兩步培養(yǎng)法測(cè)定厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的最佳條件

石 妍，肖 順， 劉國(guó)坤， 張紹升

福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州 350002)

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兩步培養(yǎng)法測(cè)定厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的最佳條件

石 妍，肖 順， 劉國(guó)坤， 張紹升*

福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州 350002)

[目的] 探討厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)厚垣孢子的條件。[方法] 采用兩步培養(yǎng)法測(cè)定碳源、氮源、碳氮摩爾比、pH等不同營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件對(duì)厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株產(chǎn)厚垣孢子的影響。[結(jié)果]PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)厚垣孢子條件為：初始碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1，最佳碳氮源組合為蔗糖/NaNO3，培養(yǎng)基最佳pH為8.0。PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)分生孢子條件為：初始碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1，最佳碳氮源組合為D-果糖/NaNO3,最佳pH為5.0。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為厚垣孢普可尼亞菌生防制劑的生產(chǎn)調(diào)控提供依據(jù)。

厚垣孢普可尼亞菌；產(chǎn)孢；營(yíng)養(yǎng)條件

厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)是根結(jié)線蟲(chóng)和胞囊線蟲(chóng)卵及雌蟲(chóng)的寄生菌[1]，是國(guó)內(nèi)外目前研究較多的線蟲(chóng)寄生真菌之一，在無(wú)性世代能產(chǎn)生大量磚格狀的、對(duì)高溫、干旱和營(yíng)養(yǎng)貧瘠等不良環(huán)境具有強(qiáng)耐受力的厚垣孢子，使其易在土壤中存活[1-2]。此外，厚垣孢普可尼亞菌對(duì)植物不具有致病性[2]，是一種具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景的線蟲(chóng)生防真菌。研究表明，營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件對(duì)真菌產(chǎn)孢的類型有較大的影響，可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件的改變來(lái)控制生產(chǎn)所需的孢子類型，以獲得耐受力(耐干燥、高溫)較強(qiáng)的孢子。筆者采用兩步培養(yǎng)法探討碳源、氮源、碳氮比、pH等不同營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件對(duì)厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株產(chǎn)厚垣孢子的影響，以期為其固態(tài)擴(kuò)大培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株厚垣孢普可尼亞菌菌株P(guān)C021120-152，由福建農(nóng)林大學(xué)植物線蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.2真菌孢子懸浮液的制備PDA斜面菌種活化后，加入適量無(wú)菌水，用接種針刮取菌落表面，用微型旋渦混合儀振蕩使孢子均勻分散，使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，再用無(wú)菌水將孢子懸浮液濃度調(diào)至106個(gè)/mL，備用。

1.3營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響

1.3.1碳源?；A(chǔ)培養(yǎng)基(Czapek培養(yǎng)基)[3]：蔗糖30.00 g/L、NaNO32.00 g/L、 K2HPO41.00 g/L、 FeSO4·7H2O 0.01 g/L、KCl 0.50 g/L、MgSO4·7H2O 0.50 g/L、瓊脂18.00 g/L，pH自然。

用相同碳量的碳源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖為碳源。供試碳源為：葡萄糖、乳糖、D-果糖、可溶性淀粉。以無(wú)碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)，3次重復(fù)。

1.3.2氮源。用相同氮量的氮源代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NaNO3為氮源。供試氮源為：NH4Cl、脲(CH4N2O)、L-酪氨酸(C9H11NO3)、甘氨酸(C2H5NO2)。以無(wú)氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)，3次重復(fù)。

1.3.3碳氮源組合。根據(jù)碳氮源單因素試驗(yàn)，以可溶性淀粉、蔗糖、D-果糖為碳源，以NaNO3、L-酪氨酸為氮源，配成6種不同碳氮源組合的培養(yǎng)基。3次重復(fù)。

1.3.4碳氮比(摩爾比)。根據(jù)篩選出的最佳碳氮源，設(shè)定碳源起始濃度為3.00、6.00、12.00、24.00 g/L；氮源起始濃度為0.35、0.70、1.40、2.80 g/L；16種不同碳氮濃度組合所得的碳氮比范圍為:1.25∶1～80.00∶1。3次重復(fù)。

