適于番茄葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳優(yōu)化體系的建立

王 強(qiáng)，王 娟，李 寧，唐亞萍，楊 濤，王柏柯，楊生保，帕提古麗，余慶輝

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/新疆園藝作物生物技術(shù)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊　830091；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊　830091)

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適于番茄葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳優(yōu)化體系的建立

王 強(qiáng)1，王 娟2，李 寧1，唐亞萍1，楊 濤1，王柏柯1，楊生保1，帕提古麗1，余慶輝1

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/新疆園藝作物生物技術(shù)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091；2. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊830091)

【目的】建立適于番茄葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳(2-DE)技術(shù)，為開(kāi)展番茄蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)?！痉椒ā繉?duì)番茄葉片蛋白質(zhì)提取方法、蛋白質(zhì)裂解液、上樣量、膠條pH范圍等關(guān)鍵步驟進(jìn)行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】采用三氯乙酸/丙酮法提取番茄葉片總蛋白質(zhì)，含有7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解緩沖液，上樣量為100 mg，以pH 4～7、18 cm的IPG 膠條在12%SDS-PAGE凝膠濃度下進(jìn)行雙向電泳，得到了蛋白點(diǎn)均勻分布、低峰度蛋白點(diǎn)較為清晰，蛋白點(diǎn)數(shù)目多且分辨率高的2-DE圖譜?！窘Y(jié)論】建立了一套適于番茄葉片蛋白質(zhì)分析的雙向電泳技術(shù)體系，為下一步在蛋白組學(xué)水平上分析番茄逆境脅迫等相關(guān)蛋白提供了技術(shù)支持。

番茄葉片；蛋白質(zhì)組；雙向電泳(2-DE)

0　引 言

【研究意義】蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代研究生物學(xué)功能的重要組學(xué)，雙向電泳技術(shù)(2- DE) 已經(jīng)成為了蛋白組學(xué)研究的核心技術(shù)之一，而雙向電泳技術(shù)涉及的環(huán)節(jié)較多，樣品制備中植物組織中存在影響雙向電泳的物質(zhì)(如核酸、多糖和脂類(lèi)等生物大分子以及鹽類(lèi)) 會(huì)阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過(guò)高會(huì)使等電聚焦的電壓降低，甚至損壞IPG 膠條[1]。其次植物組織中含有的色素、酚、多糖等代謝產(chǎn)物也會(huì)對(duì)后續(xù)蛋白質(zhì)的分離和鑒定造成影響[2]。除了樣品制備外，上樣量的大小、蛋白質(zhì)裂解的配方、IPG膠條的選擇等都會(huì)對(duì)雙向電泳的產(chǎn)生影響。任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都無(wú)法得到分辨率高的凝膠圖譜。因此，建立一套分辨率高的雙向電泳體系是成功開(kāi)展番茄蛋白質(zhì)組學(xué)分析的基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，雙向電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物等方面的研究，由于不同研究作物的蛋白質(zhì)組成千差萬(wàn)別，套用常規(guī)試驗(yàn)程序有可能得不到滿意結(jié)果[3]。番茄不同器官蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究有一些報(bào)道，如葉片[4-5]、根[6]和果實(shí)[7]等，由于雙向電泳涉及的環(huán)節(jié)較多，植物組織中代謝產(chǎn)物、材料的多樣性及不同器官所含蛋白種類(lèi)及數(shù)量等也不相同，往往對(duì)電泳結(jié)果影響較大?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】國(guó)內(nèi)外研究番茄蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報(bào)道還很有限。利用雙向電泳技術(shù)，比較番茄葉片總蛋白質(zhì)的提取方法、蛋白質(zhì)裂解液、上樣量、IPG膠條等進(jìn)一步的優(yōu)化。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】探索出一套適于番茄葉片的雙向電泳技術(shù)，以期得到蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)目多，背景清晰，條紋較少，拖尾現(xiàn)象不明顯的電泳圖譜，為開(kāi)展番茄蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

