上海市動物源性大腸桿菌的分離鑒定和 藥敏試驗

寧 昆，沈莉萍，王曉旭，徐 鋒， 張維誼

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海　201103）

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上海市動物源性大腸桿菌的分離鑒定和 藥敏試驗

寧 昆，沈莉萍，王曉旭，徐 鋒， 張維誼

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海201103）

為掌握上海市動物源性大腸桿菌的耐藥情況及耐藥規(guī)律，對2013—2015年在門診畜禽中分離到的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗。共分離到236株大腸桿菌，其中豬源164株、禽源72株。選用15種抗生素，采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法，對大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感試驗。結(jié)果表明，無論是豬源大腸桿菌，還是禽源大腸桿菌，對大多數(shù)抗生素的耐藥程度均較高。其中，對磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、恩諾沙星和大觀霉素等抗生素的耐藥情況較為嚴(yán)重；對丁胺卡那霉素和阿莫西林/棒酸2種抗生素較為敏感，耐藥率低于20%。從耐藥譜型來看，豬源大腸桿菌較禽源大腸桿菌具有更加復(fù)雜的耐藥譜型。

大腸桿菌；分離鑒定；藥敏試驗；耐藥性

抗生素是一類對細(xì)菌、寄生蟲等具有抑制和殺滅作用的藥物，在畜牧飼料行業(yè)中已得到廣泛應(yīng)用，在動物疫病防治、提高飼料轉(zhuǎn)化效率、促進(jìn)畜禽生長方面發(fā)揮了重要作用。在我國，由于養(yǎng)殖密度大、畜禽疫病復(fù)雜、政府監(jiān)管力度不夠等多種原因，抗生素濫用現(xiàn)象較為嚴(yán)重，伴隨而來的耐藥問題也越來越嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展埋下了隱患。大腸桿菌病是養(yǎng)殖業(yè)中最為常見的一種細(xì)菌性疾病。在實際養(yǎng)殖過程中，由于畜主對藥物的濫用，使得許多常用抗菌藥物的藥效下降甚至無效，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1］。

動物養(yǎng)殖過程中濫用抗生素所帶來的影響最終是會通過各種途徑“轉(zhuǎn)嫁到”人身上，從而加劇抗生素耐藥性問題，影響人類的健康。因此，對畜禽大腸桿菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，掌握大腸桿菌耐藥規(guī)律及變化情況，對指導(dǎo)臨床合理用藥，減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

本實驗對上海市的畜禽大腸桿菌進(jìn)行了細(xì)菌的分離培養(yǎng)和生化鑒定，并對分離株進(jìn)行了藥物敏感試驗，討論了大腸桿菌在上海市的耐藥情況，為指導(dǎo)養(yǎng)殖戶臨床合理用藥提供了參考。

1　材料

1.1病料及標(biāo)準(zhǔn)株

病料（心、肝、脾、肺和腎臟）來自2013—2015年上海市動物疫病預(yù)防控制中心畜禽門診接收的發(fā)病畜禽。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25922）由上海市獸藥飼料檢測所饋贈。

1.2主要試劑與儀器

革蘭氏染色液，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美蘭瓊脂和哥倫比亞瓊脂，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；無菌羊血，購自上海市閔行區(qū)諸翟無菌動物血試劑供應(yīng)站；比濁儀、API 20E和VITEK 2，購自法國梅里埃公司；藥敏板，購自天津金章科技發(fā)展有限公司，其含15種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氧氟沙星（OFL）、恩諾沙星（ENR）、阿莫西林（AMX）、慶大霉素（GEN）、多西環(huán)素（DOX）、頭孢噻呋（EFT）、磺胺異噁唑（SF）、氨芐西林（AMP）、大觀霉素（STP）、卡那霉素（KAN）、環(huán)丙沙星（CIP）、丁胺卡那霉素（AMK）、氟苯尼考（FFC）、復(fù)方新諾明（CO-SMZ）和阿莫西林/棒酸（AMC）。

2　方法

2.1細(xì)菌的分離培養(yǎng)及鑒定

2.1.1初次分離培養(yǎng)。無菌采集畜禽的心、肝、脾、肺和腎臟，分別接種于巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和伊紅美蘭瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.2形態(tài)學(xué)觀察、鏡檢。觀察菌落生長情況，在麥康凱瓊脂平板上挑取紅色菌落，在伊紅美蘭瓊脂平板上挑取黑色帶金屬光澤菌落，進(jìn)行染色、鏡檢。

2.1.3純培養(yǎng)及生化鑒定。將可疑菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂，應(yīng)用API 20E和VITEK 2鑒定系統(tǒng)對細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

2.2藥敏試驗

2.2.1菌液制備。用滅菌棉簽取適量待測菌，懸浮于3 mL 0.45% NaCl溶液中，用比濁儀調(diào)整菌液的濃度，使其麥?zhǔn)蠁挝贿_(dá)到0.48～0.52；同時用ATCC 25922作為試驗質(zhì)控菌株。

2.2.2菌液接種。首先從12 mL肉湯管中吸取100 μL加到空白對照孔，然后吸取待測菌液100 μL到剩余的12 mL肉湯管中，混勻，加100 μL到其余各孔。質(zhì)控菌株操作同待測菌。