1.3.5pH。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果配制培養(yǎng)基，滅菌前用1.0 mol/L HCl 和1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，分別為4、5、6、7、8、9。以不調(diào)整pH的培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)，3次重復(fù)。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1兩步培養(yǎng)法。參考Sun等[4]的方法，稍做改動(dòng)。①在培養(yǎng)皿中倒入基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，在培養(yǎng)基表面放無(wú)菌玻璃紙(φ7.5 cm)。將孢子懸浮液(接種量為100 μL)接種到玻璃紙上，用無(wú)菌玻璃刮鏟來(lái)回充分涂勻。正面靜置20～30 min，用parafilm封口。28 ℃下倒置黑暗培養(yǎng)，3次重復(fù)。②4 d后，將玻璃紙移至不同營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，用鑷子輕刮玻璃紙上的菌落，然后將菌落放入裝有100 mL體積分?jǐn)?shù)為0.15%的吐溫-80溶液的三角瓶中，置于微型旋渦混合儀上充分渦旋混合，稀釋成一定倍數(shù)后，取樣，計(jì)孢子數(shù)，3次重復(fù)。

1.4.2孢子計(jì)數(shù)。分生孢子使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；厚垣孢子由于其直徑(20～25 μm)較大，不易用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，故用以下方法計(jì)數(shù)：用移液槍吸取20 μL孢子懸浮液于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于光學(xué)顯微鏡下逐一計(jì)數(shù)，3次重復(fù)。1.5數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與繪圖，使用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，方差分析采用Duncan’s新復(fù)極差法。2結(jié)果與分析

2.1不同碳源對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響從圖1、2可以看出，5種碳源對(duì)菌株P(guān)C021120-152產(chǎn)孢有顯著影響。可溶性淀粉最有利于產(chǎn)厚垣孢子，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)到3.04×106個(gè)/菌落，其中α-乳糖的產(chǎn)孢量少于對(duì)照。就產(chǎn)分生孢子而言，以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，達(dá)到2.17×109個(gè)/菌落。5種碳源產(chǎn)分生孢子量均高于對(duì)照。由此可見(jiàn)，供試菌株P(guān)C021120-152產(chǎn)分生孢子和產(chǎn)厚垣孢子所需的最佳碳源不同。

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖1　不同碳源對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.1　Effects of carbon sources on chlamydospore production of P.chlamydosporia

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖2　不同碳源對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響Fig.2　Effects of carbon sources on conidiophore production of P.chlamydosporia

2.2不同氮源對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響從圖3可以看出，厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152在以NaNO3為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)厚垣孢子量最大，為3.50×106個(gè)/菌落，其次為L(zhǎng)-酪氨酸，其他3種氮源的產(chǎn)孢量均低于對(duì)照。就產(chǎn)分生孢子而言，也是NaNO3最利于產(chǎn)分生孢子，以脲、NH4Cl、甘氨酸為氮源的處理產(chǎn)分生孢子量低于對(duì)照(圖4)。由此可見(jiàn)，以NaNO3為氮源，既有利于產(chǎn)厚垣孢子，又有利于產(chǎn)分生孢子。

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖3　不同氮源對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.3　Effects of nitrogen sources on chlamydospore production of P.chlamydosporia

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖4　不同氮源對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響Fig.4　Effects of nitrogen sources on conidiophore production of P.chlamydosporia

2.3最佳碳氮源組合的確定由表1可知，產(chǎn)厚垣孢子量最大的碳氮源組合為蔗糖/ NaNO3，其次為可溶性淀粉/ NaNO3和D-果糖/ NaNO3，與其他碳氮源組合差異顯著；D-果糖/ NaNO3的碳氮源組合分生孢子產(chǎn)量最大，其次為蔗糖/ NaNO3組合。2.4碳源濃度和碳氮摩爾比對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響從表2可以看出，碳源濃度、碳氮摩爾比對(duì)菌株P(guān)C021120

表1　不同碳氮源組合對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響

注:同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column mean significant differences (P<0.05).