1 　材料與方法

1.1材 料

供試番茄材料為M82，于2014 年 4 月種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠綜合試驗(yàn)基地，幼苗4片真葉時(shí)取樣，置于-80℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)所用的載體兩性電解質(zhì)、線性18 cm pH 3～10、pH 4～7 IPG膠條、礦物油均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方 法

1.2.1蛋白質(zhì)提取

采用以下三種方法提取番茄葉片總蛋白并對(duì)提取效果進(jìn)行比較。

三氯乙酸/丙酮沉淀法參照Gallardo等[8]并略作修改。取番茄葉片1 g在液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入-20℃預(yù)冷的丙酮4 mL(含10%三氯乙酸和0.07%β-巰基乙醇) 充分渦旋，-20℃靜置過(guò)夜，在4℃低溫離心機(jī)12 000 r/min，離心 30 min，棄上清，留沉淀；然后加80%丙酮4 mL (含0.07% β-巰基乙醇)去除色素及雜質(zhì)，12 000 r/min，4℃低溫離心30 min，棄上清，留沉淀。再加入100%丙酮(含0.07%β-巰基乙醇)，-20℃冷藏30 min。然后4°C，12 000 r/min離心30 min，棄上清，洗滌步驟重復(fù)2～3次，直到有機(jī)相成無(wú)色，將所得蛋白沉淀置于-20℃冷凍成干粉，在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

飽和酚/甲醇醋酸銨法參照Mireille等[9]并略作修改。取番茄葉片 1 g 及少量的 PVP放入提前預(yù)冷的研缽中，在液氮中研磨成粉末，然后轉(zhuǎn)至離心管，加入3～4倍體積蛋白質(zhì)提取緩沖液( pH 8.0，0.50 mmol/L Tris-HCl，700 mmol/L 蔗糖，5 mmol/L EDTA-Na2，0.1% 蛋白酶抑制劑)充分混勻。在12 000 r/min，4℃低溫離心機(jī)上離心 3 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，向管中加 1.2 倍體積的水飽和酚充分混勻，12 000 r/min 離心20 min，取上清液加3倍體積 0.1 mol/L 乙酸銨/甲醇，-20℃過(guò)夜，然后12 000 r/min離心20 min，收集沉淀； 再用乙酸銨/甲醇洗滌 1 次，依次再用預(yù)冷的甲醇洗滌 2 次，80%丙酮洗滌 1 次，最后將沉淀在-20℃冷凍干燥，得到粉末狀蛋白放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二硫蘇糖醇/丙酮法參照王紅等[10]并略作修改。取 1 g 番茄葉片，液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至離心管中，加入 5 mL 2%二硫蘇糖醇的水溶液，在 4℃ 下12 000 r/min離心 30 min，取上清液，棄沉淀；上清液加4倍體積的冷丙酮，放于-20℃冰箱過(guò)夜。之后 4℃下 12 000 r/min 離心 30 min，沉淀用80%丙酮溶液清洗 2～3 次；最后沉淀在-20℃冷凍干燥，放入-80℃冰箱備用。

1.2.2蛋白質(zhì)定量

測(cè)定蛋白質(zhì)濃度參考 Bradford[11]的方法，稱取蛋白質(zhì)沉淀，以10 mg 蛋白加入200 μL 蛋白質(zhì)裂解液復(fù)溶，在冰浴超聲波中處理15 min，取出后在4℃搖床搖勻30 min，然后在4℃， 12 000 r/min 離心 30 min，取上清液，即為蛋白樣品。采用的蛋白裂解液如下：

蛋白裂解液Ⅰ：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2% CHAPS，2% SB3-10；

蛋白裂解液Ⅱ：7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)；

蛋白裂解液Ⅲ：0.05 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl；

1.2.3單向SDS-PAGE凝膠電泳

將濃度為12%的分離膠注入玻璃板夾層中，用去離子水封膠面，待分離膠聚合后，配制濃度為4%濃縮膠，倒去分離膠表面的去離子水，灌入濃縮膠，插入點(diǎn)樣梳，待濃縮膠聚合后，在電泳槽中加入電泳緩沖液，拔去上樣梳點(diǎn)樣，蛋白上樣量為20 μL。加樣完畢開(kāi)始電泳，起始電壓為80 V，待溴酚藍(lán)線到達(dá)分離膠時(shí)把電壓提高到120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到分離膠底部時(shí)停止電泳。

