEG-PEI較PEI表達(dá)的綠色熒光多，熒光強(qiáng)度大(P<0.05)；同時(shí)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PEG-PEI和PEI的轉(zhuǎn)染效率，分別為28.9%和12.5%(P<0.05)。結(jié)論:納米材料PEG-PEI具有強(qiáng)的負(fù)載能力，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性低的優(yōu)點(diǎn)，為作為多發(fā)性硬化基因載體的可行性奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。

納米材料；PEG-PEI；體外基因轉(zhuǎn)染

多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)是一種慢性、炎癥性、脫髓鞘的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。目前免疫調(diào)節(jié)治療是治療MS的主要策略，但免疫治療并沒有使用針對(duì)MS病理上存在變性、壞死的神經(jīng)保護(hù)治療，因而療效差、預(yù)后差[3]。因此，非常有必要進(jìn)一步探討能促進(jìn)神經(jīng)軸突和髓鞘再生的有效治療MS的方法。近年來隨著分子生物學(xué)與基因工程技術(shù)的發(fā)展，多發(fā)性硬化的轉(zhuǎn)基因治療研究取得了一定的進(jìn)展。然而基因治療中最關(guān)鍵的是將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，而后進(jìn)入細(xì)胞核，單純質(zhì)粒DNA很難直接進(jìn)入細(xì)胞，從而高效、安全的基因傳輸載體也是關(guān)鍵因素[4-5]。本文旨在合成聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)-聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)，并研究其負(fù)載質(zhì)粒DNA(pDNA) 的能力，同時(shí)在體外檢測(cè)了其細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率，評(píng)估PEG-PEI的基因轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性作用, 為尋找嶄新的、行之有效的基因治療方法打下理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑大鼠單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自日本BioFlux公司。其余大多數(shù)化學(xué)試劑，包括PEI、PEG、MTT均從美國(guó)Sigma公司購(gòu)買，PEG-PEI本實(shí)驗(yàn)自備而成。

1.2質(zhì)粒DNA(pDNA)的制備本研究應(yīng)用能表達(dá)綠色熒光蛋白的pAAV-EGFP。質(zhì)粒在宿主菌大腸桿菌DH5α株中擴(kuò)增，然后用BioFlux的質(zhì)粒提取試劑盒提取純化。得到的質(zhì)粒通過紫外分光計(jì)在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其純度，然后在1.0%的瓊脂糖凝膠上以100 V電壓電泳40 min，檢測(cè)其完整性。檢測(cè)合格的質(zhì)粒保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3細(xì)胞來源及培養(yǎng)大鼠單個(gè)核細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。用加有10%FBS和1%抗生素(青霉素/鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基在5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃中培養(yǎng)。

1.4PEG-PEI/質(zhì)粒DNA復(fù)合物的制備在Eppendorf管中，將1 μg pDNA稀釋在50 μ0不含F(xiàn)BS的DMEM中，振蕩均勻，按不同N/P比把相應(yīng)量的納米材料加入到另外一管裝有50 μ0不含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM的Eppendorf管中混勻，靜置約5 min后把兩溶液混合，在室溫下用漩渦振蕩器低速振蕩5 min得到均勻復(fù)合物，37 ℃靜置30 min以保證pDNA與納米粒的充分結(jié)合。

1.5聚合物粒徑和zeta-電位的測(cè)量納米材料和pAAV-EGFP按不同N/P(N/P是指陽(yáng)離子聚合物中的NH4+與DNA中的PO3-摩爾比例)比在37 ℃下混合振蕩30 min復(fù)合后，在ZetaPALS-電位分析儀上測(cè)定，條件為25 ℃，入射光波長(zhǎng)為625 nm。

1.6瓊脂糖凝膠電泳PEG-PEI和PEI分別配制成一系列不同濃度的磷酸緩沖溶液,納米粒子溶液與pDNA按N/P比為0、0.5、1、5、10、20、30和40漩渦震蕩復(fù)合后, 室溫靜置30 min。上樣前和6倍的瓊脂糖染色劑結(jié)合,上樣到含有溴化乙錠EB(0.1 μg·mL-1)的1.0%瓊脂糖膠板上，在PBS中以100 V的電壓電泳40 min，通過紫外燈觀測(cè)結(jié)果并攝片記錄。

1.7細(xì)胞毒性檢測(cè)(MTT法)MTT法具體實(shí)驗(yàn)過程如下：PBMC細(xì)胞以每孔6 000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板中；按不同的N/P分別為5、10、20、30計(jì)算出相應(yīng)的納米材料濃度，24 h后每孔加入150 μL 含150 ng 質(zhì)粒DNA的納米材料/pDNA復(fù)合物的不含血清培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)N/P濃度復(fù)設(shè)四個(gè)復(fù)孔，48 h之后加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)上層清液后，加入100 μL DMSO，室溫振蕩5 min后，通過化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm處的吸光值(OD值)。細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值均值-調(diào)零組OD值均值)/(對(duì)照孔OD值均值-調(diào)零組OD值均值)×100%。

