趨化因子受體4、7在皮膚黑素瘤、色素痣組織中的表達(dá)及意義

楊瑩 王光平 溫斯健 宋昊 王小坡 張韡 孫建方

·論著·

趨化因子受體4、7在皮膚黑素瘤、色素痣組織中的表達(dá)及意義

楊瑩 王光平 溫斯健 宋昊 王小坡 張韡 孫建方

目的 探討皮膚黑素瘤和色素痣組織中趨化因子受體4（CXCR4）和趨化因子受體7（CXCR7）的表達(dá)及其與病理特征的相關(guān)性。方法 免疫組化法檢測CXCR4、CXCR7在兩個(gè)組（黑素瘤組及色素痣組）中的表達(dá)情況。結(jié)果 黑素瘤組與色素痣組免疫組化比較：CXCR4分別是20%（8/40）和50%（20/40）為（-）；12.5%（5/40）和42.5%（17/40）為（+）；32.5%（13/40）和7.5%（3/40）為（++）；35%（14/40）和0%（0/40）為（+++）；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05）。CXCR7分別是15%（6/40）和35%（14/40）為（-）；10%（4/40）和62.5%（25/40）為（+）；22.5%（9/40）和2.5%（1/40）為（++）；52.5%（21/40）和0為（+++）；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05）。CXCR4的表達(dá)水平在年齡、性別、Breslow厚度、潰瘍情況、淋巴細(xì)胞浸潤情況分組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在發(fā)病部位、Clark分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CXCR7的表達(dá)水平在年齡、性別、潰瘍情況、淋巴細(xì)胞浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在發(fā)病部位、Breslow厚度、Clark分級(jí)分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 皮膚黑素瘤和色素痣組織標(biāo)本中，CXCR4和CXCR7有不同程度的表達(dá)，CXCR4和CXCR7可能參與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。

黑色素瘤；痣；免疫組織化學(xué)；受體，CXCR4；受體，CXCR7

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）；Postgraduate Innovation Fund of Peking Union Medical College（201410023005）

亞洲人黑素瘤的平均年發(fā)病率相比白色人種較低，2005—2007年我國的發(fā)病率1/10萬，每年新發(fā)病例約2萬人［1］。黑素瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率僅14%［2］。目前認(rèn)為，惡性腫瘤的特異性轉(zhuǎn)移可能與腫瘤細(xì)胞的趨化性相關(guān)，趨化因子及其受體可能參與了惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移［3］。趨化因子受體（CXCR）4及其配體CXCL12（SDF?1）是人趨化因子家族中的成員之一。以往研究認(rèn)為，CXCR4是CXCL12的唯一受體，近來研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7是CXCL12的另一趨化因子受體［4］。李小靜等［5］研究顯示，CXCR7在基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、皮膚黑素瘤中的表達(dá)陽性率逐漸升高，與腫瘤的惡性程度一致。為探討皮膚黑素瘤、色素痣組織中CXCR4和CXCR7的表達(dá)及其與黑素瘤臨床病理特征的相關(guān)性，我們用免疫組化法檢測皮膚黑素瘤和色素痣石蠟切片中CXCR4和CXCR7的表達(dá)，將同一組織標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)性切片觀察CXCR4和CXCR7的表達(dá)模式及表達(dá)強(qiáng)度，并進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 資料：

1.1.1 組織來源：皮膚黑素瘤和色素痣石蠟標(biāo)本來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院病理科切片庫，按照切片編號(hào)（2013年8月至2015年8月），分為40例黑素瘤組和40例色素痣組，標(biāo)本均經(jīng)臨床、組織病理或免疫病理證實(shí)診斷。選用的組織標(biāo)本用切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)性切片后用于HE染色及不同抗體的檢測，制片后備用。40例皮膚黑素瘤患者中，男18例，女22例；年齡32～84歲，平均60.4歲；肢端皮膚黑素瘤33例，非肢端皮膚黑素瘤7例；ClarkⅠ～Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ～V級(jí)22例。40例色素痣組織均為普通色素痣。