1.2.4第一向等電聚焦

采用Protean IEF cell等電聚焦系統(tǒng)。將提取的番茄蛋白樣品加裂解液至總體積為500 μL，均勻加入上樣IPG 膠條槽，將IPG膠條保護(hù)膜揭掉，IPG 膠條與膠條槽正負(fù)極一致，放在加有蛋白上樣液的IPG 膠條槽內(nèi)，然后在膠面上加2～3 mL礦物油，置于等電聚焦儀上，聚焦條件為20℃。運(yùn)行參數(shù)：50 V水化12 h，250 V，30 min；500 V，1 h；1 000 V，30 min；4 000 V穩(wěn)壓聚焦，總電壓時(shí)間積達(dá)到20 000 Vh時(shí)結(jié)束電泳。

1.2.5第二SDS-PAGE凝膠電泳

等一向等電聚焦結(jié)束后，將IPG 膠條從膠條槽中取出，放入濾紙上吸取膠條表面的礦物油，然后將膠面朝上的IPG 膠條放于5 mL 膠條平衡緩沖液 I[6 mol /L尿素，20%甘油，0.375 mol /L Tris-HCl (pH 8.8)，2% SDS，2%DTT]中在脫色搖床上緩慢搖蕩平衡15 min，再將IPG 膠條放入濾紙上吸取膠條表面的溶液，再轉(zhuǎn)入5 mL 膠條平衡緩沖液 II [6 mol/ L尿素，2.5%碘乙酰胺，20%甘油，0.375 mol /L Tris-HCl (pH 8.8)，2%SDS]中在脫色搖床上緩慢搖蕩平衡15 min。使用Mini Protein 3垂直電泳儀，將平衡完畢的IPG膠條轉(zhuǎn)移到提前預(yù)制的12%SDS-PAGE 凝膠上，使IPG膠條與凝膠表面充分接觸，用低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠，在120 V 電壓下進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)移至電泳槽凝膠底部時(shí)停止電泳。

1.2.6蛋白質(zhì)染色與圖像分析

第二SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)束后，采用改良的考馬斯亮藍(lán)染色法[12]，固定、致敏、染色、脫色至凝膠背景清晰為止，脫色后的凝膠在GE Healthcare凝膠掃描儀上掃描獲取圖像；用PDQuest8.0軟件進(jìn)行蛋白點(diǎn)檢測(cè)及圖像分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同方法提取番茄葉片總蛋白質(zhì)比較

二硫蘇糖醇/丙酮法、飽和酚/甲醇醋酸銨法、改良的三氯乙酸/丙酮法分別提取番茄葉片蛋白質(zhì)樣品并通過(guò)單向SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，利用二硫蘇糖醇/丙酮法提取蛋白質(zhì)含量較豐富，條帶較多，蛋白經(jīng)多次洗脫后呈黃色色素，最終難以消除。(泳道1～3)；飽和酚/甲醇醋酸銨法所提取的蛋白質(zhì)含量少，且條帶較少不清晰(泳道4～6)；而利用三氯乙酸/丙酮法所提取蛋白質(zhì)含量豐富，條帶數(shù)量最多(泳道7～9)；因此，研究認(rèn)為三氯乙酸/丙酮法是較為理想的番茄葉片蛋白質(zhì)的提取方法。圖1

2.2蛋白質(zhì)裂解液選擇

蛋白質(zhì)裂解液直接影響蛋白質(zhì)樣品中各種蛋白質(zhì)能否充分溶解，并是其能否在2-DE凝膠上分離出來(lái)的關(guān)鍵因素[13]。蛋白樣品制備，應(yīng)盡可能的避免蛋白質(zhì)的降解與損失，保證蛋白樣品最大程度的溶解，因此選擇合適的裂解液也十分重要[14]。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，三種裂解液對(duì)蛋白質(zhì)樣品的溶解效果差異明顯。不同蛋白質(zhì)提取方法在三種裂解液配方溶解后，通過(guò)單向SDS-PAGE凝膠電泳看出裂解液I、II對(duì)蛋白質(zhì)樣品的溶解效果較好，但裂解液II在不同方法提取樣品中蛋白裂解效果好于裂解液I，蛋白質(zhì)條帶范圍較為廣泛。裂解液III在三氯乙酸/丙酮提取法、飽和酚/甲醇醋酸銨提取法中蛋白條帶模糊不清，在二硫蘇糖醇/丙酮法提取蛋白中顯示蛋白條帶較弱，范圍內(nèi)的條帶較少。圖2