2.2.3孵育。將藥敏板置于墊有濕紗布的瓷方盤內(nèi)，36 ℃溫箱孵育16～18 h。

2.2.4結(jié)果觀察。在襯有黑底板的光線下觀察，無細(xì)菌生長的孔內(nèi)所含的最低抗菌藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。其中，對磺胺藥的終點判定，其與陽性生長對照，抑制80%細(xì)菌生長的藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果判定及質(zhì)量控制參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。

3　結(jié)果

3.1細(xì)菌分離鑒定

從2013—2015年門診畜禽中共分離到大腸桿菌236株，其中豬源164株、禽源72株。大腸桿菌在巧克力瓊脂平板上生長成圓形、凸起、濕潤、光滑、半透明、灰白色、直徑約2～3 mm的菌落；在麥康凱瓊脂上形成紅色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成黑色帶金屬光澤菌落。在光學(xué)顯微鏡下，大腸桿菌呈短桿狀，革蘭氏染色陰性。經(jīng)API 20E和VITEK 2 COMPACT鑒定系統(tǒng)確認(rèn)為大腸桿菌。

3.2藥敏試驗

3.2.1耐藥情況。本次試驗，質(zhì)控菌株及空白對照均成立，其余待測菌試驗結(jié)果見表1。164株豬源大腸桿菌對磺胺異噁唑、多西環(huán)素、氧氟沙星及頭孢噻呋等12種藥物的耐藥率達(dá)到了50%以上，其中對磺胺異噁唑等5種藥物的耐藥率甚至達(dá)到了90%以上；對丁胺卡那霉素和阿莫西林/棒酸的耐藥率較低，分別為13.4%和6.1%。72株禽源大腸桿菌的耐藥情況與豬源大腸桿菌相似，對磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、恩諾沙星及大觀霉素等12種藥物的耐藥率達(dá)到了50%以上，其中對磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明2種藥物的耐藥率達(dá)到了90%以上；對頭孢噻呋、丁胺卡那霉素和阿莫西林/棒酸的耐藥率在50%以下，分別為41.7%、8.3%和4.2%（表1）。

表1　豬源、禽源大腸桿菌耐藥情況

3.2.2多重耐藥情況和耐藥譜。164株豬源大腸桿菌，均耐4種藥物以上。其中，耐4～6種的有12株，占總數(shù)的7.3%；耐7～9種的有38株，占總數(shù)的23.2%；耐10～12種的有84株，占總數(shù)的51.2%；耐13～15種的有30株，占總數(shù)的18.3%；耐10種以上的占到了69.5%。72株禽源大腸桿菌中，耐3種藥物以下的有6株，占總數(shù)的8.3%；耐4～6種的有15株，占總數(shù)的20.8%；耐7～9種的有15株，占總數(shù)的20.8% ；耐10～12種的有18株，占總數(shù)的25%；耐13種以上的有18株，占總數(shù)的25%。該結(jié)果說明分離菌株多重耐藥情況十分嚴(yán)重。從耐藥譜型來看，豬源大腸桿菌的耐藥譜型明顯多于禽源大腸桿菌，共有51種。豬源、禽源大腸桿菌主要耐藥譜詳見表2。

3.2.3不同來源菌株耐藥比較。豬源、禽源大腸桿菌對藥物的敏感性見圖1。整體而言，禽源大腸桿菌對除磺胺異噁唑和大觀霉素之外的13種抗菌藥物的敏感性強(qiáng)于豬源大腸菌群。比如，禽源大腸桿菌和豬源大腸桿菌對阿莫西林的敏感性分別為16.7%和2.4%，對氨芐西林的敏感性分別為16.7%和0。兩種不同來源的分離菌株對其它抗菌藥物的敏感性沒有顯著差別。

表2　豬源、禽源大腸桿菌的主要耐藥譜型

圖1　豬源和禽源大腸桿菌對藥物的敏感性對比

4　討論

4.1大腸桿菌的分離鑒定

本研究中的大腸桿菌是從畜禽門診送檢的發(fā)病畜禽體內(nèi)分離得到的。由于動物疾病種類復(fù)雜多樣，很多缺乏典型癥狀，因此在接種病料時選擇了巧克力瓊脂平板、麥康凱及伊紅美藍(lán)瓊脂平板。目的是在保證不漏檢其它細(xì)菌的同時，增加對大腸桿菌的分離率。在大腸桿菌鑒定中，使用了商品化的微生物鑒定系統(tǒng)API 20E和VITEK 2，相較于傳統(tǒng)生化鑒定的耗時、繁瑣，此方法方便快捷，同時準(zhǔn)確率也有保證，可大大提高細(xì)菌的鑒定效率。