1.1.2 主要試劑：CXCR4抗體購自美國RD公司，CXCR7抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、免疫組化Max Vision試劑、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法：HE染色和免疫組化法按常規(guī)方法操作。結(jié)果判定：與同一批連續(xù)切片后制片的HE切片、陰性對(duì)照切片對(duì)照觀察以排除黑素對(duì)結(jié)果判定的干擾，在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，著色強(qiáng)度：深褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，不著色或著色不清為0分。陽性細(xì)胞：＞50%計(jì)3分，10%～50%計(jì)2分，＜10%計(jì)1分，不著色計(jì)0分，將所計(jì)分?jǐn)?shù)相乘得出免疫組化積分，0分計(jì)（-），1～3分計(jì)（+），4～6分計(jì)（++），6～9分計(jì)（+++）。結(jié)果由兩位皮膚病理醫(yī)師獨(dú)立判斷，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。雙向有序且屬性相同的列聯(lián)表分析用Kappa檢驗(yàn)，單向有序列聯(lián)表等級(jí)資料之間的比較用Mann?Whitney U秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4與CXCR7的表達(dá)：CXCR4在黑素瘤和色素痣組織中有胞質(zhì)或胞核的表達(dá)，而CXCR7在黑素瘤和色素痣組織中有胞質(zhì)的表達(dá)。在黑素瘤標(biāo)本中，CXCR4和CXCR7的陽性表達(dá)率分別為80%（32/40）和85%（34/40）；在色素痣標(biāo)本中，CXCR4和CXCR7的陽性表達(dá)率分別為50%（20/40）和65%（26/40）。兩組比較，CXCR4和CXCR7的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。黑素瘤組織標(biāo)本中，CXCR4和CXCR7多呈中、高表達(dá)，色素痣組織標(biāo)本中，CXCR4和CXCR7多呈陰性表達(dá)、低表達(dá)（圖1，2，表1）。

表1 CXCR4、CXCR7在黑素瘤與色素痣組織標(biāo)本中的表達(dá)［例（%）］

2.2 CXCR4與CXCR7表達(dá)的一致性分析：Kappa檢驗(yàn)法進(jìn)行一致性分析，結(jié)果顯示，黑素瘤組織標(biāo)本中，Kappa值=0.393＜0.4，說明兩者的一致性較差，P＜0.001。在色素痣組織標(biāo)本中，0.4＜Kappa值=0.507＜0.7，說明兩者的一致性一般，P＜0.01。

2.3 CXCR4與CXCR7的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系：以患者年齡、性別、發(fā)病部位、Breslow厚度、Clark分級(jí)、潰瘍情況、淋巴細(xì)胞浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組后進(jìn)行分析。CXCR4表達(dá)在年齡、性別、Breslow厚度、潰瘍情況、淋巴細(xì)胞浸潤情況分組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但在發(fā)病部位、Clark分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且CXCR4在非肢端、ClarkⅢ ～ V級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中呈高表達(dá)，見表2。CXCR7表達(dá)在年齡、性別、潰瘍情況、淋巴細(xì)胞浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但在發(fā)病部位、Breslow厚度、Clark分級(jí)分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且CXCR7在非肢端、Breslow厚度＞1.00 mm、ClarkⅢ～V級(jí)分組中呈高表達(dá)，見表3。

圖1 黑素瘤組織標(biāo)本中，CXCR4在胞質(zhì)和胞核中呈高表達(dá)，CXCR7在胞質(zhì)中呈高表達(dá)（免疫組化×200） 1A：HE染色；1B：CXCR4陽性染色；1C：CXCR7陽性染色；1D：陰性對(duì)照

圖2 色素痣組織標(biāo)本CXCR4在胞質(zhì)和胞核中呈低表達(dá)，CXCR7在胞質(zhì)中呈低表達(dá)（免疫組化× 200） 2A：HE染色；2B：CXCR4陽性；2C：CXCR7陽性；2D：陰性對(duì)照