注：1～3：二硫蘇糖醇/丙酮法；4～6：飽和酚/甲醇醋酸銨法；7～9：改良的三氯乙酸/丙酮法

Note：1-3：DTT- acetone method；4-6：Phenol-methanol-ammonium acetate method；7-9：modified TCA- acetone method

圖1三種方法提取番茄葉片總蛋白SDS-PAGE分析
Fig.1SDS-PAGE pattern of tomato levers proteins extracted by three sample preparation methods

飽和酚/甲醇醋酸銨法　二硫蘇糖醇/丙酮法　三氯乙酸/丙酮法

注：1、4、7為裂解液I；2、5、8為裂解液II；3、6、9為裂解液III

Note：1，4，7 for lysis buffer I；2，5，8 for lysis buffer II；3，6，9 for lysis buffer III

圖2 不同裂解液配方和方法提取蛋白溶解效果
Fig.2 Different lysis buffer formula of dissolution effect in different methods to extract protein

2.3上樣量對(duì)2-DE圖譜的影響

等電聚焦的上樣量多少直接影響到聚焦的效果及雙向電泳的分辨率，上樣量過(guò)少，低豐度蛋白不容易檢出，上樣量太多，高豐度蛋白的斑點(diǎn)掩蓋低豐度蛋白點(diǎn)，而且鹽離子越多，等電聚焦時(shí)電壓的上升受到干擾，直接影響聚焦效果[15]。采用18 cm IPG(pH 3～10)膠條、12%SDS-PAGE濃度、改良考馬斯亮藍(lán)染色后的2-DE圖譜可以看出，不同濃度蛋白質(zhì)上樣量對(duì)2-DE圖譜分辨率有明顯的影響，當(dāng)番茄葉片蛋白質(zhì)的上樣量為75 mg時(shí)(圖3A)， 蛋白質(zhì)點(diǎn)雖然無(wú)拖尾現(xiàn)象，但2-DE圖譜上只檢出了約343個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，而且低豐度蛋白檢出數(shù)量很少。上樣量為100 mg時(shí)(圖3B)，蛋白點(diǎn)呈圓點(diǎn)型，形態(tài)好，幾乎無(wú)拖尾現(xiàn)象，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量約為757個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。上樣量為125 mg時(shí)(圖3C)，高豐度蛋白質(zhì)之間重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，與其臨近的低豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)有很多被覆蓋，條紋較多，同時(shí)也出現(xiàn)較多蛋白質(zhì)點(diǎn)拖尾的現(xiàn)象。據(jù)此認(rèn)為，適合于番茄葉片蛋白質(zhì)雙向電泳的最佳上樣量為100 mg。圖3

注：18 cm，pH 3～10，12%SDS-PAGE，改良的考馬斯亮藍(lán)染色；A.上樣量為75 mg；B.上樣量為100 mg；C.上樣量為125 mg

Note：18 cm，pH 3-10，12%SDS-PAGE，modified coomassie R-250 staining；A.75 mg；B.100 mg；C.125 mg

圖3不同上樣量番茄葉片蛋白質(zhì)2-DE圖譜
Fig.3The effect of different protein-loading amounts on 2-DE map of tomato leaf protein

