利用質量控制圖監(jiān)控不同實驗條件對布魯氏菌試管凝集實驗結果的影響

張錫全，饒 紅，韓 玥

（北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026）

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利用質量控制圖監(jiān)控不同實驗條件對布魯氏菌試管凝集實驗結果的影響

張錫全，饒 紅，韓 玥

（北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026）

運用建立的質量控制圖，監(jiān)控不同實驗條件對布魯氏菌試管凝集實驗結果可能造成的影響。在每次日常檢測時對標準陽性血清進行試管凝集實驗并使用濁度儀測量其上清液的光密度（OD值），在收集足夠有效數(shù)據(jù)后，繪制當前條件下的質量控制圖。通過模擬日常實驗條件下孵育溫度、時間等容易產生偏離的條件，記錄不同實驗條件下標準陽性血清試管凝集實驗后上清液的OD值，繪制控制用控制圖。運用繪制的質量控制圖對不同實驗條件進行監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)孵育溫度和孵育時間均對實驗結果產生較大影響，從而導致失控。采用質量控制圖對布魯氏菌試管凝集實驗進行監(jiān)控，可提高質量監(jiān)控的有效性、科學性。嚴格控制實驗條件是保證實驗結果的重要前提。

質量控制圖；試管凝集；布魯氏菌??；溫度；孵育時間

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布病）是由布魯氏菌引起的人獸共患病，在全世界范圍內流行嚴重，對人類健康構成了極大危害［1］。

抗體水平的檢測常被用于布病的診斷和普查，方法包括試管凝集、平板凝集、補體結合、酶聯(lián)免疫吸附實驗等。其中，試管凝集實驗結果僅依靠肉眼比較樣品管與參照比濁管來判斷，對實驗人員要求很高，需要實驗人員經驗豐富，且實驗結果易受人的主觀影響。《檢測和校準實驗室能力認可準則》（CNAS-CL01：2006）5.9條款［2］、《＜檢測和校準實驗室能力認可準則＞應用要求》（CNAS-CL52：2014）5.9.2條款［3］都指出，實驗室應使用質量控制圖［4］等統(tǒng)計學技術方法對檢測結果進行監(jiān)控，以便及時發(fā)現(xiàn)檢測結果的異常和存在的變化趨勢。利用控制圖判定哪些條件會對實驗結果有影響，可以對日常檢測工作中應特別注意的因素提供參考和警示。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

抗原（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，201501）；標準品陽性血清（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，2006）；標準品陰性血清（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，201401）；1000L移液槍（eppendorf）；培養(yǎng)箱（3 M）；濁度儀（VITEK）；比濁用試管（VITEK）。

1.2操作方法

1.2.1供判定參照比濁管的配置。供判定參照比濁管按照《布魯氏菌病實驗室技術》GB/T 18646—2002［5］的要求配置。

1.2.2試劑符合性實驗。標準陽性血清注明在1：2 400稀釋時出現(xiàn)++。將標準陽性血清凍干粉溶于1 mL蒸餾水復原。將1 mL標準血清（4 000 IU/mL），加入到36.5 mL石碳酸生理鹽水中，稀釋成1：37.5的溶液，再梯度稀釋為1：75、1：150、1：300、1：600、1：1 200、1：2 400、1：4 800、1：9 600、1：19 200的溶液。按照抗原說明書，將抗原稀釋成1：20的工作液。將抗原工作液加入到上述梯度稀釋的溶液中，加入等量的抗原后，血清稀釋度分別為1：75、1：150、1：300、1：600、1：1 200、1：2 400、1：4 800、1：9 600、1：19 200、1：38 400。將上述加入了抗原的血清梯度稀釋液置于37 ℃溫箱，孵育24 h后與參照比濁管比濁。如果在1：2 400抗原稀釋液中出現(xiàn)++，則證明購買的試劑的質量符合要求。

1.2.3建立質量控制圖前期的數(shù)據(jù)收集。日常血清凝集實驗和結果判定，按照《布魯氏菌病實驗室技術》（GB/T 18646—2002）的要求進行。在試管凝集實驗孵育后，將1：2 400稀釋度標準陽性血清的上清液加入到VITEK比濁用試管中，使用VITEK配套比濁儀讀取并記錄其OD值。

1.2.4利用建立的控制圖監(jiān)控不同實驗條件對實驗結果的影響。分別單獨改變試管凝集實驗孵育時間、孵育溫度，其他實驗條件不變，進行布魯氏菌試管凝集實驗。將不同實驗條件下1：2 400稀釋度標準陽性血清進行4個平行的試管凝集實驗后的上清液加入到VITEK比濁用試管中，使用VITEK配套比濁儀讀取并記錄其OD值。設置的不同實驗條件分別為：試管凝集孵育時間設定為24 h、28 h、29 h；孵育溫度設定為37 ℃、25 ℃、15 ℃、42 ℃。

