γ-干擾素ELISA檢測方法在牛結(jié)核病流行病學調(diào)查中的應(yīng)用

吳亞文，王曉亮，張玉玲，王玉梅，李志紅，張學軍

（寧夏回族自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川　750011）

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γ-干擾素ELISA檢測方法在牛結(jié)核病流行病學調(diào)查中的應(yīng)用

吳亞文，王曉亮，張玉玲，王玉梅，李志紅，張學軍

（寧夏回族自治區(qū)動物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川750011）

［目的］了解寧夏賀蘭縣奶牛結(jié)核病的流行情況，為制定寧夏地區(qū)牛結(jié)核病凈化方案提供參考。［方法］2015年采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA檢測方法，對寧夏賀蘭縣2個規(guī)?；膛鲩_展牛結(jié)核病流行病學調(diào)查，共檢測奶牛2 230頭。［結(jié)果］ 在2個規(guī)模化奶牛場累計檢測出皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性奶牛79頭，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA雙陽性奶牛72頭，雙陽性率為3.23%（72/2 230）。［結(jié)論］ γ-干擾素ELISA檢測方法準確度較高；在對牛群進行結(jié)核病檢測時，先以皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法篩測，再結(jié)合γ-干擾素ELISA檢測結(jié)果確診，更有利于牛結(jié)核病的檢測與凈化。

牛結(jié)核??；γ-干擾素ELISA；皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)；流行病學調(diào)查

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種人獸共患慢性傳染病，在全球范圍內(nèi)廣泛流行［1］。結(jié)核分枝桿菌主要有牛型、人型和禽型3種，其中人型和牛型之間可以互相感染，禽型也可以感染牛和人類。牛結(jié)核?。˙ovine Tuberculosis）在世界各地均有發(fā)生，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）在《陸生動物衛(wèi)生法典》中將其列為須通報動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。牛結(jié)核病作為一種重要的人獸共患病，不僅嚴重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，也是公共衛(wèi)生的重大威脅。據(jù)統(tǒng)計，10%以上的人結(jié)核病由牛結(jié)核分枝桿菌引起［2］。因此掌握寧夏區(qū)牛結(jié)核病的現(xiàn)狀，檢測、淘汰感染奶牛具有重要意義。

1　實驗材料

1.1試驗動物

試驗動物來自寧夏賀蘭縣A奶牛場1 300頭奶牛、B奶牛場930頭奶牛，合計2 230頭。 所選牛群均為處于泌乳期的荷斯坦奶牛，年齡2～6歲。

1.2試驗器材

電子數(shù)顯游標卡尺、1 mL注射器、5 mL肝素理管、電子剃毛器、超凈工作臺、低溫高速離心機、恒溫培養(yǎng)箱、微量加樣器、洗板機、酶標儀（美國伯樂BIO-IAD 680），其余均為常規(guī)實驗室器材。

1.3試劑

國產(chǎn)牛型PPD（結(jié)核菌素純蛋白衍生物、批號201308）購自哈藥集團生物有限公司，50頭份/瓶；牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA檢測試劑盒購自青島瑞爾生物有限公司。

2　實驗方法

2.1PPD單純頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗

單純頸部皮試變態(tài)反應(yīng)試驗參照國家標準《動物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T18645—2002）進行。采用牛型PPD在奶牛頸部進行皮試變態(tài)反應(yīng)試驗，劑量為2 000國際單位（IU）/頭，分別于注射前和注射后72 h測量皮膚厚度，計算皮厚差。結(jié)果判定：局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差≥4.0 mm為陽性；局部炎性反應(yīng)不明顯，4.0 mm≥皮厚差≥2.0 mm為疑似；無炎性反應(yīng)，皮厚差＜2.0 mm為陰性。對第一次檢疫結(jié)果為疑似的牛只，60天后進行復(fù)檢［3］，結(jié)果仍為疑似的，60天后再復(fù)檢，如仍為疑似，則判為陽性。