1.8細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞以1×105細(xì)胞每孔接種在24孔板上培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合度為70%，在轉(zhuǎn)染前4 h用200 μL不含F(xiàn)BS或含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基置換培養(yǎng)液，把其吸走后每孔加入含有2 μg pDNA不同N/P比的PEG-PEI /質(zhì)粒和200 μL不含F(xiàn)BS或含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)4 h，吸去轉(zhuǎn)染液，加入完全DMEM培養(yǎng)基在37 ℃下二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。pAAV-EGFP同納米材料復(fù)合后對(duì)PBMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，棄去上層培養(yǎng)液，采用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)轉(zhuǎn)染結(jié)果，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

2　結(jié)　果

2.1納米材料復(fù)合物的粒徑和zeta-電位如圖1所示，在ZetaPALS電位分析儀上測(cè)定PEG-PEI/ pDNA和PEI/ pDNA的粒徑和zeta-電位，PEG-PEI和PEI納米復(fù)合體粒徑隨著N/P從1到30的增大而減小，表面電荷隨著N/P從1到30的增大而增大，同時(shí)在同一N/P下PEG-PEI/ pDNA較PEI/pDNA粒徑大，而電荷相對(duì)較低，結(jié)果表明PEG-PEI/pDNA結(jié)合的比較好。

圖1PEI與PEG-PEI在不同的N/P比下形成納米復(fù)合體后的粒徑和zeta-電位

2.2瓊脂糖凝膠電泳如圖2所示，右圖為對(duì)照組PEI的pDNA結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)在N/P比值為0.5以上時(shí)，泳動(dòng)才能被完全阻滯。左圖為PEG-PEI/pDNA結(jié)合后的電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)N/P=0.5時(shí)，PEG-PEI就完全結(jié)合pDNA。上述結(jié)果提示PEG-PEI與pDNA的結(jié)合能力較對(duì)照組PEI的更強(qiáng)，并有利于基因的轉(zhuǎn)染。

圖2PEI與PEG-PEI在不同的N/P比下形成復(fù)合物后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果從圖3可以得出，在PBMC細(xì)胞中，N/P<10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP和PEI /pAAV-EGFP的存活率相當(dāng)；N/P=10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP是81%，比PEI/pAAV-EGFP(59%)的細(xì)胞存活率要高(P<0.05)；N/P﹥10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP的細(xì)胞存活率比PEI /pAAV-EGFP低(P<0.05)。顯示在N/P=10時(shí)，PEG-PEI作為基因治療載體有很大的優(yōu)勢(shì)。

圖3PEI與PEG-PEI形成復(fù)合物后在PBMC細(xì)胞中的細(xì)胞毒性

2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果在PBMC細(xì)胞中，用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)N/P=10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP復(fù)合物表達(dá)的綠色熒光多，熒光強(qiáng)度大，因此提示PEG-PEI的轉(zhuǎn)染效果較PEI好，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。同時(shí)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)N/P=10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP在PBMC細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，同樣發(fā)現(xiàn)PEG-PEI/pAAV-EGFP的轉(zhuǎn)染效率最好，為28.9%；PEI/pAAV-EGFP 為12.5%，結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

N/P=10

注：采用倒置熒光顯微鏡觀察PEI/pDNA和PEG-PEI/pDNA

在N/P比=10時(shí)轉(zhuǎn)染PBMC細(xì)胞后的熒光細(xì)胞表達(dá)。

圖4PEI與PEG-PEI形成復(fù)合物后在PBMC細(xì)胞中的綠色熒光蛋白表達(dá)水平

注：在N/P=10時(shí)，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)PEI/pDNA和PEG-

PEI/pDNA的轉(zhuǎn)染效率。

圖5PEI與PEG-PEI形成復(fù)合物后在PBMC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

3　討　論

在基因治療研究領(lǐng)域，載體是至關(guān)重要的問題，因此安全高效的基因載體是實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵因素[6-7]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道[8-9]PEI的DNA親和性好，有利于DNA的復(fù)合及凝集，并利用PEI的“質(zhì)子海綿”功能，納米粒子在酸性溶酶體內(nèi)可以迅速地發(fā)生分子鏈構(gòu)象變化，產(chǎn)生較強(qiáng)的滲透壓而破壞溶酶體并釋放自由DNA。另外，PEG可以屏蔽正電荷而降低載體的陽(yáng)離子毒性，同時(shí)它還能提高納米粒子在血液中的穩(wěn)定性、增強(qiáng)載體對(duì)DNA分子的保護(hù)作用而使DNA在傳輸過程中不被酶降解、延長(zhǎng)聚合物-DNA納米粒子的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，這些因素有利于獲得更好的基因傳輸效率。因此本實(shí)驗(yàn)合成并體外檢測(cè)了PEG-PEI的理化特性、毒性和靶向傳輸及轉(zhuǎn)染能力。