4.2大腸桿菌的耐藥性

對分離到的236株大腸桿菌（豬源164株、禽源72株），使用15種抗生素進(jìn)行藥敏試驗。試驗結(jié)果表明，大腸桿菌對其中12種抗生素有不同程度的耐藥；對磺胺類、青霉素類和四環(huán)素類抗生素耐藥率極高，達(dá)到80%以上，有些甚至達(dá)到95%以上。整體來看，豬源和禽源大腸桿菌的耐藥性無明顯差異，僅在個別藥物上有所區(qū)別。從耐藥譜型看，豬源大腸桿菌耐藥譜型明顯多于禽源大腸桿菌，推測與豬場臨床用藥更加不規(guī)范有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。此外，大腸桿菌的多重耐藥性十分嚴(yán)重，一半以上的細(xì)菌都耐10種以上藥物。這可能與臨床上藥物種類繁多、藥物濫用及大劑量使用有關(guān)。有研究表明，養(yǎng)殖場中多重耐藥的大腸桿菌在動物、環(huán)境和人體之間存在傳遞、擴(kuò)散現(xiàn)象，具有潛在的公共衛(wèi)生隱患。因此建議在臨床上使用抗生素時，要采用聯(lián)合用藥和交替用藥，必要時做藥敏試驗。根據(jù)結(jié)果合理選擇抗菌藥物，嚴(yán)格控制藥物劑量，避免細(xì)菌耐藥性的加重和蔓延［2］。

據(jù)文獻(xiàn)報道，在某地區(qū)畜禽大腸桿菌的藥敏分析中，丁胺卡那霉素耐藥率達(dá)到60%以上。在本研究中，該藥物的耐藥率在20%以下，說明大腸桿菌在不同地區(qū)的耐藥性差異較大，所以在臨床應(yīng)用時，切勿亂用藥，要因地制宜［1］。依據(jù)研究結(jié)果，在上海市治療大腸桿菌病時，建議使用阿莫西林/棒酸和丁胺卡那霉素，可提高疾病的治愈率。

4.3大腸桿菌耐藥性的控制策略

抗生素在防治畜禽疾病方面發(fā)揮了較大作用，但伴隨而來的耐藥問題及公共衛(wèi)生問題也日益嚴(yán)重。加強(qiáng)對細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測、管理和技術(shù)支持，對細(xì)菌耐藥性的控制具有重要意義。首先是監(jiān)測方面。應(yīng)建立健全監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，提高監(jiān)測水平和監(jiān)測質(zhì)量，保證及時、完整、準(zhǔn)確地獲得細(xì)菌耐藥性數(shù)據(jù)，用監(jiān)測結(jié)果指導(dǎo)養(yǎng)殖戶更加科學(xué)合理地使用抗生素［3］。其次是管理方面。要控制和管理制藥企業(yè)在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的不合理銷售及競爭行為，同時對基層獸醫(yī)從業(yè)人員進(jìn)行有效監(jiān)管，加強(qiáng)教育培訓(xùn)，提高其理論知識，防止抗生素濫用、亂用。最后是技術(shù)層面。臨床上可以使用一些中草藥，以減少抗生素的使用。例如：金銀花對耐青霉素的金黃色葡萄球菌有增敏作用，在低于抗菌濃度時還能增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬能力，對青霉素抗菌有增效作用；葛根芪連湯與氨芐青霉素配伍均有協(xié)同作用。同時也可以探索新的抗菌治療方法，來應(yīng)對細(xì)菌耐藥性問題，如抗生素的輪流替用和聯(lián)合用藥。

［1］ 江飆，董嘉文，張獻(xiàn)杰，等. 廣東地區(qū)動物源性大腸桿菌的分離及藥敏分析［J］.中國獸藥雜志，2009，43（1）：14-16.

［2］ 馬全朝，顧欣，張可煜，等. 上海市雞源大腸桿菌分離鑒定及藥敏分析［J］.中國家禽， 2009，31（17）：11-13.

［3］ 劉海林，武新國. 大腸桿菌的藥敏試驗報告［J］.當(dāng)代畜牧，2014（11）：70-71.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Isolation，Identifi cation and Antimicrobial Susceptibility Test to Escherichia coli of Animal Origin in Shanghai City

Ning kun，Shen Liping，Wang Xiaoxu，Xu Feng，Zhang Weiyi
（Shanghai Animal Disease Control Center，Shanghai 201103）

In order to investigate the antibiotic resistance of Escherichia coli of animal origin in Shanghai city，antimicrobial susceptibility test of 236 E.coli isolates from animal clinics to 15 antimicrobial agents was surveyed. Among them，164 strains were identified as swine origin，72 strains were identified as avian origin. Broth microdilution method according to the recommendation of the CLSI was used. The results showed that both E. coli from swine and avian showed antibiotic resistance to most antimicrobial agents. E.coli strains were highly resistant to sulfi soxazole，sulfamethoxazole，enrofl oxacin and spectinomycin，etc. Lower antibiotic resistance rate（ ≤20%）against amikacin and amoxicillin or clavulanate was showed. In addition，E.coli from swine had a more complex type of drug resistance spectrum than E.coli from avian.

E.coli；isolation and identifi cation；antimicrobial susceptibility test；antibiotic resistance

S852.61

B

1005-944X（2016）09-0023-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.008

上海地區(qū)主要動物病原微生物種質(zhì)資源保存利用（滬農(nóng)科攻字〔2014〕第7-3-3號）

張維誼