表2 趨化因子受體4與黑素瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系（例數(shù)）

表3 趨化因子受體7與黑素瘤臨床病理學(xué)特征的關(guān)系（例數(shù)）

3 討論

CXCR4及其配體CXCL12在腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移中具有特殊的重要性，目前至少有23種不同的腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR4［6］。研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤組織CXCR4的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)［7?9］，黑素瘤細(xì)胞表達(dá)的CXCR4參與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移過程［10?11］，過表達(dá)CXCR4的小鼠B16黑素瘤細(xì)胞向小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的能力增強(qiáng)［12］。以往的研究認(rèn)為，CXCR4是CXCL12的唯一受體，然而新的研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12的另一趨化因子受體CXCR7［4］，又名非典型趨化因子受體3（ACKR3）。研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤細(xì)胞也表達(dá)CXCR7，且與非侵襲性黑素瘤細(xì)胞比較，侵襲性黑素瘤細(xì)胞呈過表達(dá)CXCR7［13］，體內(nèi)試驗(yàn)中抑制CXCR7而不是CXCR4b能延緩青鳉魚黑素瘤模型的腫瘤進(jìn)展［14］。因此，CXCR4和CXCR7在黑素瘤進(jìn)展中發(fā)揮的具體作用目前尚存不同意見，有待進(jìn)一步研究。

本研究中，以皮膚黑素瘤及色素痣組織的石蠟標(biāo)本切片作為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組化法分別檢測CXCR4和CXCR7的表達(dá)，與同一批連續(xù)切片后制片的HE切片、陰性對(duì)照切片對(duì)照觀察以排除黑素對(duì)結(jié)果判定的干擾。研究顯示，在皮膚黑素瘤和色素痣組織標(biāo)本中，CXCR4和CXCR7有不同程度的表達(dá)，CXCR4和CXCR7在皮膚黑素瘤組織中較多呈中、高表達(dá)，在色素痣組織標(biāo)本中較多呈陰性表達(dá)、低表達(dá)。這一結(jié)果提示，CXCR4和CXCR7可能參與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展，為后續(xù)研究提供了理論基礎(chǔ)。然而，本研究結(jié)果顯示，CXCR4和CXCR7的表達(dá)水平在黑素瘤組織中的一致性較差，在色素痣組織標(biāo)本中的一致性一般，提示CXCR4和CXCR7的表達(dá)水平在黑素瘤、色素痣中可能無明顯相關(guān)。

但是，本研究結(jié)果顯示，CXCR4的表達(dá)與發(fā)病部位、Clark分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，在非肢端、ClarkⅢ～V級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中呈高表達(dá)，CXCR7的表達(dá)水平與發(fā)病部位、Breslow厚度、Clark分級(jí)相關(guān)，在非肢端、Breslow厚度＞1.00 mm、ClarkⅢ～V級(jí)分組中呈高表達(dá)，提示CXCR4、CXCR7的表達(dá)水平與黑素瘤預(yù)后相關(guān)，CXCR4和CXCR7的高表達(dá)可能在一定程度上提示腫瘤更高的惡性程度和預(yù)后不良。然而，我們的研究結(jié)果與既往研究有相似也有不同之處。Longo?Imedio等［7］研究顯示，黑素瘤患者CXCR4的表達(dá)水平與腫瘤出現(xiàn)潰瘍、腫瘤厚度大、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、患者高死亡率呈正相關(guān)。Toyozawa等［8］研究顯示，CXCR4高表達(dá)與腫瘤厚度、結(jié)節(jié)型及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。而Scala等［9］研究顯示，CXCR4的表達(dá)水平與年齡、性別、部位、Breslow厚度、Clark分級(jí)、潰瘍、結(jié)節(jié)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等上述臨床病理參數(shù)無關(guān)，但與患者的無病生存期及總生存期相關(guān)，同樣認(rèn)為黑素瘤患者高表達(dá)CXCR4提示預(yù)后不良。Salmaggi等［15］在原發(fā)部位為肺癌、乳腺癌、腎癌、結(jié)腸癌及黑素瘤的腦轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本中檢測CXCR4和CXCR7的表達(dá)，未能發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)水平與不良預(yù)后相關(guān)。但遺憾的是，我們的研究沒有包括遠(yuǎn)期生存及復(fù)發(fā)的隨訪資料，不能直接證明CXCR4和CXCR7的表達(dá)與不良預(yù)后直接相關(guān)，擴(kuò)大樣本量以及進(jìn)行Kaplan?Meier生存分析有助于證實(shí)CXCR4和CXCR7的預(yù)后價(jià)值。

志謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院病理科李阿梅、邵雪寶、程偉、臧潔老師

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Expressions of chemokine receptors 4 and 7 in cutaneous malignant melanoma and pigmented nevus tissues and their significance

Yang Ying,Wang Guangping,Wen Sijian,Song Hao,Wang Xiaopo,Zhang Wei,Sun Jianfang.Department of Pathology,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

Objective To measure expressions of chemokine receptor 4（CXCR4）and CXCR7 in cutaneous malignant melanoma（CMM）and pigmented nevus tissues,and to explore their correlations with pathological features.Methods Skin specimens were obtained from the lesions of 40 patients with CMM（CMM group）and 40 patients with pigmented nevus（pigmented nevus group）.An immunohistochemical study was performed to measure expressions of CXCR4 and CXCR7 in these specimens.Results In the CMM group,8（20.0%）and 6（15.0%）specimens were negative（-）,5（12.5%）and 4（10.0%）mildly positive（+）,13（32.5%）and 9（22.5%）moderately positive（++）,14（35.0%）and 21（52.2%）strongly positive（+++）,for CXCR4 and CXCR7 respectively.Of the pigmented nevus specimens,20（50.0%）and 14（35.0%）were negative（-）,17（42.5%）and 25（62.5%）mildly positive（+）,3（7.5%）and 1（2.5%）moderately positive（++）,for CXCR4 and CXCR7 respectively,but none was strongly positive（+++）for either of them.There were significant differences in the expressions of CXCR4 and CXCR7 between the CMM group and pigmented nevus group（U=317,256.5,respectively,bothP＜ 0.01）.The expression of CXCR4 was significantly higher in non?acral than in acral melanomas（U=38,P＜ 0.05）,higher in Clark’s levelⅢ－Ⅴ than inⅠ－Ⅱ melanomas（U=116,P＜ 0.05）,and higher in melanoma tissues from patients with lymphatic metastasis than in those without（U=16.5,P＜ 0.05）,but similar among patients of different age or gender,and among melanomas with different Breslow thickness,degrees of ulceration or lymphocytic infiltration（allP＞ 0.05）.No significant difference was observed in the expression of CXCR7 among patients of different age,gender,or among melanomas with different degrees of ulceration or lymphocytic infiltration,or between melanoma tissues from patients with lymphatic metastasis and those without（allP＞ 0.05）,but it was significantly higher in non?acral than in acral melanomas（U=64,P＜0.05）,higher in melanomas with Breslow thickness＞1.00 mm than in those≤1.00 mm（U=81.5,P＜ 0.05）,and higher in Clark’s levelⅢ－Ⅴ than inⅠ－Ⅱmelanomas（U=60.5,P＜ 0.05）.Conclusion Both CXCR4 and CXCR7 are expressed to different extents in CMM and pigmented nevus tissues,suggesting that they may participate in the occurrence and development of CMM.

Melanoma;Nevus;Immunohistochemistry;Receptors,CXCR4;Receptors,CXCR7

國家自然科學(xué)基金（81272992）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（201410023005）

10.3760/cma.j.issn.1673?4173.2016.06.001

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院病理科

孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

2016?042?22）