2.2γ-干擾素ELISA檢測試驗

牛尾靜脈采集單純皮內(nèi)PPD變態(tài)反應(yīng)試驗陽性牛全血5 mL，置于肝素理抗凝管中，輕輕顛倒混勻，室溫下送到實驗室檢測。在采血后8 h內(nèi)進行刺激培養(yǎng)。將全血無菌分裝24孔細胞培養(yǎng)板中（1.5 mL/孔，3孔/份樣品），在對應(yīng)的孔內(nèi)無菌加入工作濃度的牛型PPD抗原、禽型PPD抗原、PBS液各100 μL，將各抗原與分裝血液充分混勻后，把含有血液和抗原的細胞培養(yǎng)板放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育18～24 h。吸取300～400 μL上層血漿，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，即為刺激產(chǎn)生的γ-干擾素上清，-20 ℃貯存待檢（血漿2～8 ℃可保存一周，-20 ℃可保存一個月）。以牛結(jié)核γ-干擾素ELISA方法，檢測牛全血上清中γ-干擾素，具體操作參照試劑盒說明書進行。結(jié)果判定標準：牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值≥0.1，且牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值≥0.1判為陽性；牛型PPD刺激上清的OD值-PBS刺激上清的OD值＜0.1或牛型PPD刺激上清的OD值-禽型PPD刺激上清的OD值＜0.1，則判為陰性。

3　結(jié)果

3.1PPD單純頸部皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗結(jié)果

本次流行病學調(diào)查共檢出皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)陽性牛79（65+14）頭份，平均陽性檢出率為3.58 %（79/2 230）（表1）。說明寧夏賀蘭縣的2個規(guī)?；膛龃嬖谂＝Y(jié)核病。

表1　賀蘭縣奶牛皮內(nèi)PPD變態(tài)反應(yīng)檢測結(jié)果

3.2γ-干擾素ELISA檢測結(jié)果

對79份單純皮內(nèi)PPD變態(tài)反應(yīng)試驗陽性牛采集全血，用牛型PPD抗原、禽型PPD抗原、PBS液刺激后，收集上清，用牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA檢測試劑盒檢測，發(fā)現(xiàn)平均陽性率為3.23%（72/2 230），檢出陽性率低于皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)。說明皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法可能有部分非特異性反應(yīng)存在，具體結(jié)果見表2。

表2　賀蘭縣奶牛γ-干擾素ELISA檢測結(jié)果

4　討論

到目前為止，牛結(jié)核病的檢測方法大概可歸為細菌學檢測、分子生物學檢測、免疫學檢測3類。細菌學檢測目前仍被認為是結(jié)核病確診的金標準［4］，但由于牛分枝桿菌生長緩慢、分離率低，需要較高的生物安全措施，樣品采集需要屠宰活牛，不適用于活畜檢疫，因此嚴重影響了該方法的推廣。分子生物學檢測方法發(fā)展最快、特異性好，但靈敏度較差，且要求試驗條件較高，不利于普及。牛結(jié)核病的免疫學檢測方法（血清學檢測和細胞免疫檢測），一般認為其抗體檢測敏感性較低。因此目前臨床上使用最為廣泛的是細胞免疫學診斷方法。細胞免疫學診斷方法適用于活畜的診斷，且對試驗條件的要求不高，是一種適合推廣的檢測技術(shù)［5］。

單純皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)使用的免疫學診斷試劑PPD是多種抗原的混合物，其所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌和BCG所共有，因此存在交叉反應(yīng)和非特異性反應(yīng)。若單用該方法對檢出的PPD陽性牛執(zhí)行“檢疫—撲殺”策略，可能會誤殺假陽性牛。同時該方法敏感性較低，與感染動物接觸的個體也會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，在疫病早期階段和急性感染期，還會出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，可能會忽略部分感染牛。此外，由于遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)的影響，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)在30天內(nèi)不能進行復(fù)檢，容易造成病原擴散和疫情處置延誤。但其操作簡便、技術(shù)要求簡單、費用較低，對大量牛群的普查有一定的積極作用，可為進一步檢測確認帶來方便，減少檢測的盲目性。因此，在對牛群進行結(jié)核病檢測時，應(yīng)先進行變態(tài)反應(yīng)檢測，檢測結(jié)果陽性的牛先隔離，然后結(jié)合γ-干擾素ELISA方法檢測的結(jié)果來綜合判斷。只有兩者檢測均為陽性的牛，才予以淘汰。