-152產(chǎn)厚垣孢子量有顯著的影響。當(dāng)碳源起始濃度為3.00 g/L時(shí)，碳氮摩爾比為2.5∶1的處理的產(chǎn)孢量是所有處理中最大的，達(dá)24.00×105個(gè)/菌落。當(dāng)碳源濃度較低時(shí)(3.00和6.00 g/L)，碳氮摩爾比小的處理(碳氮摩爾比為2.5∶1)厚垣孢子產(chǎn)量較大。當(dāng)碳源濃度較高時(shí)(12.00和24.00 g/L)，碳氮摩爾比大的處理(碳氮摩爾比為20∶1)厚垣孢子產(chǎn)量較大。當(dāng)碳源濃度為24.00 g/L時(shí)，所有處理的產(chǎn)孢量開(kāi)始減少。

碳源濃度和碳氮摩爾比對(duì)菌株VC021120-152產(chǎn)分生孢子也有顯著的影響。當(dāng)碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1的處理產(chǎn)孢量也最大，達(dá)到31.80×108個(gè)/菌落，與其他處理差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表2碳源濃度和碳氮比對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響

Table 2Effects of carbon concentration and carbon-nitrogen molar ratio on sporulation ofP.chlamydosporia

碳源濃度Carbonconc-entrationg/L碳氮摩爾比Carbon-nitrogenmolarratio厚垣孢子產(chǎn)量Chlamydosporeproduction×105個(gè)/菌落分生孢子產(chǎn)量Conidiophoreproduction×108個(gè)/菌落3.010∶17.33±0.16bh7.35±0.90def3.05∶19.08±0.04f6.43±0.26efg3.02.5∶124.00±0.21a31.80±2.71a3.01.25∶110.80±0.29d9.07±0.18c6.020∶11.30±0.08j13.70±0.08b6.010∶114.30±0.22c8.73±0.06cd6.05∶10.92±0.01ki5.63±0.71fg6.02.5∶115.50±0.15c6.66±0.29fg12.040∶111.00±0.21d4.35±1.36g12.020∶116.30±0.23b7.36±0.70def12.010∶110.00±0.16e4.67±0.58g12.05∶18.73±0.07g6.54±0.26efg24.080∶10.67±0.02i4.97±0.12g24.040∶10.34±0.02m9.73±1.79c24.020∶17.00±0.02h15.30±0.77b24.010∶11.08±0.03jk7.72±1.41cde

注:同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in the same column mean significant differences (P<0.05).

2.5pH對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)孢的影響從圖5可以看出，弱堿性條件有利于厚垣孢子的產(chǎn)生。當(dāng)pH為8.0時(shí)，厚垣孢子產(chǎn)量最大，與其他處理差異顯著。就產(chǎn)分生孢子而言，當(dāng)pH為5.0時(shí)產(chǎn)孢量較大(圖6)，與Gao等[5]報(bào)道的結(jié)果相似。

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖5　不同pH對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)厚垣孢子的影響Fig.5　Effects of different pH on chlamydospore production of P.chlamydosporia

注:不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different letters mean significant differences (P<0.05).圖6　不同pH對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響Fig.6　Effects of different pH on conidiophore production of P.chlamydosporia

3　結(jié)論與討論

真菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢所需的營(yíng)養(yǎng)條件不同，適合其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的條件并不一定適合其產(chǎn)孢。兩步培養(yǎng)法是指使待測(cè)真菌在適宜該真菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)至產(chǎn)孢前，然后將獲得的產(chǎn)孢前的營(yíng)養(yǎng)菌絲體轉(zhuǎn)移至不同營(yíng)養(yǎng)成分或不同環(huán)境條件的新鮮培養(yǎng)基中，進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)[4]。筆者采用兩步培養(yǎng)法確定了厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)厚垣孢子條件：初始碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1，最佳碳氮源組合為蔗糖/NaNO3，最佳pH為8.0。PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)分生孢子條件為：初始碳源濃度為3.00 g/L，碳氮摩爾比為2.5∶1，最佳碳氮源組合為D-果糖/ NaNO3，最佳pH為5.0。由此可見(jiàn)，厚垣孢普可尼亞菌PC021120-152菌株的最佳產(chǎn)分生孢子和厚垣孢子的營(yíng)養(yǎng)條件不同，在該生防菌劑的發(fā)酵調(diào)控中根據(jù)需要選擇最適合的產(chǎn)孢條件。