2　結果

2.1試劑符合性實驗結果

通過肉眼將標準陰陽性血清與參照比濁管進行比較，在國際標準陽性血清1：2 400稀釋時，顯示++。同時使用比濁儀讀取上清液的OD值。結果顯示，標準陽性血清1：2 400稀釋上清液OD值為0.67，參照比濁管50%凝集（++）上清液OD值為0.66；標準陰性血清各稀釋度上清液OD值為1.12～1.22，參照比濁管0%凝集（-）上清液OD值為1.21?？梢娝徺I的試劑質量符合要求。

2.2數(shù)據(jù)收集與離群值的剔除

當開始建立控制圖時，如果收集的數(shù)據(jù)處于失控狀態(tài)，那么依據(jù)這樣的數(shù)據(jù)計算出的標準差會過大，導致控制限也會相應過大，出現(xiàn)漏檢失控情況。依時間順序收集1：2 400稀釋度標準陽性血清試管凝集實驗后的上清液OD值至少20組以上。當樣本量在3≤n≤30時，在未知標準差情形且限定檢出離群值的個數(shù)大于1的情況下，重復使用Dixon檢驗法［6］剔除離群值，選取最后20組數(shù)據(jù)繪制控制圖。

在建立布病質量控制圖的初期，收集了30個標準陽性血清試管凝集實驗后上清液的OD值（表1），通過肉眼將標準陰陽性血清與參照比濁管進行比較，標準陽性血清在1：2 400稀釋時均顯示“++”。

樣本量n=30，符合14≤n≤30，故檢測高端離群值使用Dn=r22=（x（n）-x（n-2））/（x（n）-x3）計算統(tǒng)計量的值D30=0.62，而檢測低端離群值使用D'n=r'22=（x（3）-x（1））/（x（n-2）-x（1））計算統(tǒng)計量的值D'30=0.067。當檢測水平α=0.05時，臨界值。因為，，判定x（30）為離群值。當剔除水平α*=0.01時，臨界值。因為，，判定x（30）為統(tǒng)計離群值，應予以剔除。

剔除異常值后還剩余29個值，繼續(xù)重復使用狄克遜（Dixon）檢驗法，對剩余的29個值進行判定，結果=0.415，所以在檢測水平α=0.05時，不能繼續(xù)檢出離群值。

表1　標準陽性血清在1：2 400稀釋度（++）時的OD值

2.3質量控制圖的建立

將前期收集的運用狄克遜（Dixon）檢驗法剔除離群值后的29組數(shù)據(jù)，按時間順序繪制質量控制圖。這29組數(shù)據(jù)的“CL中心線=0.63”“UWL上 警 戒 限=0.704 066”“LWL下警戒限=0.555 934”“UCL上控制限=0.741 099”“LCL下控制限=0.518 901”。使用Excel制作質量控制圖（圖1）。

圖1　Excel繪制出的標準陽性血清OD值控制圖

經過《常規(guī)控制圖》（GB/T4091—2001）中提到的8種檢驗驗證，選取的這29個數(shù)據(jù)所建立的質量控制圖是有效的。

2.4不同實驗條件對實驗結果的影響

參照比濁管、不同實驗條件下標準陽性血清1：2 400稀釋度試管凝集實驗后上清液的OD值（表2、表3）。不同實驗條件下標準陰性血清各稀釋度試管凝集實驗后上清液OD值在1.09～1.29，故陰性對照實驗成立。

表2　參照比濁管各梯度OD值

表3　標準血清各稀釋度OD值

沿用2.3中建立的控制圖中的警戒限、控制限，將不同實驗條件下標準陽性血清1：2 400稀釋度試管凝集實驗后上清液的OD值帶入，繪成控制用控制圖（圖2）。

圖2　Excel繪制出的不同實驗條件下標準陽性血清OD值控制用控制圖

如圖2所示，15 ℃/24 h條件下標準陽性血清試管凝集實驗后上清液OD值超出上控制限（UCL），顯示失控；42 ℃/24 h條件下OD值超出下控制限（LCL），顯示失控；25 ℃/24 h條件下OD值超出上控制限（UCL），顯示失控，但超出UCL的程度小于15 ℃/24 h時的情況；37 ℃/24 h條件下OD值顯示受控；37 ℃/28 h條件下OD值有兩個平行超出下控制限（LCL），顯示失控，另外兩個平行在LCL附近；37 ℃/29 h條件下OD值超出下控制限（LCL），顯示失控，且超出LCL的程度大于37 ℃/28 h時的情況。可見，孵育溫度和孵育時間均對布魯氏菌試管凝集實驗的結果有影響。

3　討論

3.1當實驗條件高于或低于標準規(guī)定時，會導致假陽性或假陰性結果的出現(xiàn)