2.4膠條范圍對(duì)2-DE圖譜的影響

分別采用18 cm，pH 3～10和pH 4～7的IPG膠條，從圖4A可以看出，當(dāng)使用pH 3～10的膠條進(jìn)行2-DE電泳時(shí)，2-DE凝膠圖譜中的蛋白質(zhì)點(diǎn)大部分集中在酸性端范圍內(nèi)，堿性端蛋白質(zhì)點(diǎn)分布極少，且圖中橢圓區(qū)域部分蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度低，模糊不清，導(dǎo)致分辨率低。根據(jù)觀察結(jié)果，進(jìn)一步將2～DE圖譜分為：3≤pH<4、4≤pH<7、7≤pH<10三個(gè)區(qū)域，利用PDQuest8.0軟件對(duì)各區(qū)域中蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)檢測(cè)，有72%蛋白點(diǎn)穩(wěn)定分布在4

注：A. 18 cm，IPG膠條pH 3～10；B. 18 cm，IPG膠條pH 4～7

Note：A.18 cm，IPG strips of pH 3-10；B. 18 cm，IPG strips of pH 4-7

圖4不同IPG膠條pH范圍下2-DE圖譜

Fig.4The effect of different IPG strips of pH on 2-DE map of tomato leaf protein

3　討 論

番茄葉片組織中含有大量鹽離子、多酚、色素及多糖等次生代謝物[16]。在蛋白質(zhì)提取過(guò)程中選擇適宜的蛋白質(zhì)提取方法，除去上述次生代謝等干擾物質(zhì)，并減少蛋白質(zhì)的損失和降解[17]，是影響2-DE成敗的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較前人研究結(jié)果，以二硫蘇糖醇/丙酮法、飽和酚/甲醇醋酸銨法、三氯乙酸/丙酮法分別提取番茄葉片蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示飽和酚/甲醇醋酸銨法所提取的蛋白質(zhì)含量少，且條帶不清晰，可能由于該方法只收集酚相與水相界面層液，丟棄大量沉淀物，導(dǎo)致蛋白樣品在制備過(guò)程中損失過(guò)多。二硫蘇糖醇/丙酮法提取番茄葉片蛋白含量相對(duì)較豐富，條帶較多，蛋白呈黃色色素，經(jīng)多次洗脫后還是難以消除。表明二硫蘇糖醇/丙酮反復(fù)洗滌蛋白質(zhì)，雖然可除去鹽離子，但對(duì)色素、多糖等雜質(zhì)的去除效果并不理想。實(shí)驗(yàn)中，三氯乙酸/丙酮法在蛋白提取液中加入β-巰基乙醇，通過(guò)丙酮沉淀達(dá)到有效除去色素、鹽類(lèi)等干擾物質(zhì)，并且減少蛋白酶在提取過(guò)程中酶的失活和降解，對(duì)去除次生代謝物中雜質(zhì)也有很好效果。

蛋白質(zhì)的溶解影響2-DE蛋白質(zhì)分離，選用合適的裂解液來(lái)充分溶解蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一個(gè)重要的技術(shù)因素[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示裂解液I、II對(duì)番茄葉片蛋白質(zhì)樣品的溶解效果較好，表明尿素與硫脲混合有利于增加番茄葉片蛋白質(zhì)樣品的溶解。裂解液II中7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲混合4%CHAPS對(duì)番茄葉片蛋白質(zhì)的溶解效果最佳，這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論相近[19]。因此，裂解液中是否含有尿素、硫脲對(duì)番茄葉片蛋白質(zhì)的溶解能力有很大影響。實(shí)驗(yàn)不同配方裂解蛋白質(zhì)樣品的單向SDS-PAGE凝膠表明，采用7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)作為番茄葉片蛋白復(fù)溶的裂解液效果最好。