培養(yǎng)基的組成和配比合適與否對(duì)微生物的生長(zhǎng)、繁殖、代謝和產(chǎn)物形成都會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。影響真菌產(chǎn)孢的因素主要有培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)、pH、濕度、無(wú)機(jī)鹽。培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不能太豐富，碳源、氮源不宜過(guò)多，尤其是有機(jī)氮源含量要少一些，否則不易形成孢子，而無(wú)機(jī)鹽的用量會(huì)影響孢子的顏色和數(shù)量[6]。關(guān)于營(yíng)養(yǎng)、pH、溫度、光照、水活度等條件對(duì)厚垣孢普可尼亞菌產(chǎn)分生孢子的影響已有報(bào)道[5，7-10]，但這些條件對(duì)其產(chǎn)厚垣孢子的影響卻鮮有報(bào)道。厚垣孢子的產(chǎn)生是菌株應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺失或者其他環(huán)境壓力(如高溫、高壓、干燥等)的一種方式[11]，使其易在土壤中存活。孢子是真菌殺蟲(chóng)劑的主要成分，能否在人工培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量孢子是評(píng)價(jià)菌株作為是否有潛力的重要標(biāo)準(zhǔn)。液固雙相發(fā)酵在微生物大批量培養(yǎng)中應(yīng)用廣泛，它是指經(jīng)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)出菌絲或孢子后接入固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子的方法，此過(guò)程與兩步培養(yǎng)法相似。Sun等[4]研究表明采用兩步培養(yǎng)法獲得的最佳碳氮源產(chǎn)孢量比連續(xù)培養(yǎng)法相應(yīng)的碳氮源產(chǎn)孢量多。在連續(xù)培養(yǎng)中，菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)會(huì)改變培養(yǎng)基的成分，降低其營(yíng)養(yǎng)，無(wú)法確定真菌產(chǎn)孢階段的起始濃度。采用兩步培養(yǎng)法確定的真菌產(chǎn)孢營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件對(duì)于指導(dǎo)真菌生防菌劑的生產(chǎn)、提高固態(tài)發(fā)酵的產(chǎn)孢量具有一定的意義。

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Optimum Conditions for Sporulation ofPochoniachlamydosporiain Two-stage Cultivation

SHI Yan,XIAO Shun,LIU Guo-kun,ZHANG Shao-sheng*

(College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002)

[Objective] To discuss the nutritional conditions for sporulation ofPochoniachlamydosporia. [Method] A two-stage cultivation method was used to determine the effects of various nutritional and environmental conditions (carbon sources,nitrogen sources,carbon-nitrogen molar ratio,and pH) on the sporulation ofP.chlamydosporiaPC021120-152.[Result] Chlamydospore production of PC021120-152 strains was the highest when the initial carbon concentration was 3.00 g/L; the carbon-nitrogen molar ratio was 2.5∶1; sucrose/NaNO3was as the carbon/nitrogen source,and the pH was 8.Conidiophore production of PC021120-152 strains was the highest when the initial carbon concentration was 3.00 g/L; the carbon-nitrogen molar ratio was 2.5∶1; D-fructose/NaNO3was as the carbon/nitrogen source,and the pH was 5.0.[Conclusion] The research provides

for industrialization of biocontrol agents ofP.chlamydosporia.

Pochoniachlamydosporia; Sporulation; Nutritional conditions

中國(guó)煙草總公司福建公司科技項(xiàng)目(閩煙2012[041]號(hào))。

石妍 (1986- )，女，福建三明人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事微生物發(fā)酵方面的研究。*通訊作者，教授，博士生導(dǎo)師，從事植物病理學(xué)方面的研究。

2016-07-11

S 432.4+4

A

0517-6611(2016)26-0016-04