本實(shí)驗(yàn)考慮到由于粒徑和zeta-電位是衡量復(fù)合物結(jié)合細(xì)胞能力進(jìn)入細(xì)胞的重要參數(shù)，從而合適的粒徑和表面電荷將有助于復(fù)合物通過有效的途徑進(jìn)入細(xì)胞膜。因此我們通過Zeta電位儀研究復(fù)合物的粒徑和表面電荷，本研究發(fā)現(xiàn)同一N/P下PEG-PEI/pDNA較PEI/pDNA粒徑大，而電荷相對(duì)較低，結(jié)果顯示PEG-PEI/ pDNA結(jié)合的比較好。

相關(guān)研究曾證實(shí)[10]因?yàn)楹怂岱肿訋ж?fù)電荷，當(dāng)加入陽(yáng)離子聚合物時(shí)，隨著聚合物含量的增加，會(huì)出現(xiàn)電中和甚至反轉(zhuǎn)從而使DNA向電場(chǎng)陽(yáng)極泳動(dòng)阻滯的現(xiàn)象，因此我們可以通過瓊脂糖凝膠電泳來確定陽(yáng)離子載體與DNA的相互作用。本研究所示，當(dāng)N/P=0.5時(shí)，PEG-PEI就完全結(jié)合pDNA，而對(duì)照組PEI，發(fā)現(xiàn)在N/P比值為0.5以上時(shí)，泳動(dòng)才能被完全阻滯。上述結(jié)果提示PEG-PEI較對(duì)照組PEI有更強(qiáng)的pDNA結(jié)合能力，從而提高基因轉(zhuǎn)染能力。

基因載體的轉(zhuǎn)染效率與納米材料或者復(fù)合體的細(xì)胞毒性相關(guān)，如果復(fù)合物的毒性高，則相應(yīng)的轉(zhuǎn)染表達(dá)水平也可能會(huì)下降[11]。我們發(fā)現(xiàn)在PBMC細(xì)胞中，N/P<10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP和PEI /pAAV-EGFP的存活率相當(dāng)，N/P=10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP比PEI/pAAV-EGFP的細(xì)胞存活率要高，而N/P﹥10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP的細(xì)胞存活率比PEI /pAAV-EGFP低，說明納米材料在改造后同樣用量的時(shí)候毒性大大降低了。同時(shí)本研究采用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀衡量復(fù)合物在PBMC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效果。我們觀測(cè)到N/P=10時(shí)PEG-PEI/pAAV-EGFP復(fù)合物表達(dá)的綠色熒光較多，熒光強(qiáng)度更大，因此提示PEG-PEI的轉(zhuǎn)染效果較PEI好，另外流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了同樣的結(jié)果。

綜上所述，本研究明確了PEG-PEI的基因轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性作用,同時(shí)證實(shí)PEG-PEI各方面的性能都優(yōu)于PEI，從而提示我們PEG-PEI可以作為PBMC細(xì)胞基因傳輸?shù)妮d體。

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A Study of Targeted Nano Materials as PBMCs Gene Vector

DONGYan-xian1,YAOHui-yan2,LIANGBing3,ZHONGGao-xian2，DIAOFang-ming2，SHIHong-ting2

(1.Dept.ofCerebrovascular,TheFirstAffiliatedUnionHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangdongGuangdong510150;2.Dept.ofCerebrovascular,TheForthAffiliatedUnionHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouGuangdong511447;3.Dept.ofCerebrovascular,TheSecondAffiliatedUnionHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,GuangdongGuangdong510000)

Objective: To investigate the feasibility of targeted nanoparticles as gene vector, we synthesized polyethyleneglycol polyethylenimine(PEG-PEI)，and studied its capability of carrying plasmid DNA, analyzed its characterization as nanoparticle/DNA complex, assessed its cytotoxicity in vitro and measured its transfection efficiency. Methods: using PEI as control, we first developed PEG-PEI, and tested its cytotoxicity to the rat PBMCs via MTT assay. The transfection efficiency of the nanoparticle/DNA complex was also measured by EGFP immunofluorescence and flow cytometry. Results: When the N/P <10, the viability of PEG-PEI and PEI transfected cells were 82.7% and 81.3% respectively (P﹥0.05); when the N/P =10, the viability of PEG-PEI transfected cells was 81%, but that of PEI transfected cells was 59% (P<0.05); similarly, when the N/P﹥10, MTT assay results showed that the toxicity of the PEG-PEI was lower than PEI (P<0.05). The EGFP intensity of PEG-PEI (N/P =10) was much higher than PEI(N/P =10,P<0.05)assessed by inverted microscope fluorescence observation method；the flow cytometry results also showed that the transfection efficiency of PEG-PEI (N/P=10) and PEI(N/P=10) was 28.9% and 12.5%, respectively (P<0.05). Conclusion: The nanopaticle (PEG-PEI) exhibited lower toxicity and higher transfection efficiency, and therefore is the more suitable transfection carrier for gene therapy for multiple sclerosis.

Nano materials;PEG-PEI; In vitro gene transfer

廣東省自然科學(xué)基金(批文號(hào)：S2013010011760)

R285.5

A

1001-5779(2016)03-0343-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.003

2016-01-26)(責(zé)任編輯：敖慧斌)