蛋白上樣量的大小和IPG膠條pH對(duì)2-DE凝膠的分辨率有直接影響。上樣量太大易引起蛋白上樣溶液中鹽離子及其它雜質(zhì)含量的提高，導(dǎo)致第一向等電聚焦時(shí)蛋白質(zhì)不能有效均勻分布IPG膠條上，并且易發(fā)生蛋白質(zhì)的凝聚和沉淀，在SDS-PAGE凝膠上，易產(chǎn)生“點(diǎn)飽和”現(xiàn)象，使低豐度蛋白易被掩蓋[20]，或產(chǎn)生水平和垂直紋理現(xiàn)象[21]。上樣量過(guò)低，較低豐度的蛋白點(diǎn)有可能無(wú)法檢測(cè)，進(jìn)而影響對(duì)2-DE凝膠圖譜蛋白點(diǎn)的準(zhǔn)確識(shí)別。另外，要對(duì)2-DE凝膠進(jìn)行差異蛋白圖譜比較，尤其是低豐度蛋白點(diǎn)，在2-DE凝膠圖譜上達(dá)到可識(shí)別與分辨，需要選擇適宜的IPG膠條。研究首先釆用pH 3～10的IPG膠條對(duì)番茄葉片蛋白質(zhì)樣品2-DE凝膠分離，結(jié)果顯示大部分蛋白點(diǎn)集中在酸性端范圍內(nèi)少數(shù)蛋白點(diǎn)之間相互緊密相連，甚至重疊，個(gè)別高分度蛋白點(diǎn)周?chē)牡拓S度蛋白點(diǎn)被覆蓋，導(dǎo)致低豐度蛋白點(diǎn)模糊不清不易區(qū)分。用pH 4～7的IPG膠條進(jìn)行2-DE分離，極大地提高了此區(qū)域蛋白點(diǎn)的分辨率，通過(guò)2-DE凝膠圖譜比較分析，獲得的2-DE圖譜背景清晰，檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)增多且分辨率高。

4　結(jié) 論

以三氯乙酸/丙酮法提取番茄葉片蛋白質(zhì)，選擇蛋白質(zhì)裂解液為[7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)]溶解，上樣量為100 mg，18 cm、pH 4～7的IPG膠條更適合番茄葉片總蛋白質(zhì)2-DE的分離，經(jīng)PDQuest8.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，可在2-DE圖譜上分辨出947個(gè)蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)清晰呈圓形，分布均勻、檢測(cè)到的蛋白點(diǎn)數(shù)增多且低峰度蛋白較為清晰，分辨率高，優(yōu)化后的體系更適合于番茄葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳的分析。

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Fund project:Supported Natural science foundation project of Xinjiang Uygur Autonomous Region(2014211B035)

Establishment of Two-dimensional Electrophoresis Optimization System for Proteomic Analysis of Tomato Leaves

WANG Qiang1，WANG Juan2，LI Ning1，TANG Ya-ping1，YANG Tao1，WANG Bai-ke1，YANG Sheng-bao1，Patiguli1，YU Qing-hui1

(1.ResearchInstituteofHorticulture/KeyLaboratoryofHorticulturalBiotechnology&MolecularBreedingofXinjiang，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091，China；2.ResearchInstituteofEconomicCrops，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences，Urumqi830091，China；)

【Objective】 To establish a two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) protocol for proteomic analysis of tomato leaves，this system aims to make a foundation for tomato proteomic research.【Method】 The method of protein extraction，reagent of lysis buffer，the sampling amount，pH gradient of IPG strip and other factors were optimized.【Result】 The results showed that optimal tomato leaf protein extraction was obtained by the improved TCA/acetone method，with lysis buffer containing 7 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，4% CHAPS，30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，a protein loading amount of 100 mg. Under pH 4-7，18 cm IPG strip and 12% concentrations of the SDS-AGE gel. The protein spots we got were evenly distributed and the low protein kurtosis were clearer，with more numbers of protein and higher resolution two-dimensional electrophoresis. 【Conclusion】 This established experiment is sui
Table for the tomato leaf protein analysis system of two-dimensional electrophoresis，which might provide technical support for the next step proteomics level analysis of tomato stress conditions and other related proteins.

tomato leaves；proteomic；two-dimensional electrophoresis(2-DE)

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.004

2015-11-17

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014211B035)

王強(qiáng)(1983-)，男，甘肅人，副研究員，研究方向?yàn)槭卟嗽耘嗌砼c逆境脅迫，(E-mail)wangqiang201004@sina．com

余慶輝(1970-)，男，廣東人，研究員，研究方向?yàn)榧庸し研缕贩N選育和栽培，(E-mail)tomato-yu@xaas.ac.cn

S188；S641.2

A

1001-4330(2016)04-0610-07