5　結(jié)論

采用單純皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA試驗對寧夏賀蘭牛結(jié)核病進行血清流行病學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)牛結(jié)核病在2個規(guī)?；膛鲋芯写嬖?；通過對比皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和γ-干擾素ELISA方法檢測的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)γ-干擾素ELISA檢測方法的準確度高，可作為輔助手段用于結(jié)核病的檢測及凈化。兩者結(jié)合，既可以避免部分錯篩帶來的經(jīng)濟損失，又可以避免因漏檢感染牛而導致的疫情擴散。只有通過該方法對牛群進行檢測，確定并淘汰陽性牛，才能最終達到牛結(jié)核病的凈化目的［6］。

［1］韓猛，張亮，王基隆，等. 山東省規(guī)?；膛鼋Y(jié)核病與副結(jié)核病流行病學調(diào)查研究［J］. 中國農(nóng)學通報，2014，14：10-13.

［2］陳祥，徐正中，時振華，等. γ-干擾素試驗和皮試變態(tài)反應(yīng)對檢測奶牛結(jié)核病的比較［J］. 中國人獸共患病學報，2011（2）：97-100.

［3］周培校，李靜，張魯安，等. 牛結(jié)核γ—干擾素ELISA檢測方法在檢疫工作中的應(yīng)用［J］. 中國動物檢疫，2014（1）：67-71.

［4］張喜悅，呼西旦，楊經(jīng)緯，等. γ-干擾素試驗及比較皮試在結(jié)核污染牛群的應(yīng)用研究［J］. 中國人獸共患病學報，2010（1）：53-56.

［5］王楠，王作友，江希玲，等. 四種不同檢測方法在奶牛結(jié)核病診斷中應(yīng)用的比較研究［J］. 吉林畜牧獸醫(yī)，2012（11）：19-20.

［6］徐賢坤，熊毅，韋達有，等. γ-干擾素ELISA檢測方法在廣西牛結(jié)核病流行病學調(diào)查中的應(yīng)用［J］. 南方農(nóng)業(yè)學報，2013（4）：667-670.

（責任編輯：朱迪國）

Applications of IFN-γ ELISA for Epidemiological Survey of Bovine Tuberculosis

Wu Yawen，Wang Xiaoliang，Zhang Yuling，Wang Yumei，Li Zhihong，Zhang xuejun
（Ningxia Animal Disease Prevention and Control Center，Yinchuan，Ningxia 750011）

［Objective］ In order to investigate the prevalence status of bovine tuberculosis in Helan county and to provide a reference for purifi cation and comprehensive prevention and control of bovine tuberculosis in Ningxia. ［Methods］Using the tuberculin skin test（TST）and IFN-γ ELISA，2 230 cows from 2 large-scale dairy farms were detected.［Results］ 79 positive cows from 2 dairy farms were detected by TST，72 of them were still positive results tested by IFN-γ ELISA subsequently，the double positive rate by both methods was 3.23%（72/2 230）. ［Conclusion］ The results showed that the accuracy of bovine tuberculosis IFN-γ ELISA was relatively higher. TST conjunction with IFN-γ ELISA could be more conducive to bovine tuberculosis detection and purifi cation.

bovine tuberculosis；INF-γ ELISA；tubulin skin test；epidemiological survey

S851.3

B

1005-944X（2016）09-0078-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.024

寧夏回族自治區(qū)科技支撐項目（2013ZZN30）