標準規(guī)定的實驗條件是37～40 ℃孵育24 h。當孵育溫度低于該溫度范圍時（如15 ℃、25 ℃），試管凝集反應減退甚至停滯，且其受影響的程度隨著孵育溫度的降低而增強，出現(xiàn)假陰性的結果，導致漏檢。當孵育溫度高于該溫度范圍時（如42 ℃），試管凝集反應加劇，甚至下一個稀釋度也出現(xiàn)了凝集反應，出現(xiàn)假陽性的結果，導致誤檢。當孵育時間高于規(guī)定的24 h時（如28 h、29 h），試管凝集反應加劇，下一個稀釋度也出現(xiàn)了凝集反應，同樣容易導致誤檢。

3.2試管凝集實驗中應特別關注對溫度、孵育時間的控制

從失控情況的原因分析來看，溫度、孵育時間等條件對布魯氏菌試管凝集實驗的結果影響很大，這兩個條件可以看作是該實驗的關鍵控制點，在日常工作中應特別注意。

3.3應采取有效措施，保證按標準規(guī)定條件進行試驗

培養(yǎng)箱性能的穩(wěn)定性直接影響孵育溫度。因此實驗室要嚴格按照設備需求，定期（如1年）對設備進行校準。此外每天應安排人員監(jiān)控并記錄培養(yǎng)箱溫度。針對孵育時間，需要對所有實驗人員依據(jù)檢測標準進行嚴格細致地培訓，強調影響實驗結果的關鍵條件控制，同時設計原始記錄時應考慮到要便于記錄開始和結束孵育的時間，從記錄層面進一步控制孵育時間的準確穩(wěn)定。

3.4質量控制圖監(jiān)控試管凝集實驗具有重要意義

質量控制圖用于動物檢疫領域，尤其對布魯氏菌試管凝集實驗這類半定量實驗，目前還未見相關報道。但質量控制圖在應用中取得了理想的效果，能夠監(jiān)控日常實驗中的失控結果和變化趨勢，且對與溫度、孵育時間等關鍵控制點，反應敏感。

3.5實驗條件的穩(wěn)定是制作和應用質量控制圖的前提

應用質量控制圖時，應采用并嚴格按照標準檢測方法；應使用經過校準且性能穩(wěn)定的儀器設備；應由固定且有經驗的實驗員完成；應在使用前對試劑進行驗證。

3.6在應用質量控制圖時，應了解所選實驗的關鍵控制點

了解所選實驗關鍵控制點的目的是便于在觀察到控制圖的異常波動和變化趨勢時，可以追溯實驗過程，找到問題所在，并及時消除存在的異常因素。

［1］鄭世軍.現(xiàn)代動物傳染病學［M］.北京：中國農業(yè)出版社，2013：21-26.

［2］ 中國合格評定國家認可委員會. 檢測和校準實驗室能力認可準則：CNAS-CL01：2006［S］. 北京：中國合格評定國家認可委員會，2006.

［3］ 中國合格評定國家認可委員會. ＜檢測和校準實驗室能力認可準則＞應用要求：CNAS-CL52：2014 ［S］. 北京：中國合格評定國家認可委員會，2014.

［4］國家質量技術監(jiān)督局. 常規(guī)控制圖：GB/T 4091—2001［S］. 北京：中國標準出版社，2001.

［5］國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. 布魯氏菌病實驗室技術：GB/T 18646—2002［S］. 北京：中國標準出版社，2002.

［6］ 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，國家標準化管理委員會.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和解釋—正態(tài)樣本離群值得判斷和處理：GB/T 4833—2008［S］. 北京：中國標準出版社，2008.

（責任編輯：朱迪國）

Using the Quality Control Chart to Monitor the Impact Causing by Different Experimental Conditions for Detecting Brucellosis by Tube Agglutination

Zhang Xiquan，Rao Hong，Han Yue
（Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026）

Experimental results are infl uenced by test conditions in some extent. In this study，quality control chart was applied to monitor the impact causing by different test conditions for detecting brucellosis by tube agglutination. In order to draw quality control chart，standard positive serum in everyday routine assay was used to conduct tube agglutination test，so as to obtain suffi cient data by measuring the OD values of supernate by turbidity meter. Through simulating such easily deviating conditions as temperature and incubation time，the above mentioned method was used to draw quality control chart under the current condition. It was found that both temperature and incubation time affected experimental results greatly，which could lead to lose control of test results. In conclusion，using quality control chart to monitor detection of brucellosis by tube agglutination was able to improve the monitoring quality effectively and scientifi cally. Strict control of the experimental conditions is an important premise to guarantee the results of the experiments.

quality control chart；tube agglutination；brucellosis；temperature；incubation time

S851.3

B

1005-944X（2016）09-0081-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.09.025

國家質檢總局科技計劃項目：質量控制圖在動檢血清學檢測應用的示范性研究（2015IK009）

饒 紅