飼料中黃曲霉毒素檢測方法研究進展

劉利曉 ，張 亮 ，向艷娥 ，黃志偉 ，李洪波 ，崔 佳

（1.河南省駐馬店市獸藥飼料（動物產品）質量檢驗監(jiān)測中心，河南 駐馬店 463000；2.杭州雙康飼料有限公司，浙江 杭州 310000）

飼料中黃曲霉毒素檢測方法研究進展

劉利曉1，張 亮1，向艷娥1，黃志偉1，李洪波1，崔 佳2

（1.河南省駐馬店市獸藥飼料（動物產品）質量檢驗監(jiān)測中心，河南 駐馬店 463000；2.杭州雙康飼料有限公司，浙江 杭州 310000）

飼料在自然條件下污染的黃曲霉毒素主要包括B1、B2、G1、G24種，因為黃曲霉毒素B1具有致癌性，飼料和糧食中一般以黃曲霉毒素B1作為黃曲霉毒素含量評價的主要指標，我國飼料衛(wèi)生標準GB 13078-2001只對黃曲霉毒素B1限量進行了規(guī)定。目前，對飼料黃曲霉毒素的檢測方法有膠體金法、薄層分析法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法，液相色譜—串聯(lián)質譜法等。主要對近年來飼料中黃曲霉毒素檢測方法研究進展進行了綜述，討論了各方法的優(yōu)、缺點，以期為限量要求下的方法選擇提供依據(jù)。

黃曲霉毒素；檢測方法；研究進展

黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的次生代謝產物，是世界衛(wèi)生組織公認的致癌物，是一種天然存在的、毒性極強的劇毒物質，并具有致突變、致畸形和致癌作用。飼料在自然條件下污染的黃曲霉毒素主要包括 B1、B2、G1、G24 種， 因為黃曲霉毒素B1的具有致癌性，飼料和糧食中一般以黃曲霉毒素B1作為黃曲霉毒素含量評價的主要指標。我國飼料衛(wèi)生標準GB 13078-2001只針對污染范圍最廣、危害最大的黃曲霉毒素B1限量進行了規(guī)定［1］。黃曲霉毒素的檢測方法要滿足相應的限量要求，該文對現(xiàn)有檢測方法進行了綜述，討論了各方法的優(yōu)、缺點，為限量要求下的方法選擇提供依據(jù)。

1 飼料中黃曲霉毒素限量要求

我國飼料衛(wèi)生標準規(guī)定的飼料、飼料添加劑中黃曲霉毒素B1的限量見表1。

2 現(xiàn)有黃曲霉毒素檢測方法比較

目前，我國飼料中黃曲霉毒素的國家標準檢測方法主要包括膠體金法、薄層分析法（TLC）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜—串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS）。

表1 飼料、飼料添加劑中黃曲霉毒素B1的限量標準 μg/kg

2.1 膠體金法 該方法的原理是試樣中黃曲霉毒素B1在層析過程中與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制了抗體和硝酸纖維素膜檢測線上黃曲霉毒素B1-BSA偶聯(lián)物的免疫反應，使檢測線變淺，通過檢測線顏色變化進行測定［2］。我國國家標準中該方法黃曲霉毒素B1的檢出限可以達到1 μg/kg，明顯低于國家限量標準。王督等［3］采用膠體金免疫層析法快速定量分析糧油農產品中（花生、玉米、大米、小麥）黃曲霉毒素B1，4種樣品檢測的線性范圍為1.0～20.0 μg/kg，方法定量限為 1.0 μg/kg，樣品加標回收率為75%～106%，RSD＜20%。與免疫親和柱凈化-HPLC法相比，相對誤差＜15%，樣品檢測時間只需15 min。徐振斌等［4］建立了膠體金免疫層析法快速定量檢測玉米中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2總量的分析方法，最低檢測限和最低定量限分別為1.0 μg/kg和 3.0 μg/kg，方法簡便快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于玉米中上述4種黃曲霉毒素總量的快速定量檢測。

膠體金免疫層析技術的優(yōu)點為簡單、快速、成本低廉，適用于現(xiàn)場檢測和大規(guī)模樣品篩查。但其靈敏度低和不能定量的缺點，也使膠體金免疫層析技術在一些領域內的應用受到限制。目前研究膠體金免疫層析方法與其他儀器結合，建立黃曲霉毒素B1快速檢測綜合體系將會是未來的發(fā)展趨勢。

2.2 薄層分析法 TLC法是傳統(tǒng)的檢測黃曲霉毒素B1最常用方法，也是我國測定飼料中黃曲霉毒素B1的國家標準方法之一［5］。該方法是經典的化學分析方法，優(yōu)點是設備簡單，操作方便，分析成本低，較適合對黃曲霉毒素B1的定性檢測；其缺點是對檢測的規(guī)范和熟練程度要求高，準確度較低，且重復性較差。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法 利用ELISA檢測黃曲霉毒素的原理是毒素抗原抗體直接的競爭性反應，也是我國測定飼料中黃曲霉毒素B1的國家標準方法之一［6］。 國家標準中該方法的檢出限為 0.2 μg/kg。 相比于薄層分析法，ELISA法靈敏度高，操作簡便，分析速度快，并且可以同時處理大批量樣品，但由于同類分子的相似性，ELISA法容易對結構相似的其他黃曲霉毒素或化學物質產生一定的交叉反應，有可能帶來假陽性、假陰性結果，檢驗精確度有待提高。李海礁等［7］通過對同一黃曲霉毒素陽性玉米粉樣品分別采用HPLC和ELISA法進行不同實驗室間對比，得出在保證檢測結果一致的情況下，ELISA法同時具有檢測成本低、設備場所要求低、操作簡便、快速并且可以同時進行大量樣本測定等優(yōu)點。李敏等［8］為提高黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫分析靈敏度，建立了基于異源策略的間接競爭酶聯(lián)免疫分析（IC-ELISA）方法，將該方法應用于實際花生中黃曲霉毒素的檢測，同時，將結果與HPLC法結果進行比對，兩者有很高的符合度，并且，在保證特異性檢測黃曲霉毒素B1的條件下，比同源ELISA方法檢測靈敏度提高了81.25%，為進一步建立農產品中黃曲霉毒素B1快速特異性檢測方法奠定了重要基礎。目前，通過優(yōu)化一系列試劑盒參數(shù)，研制高靈敏度黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒的研究也在開展［9］。在實驗檢測活動中，ELISA法已經被很多企業(yè)和檢測機構所采用，作為陽性樣品的初篩工具。

2.4 高效液相色譜法 HPLC法也是目前飼料中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的檢驗國標方法［10］。 該方法原理為試樣經過甲醇—水提取后，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析柱層析凈化，經高效液相色譜儀分離、熒光檢測器柱后光衍生測定黃曲霉毒素含量。該國標方法采用柱后衍生方法，相比常用的三氟乙酸衍生法、碘衍生法、光化學衍生器不需要其他化學試劑，只是連接到色譜柱和檢測器之間，操作簡單，重復性好，靈敏度高。黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的檢出限分別為 0.2、0.2、0.3、0.3 μg/kg。馮秋月等［11］建立了HPLC-免疫親和柱凈化，柱后光化學衍生檢測玉米中 4 種黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的分析方法，分析時間在6～11 min內完成，檢測定量限分別為 0.10、0.03、0.10、0.03 μg/kg 。 完全符合并高于歐盟檢測標準定量，通過光化學檢測器在線衍生將黃曲霉毒素B1、G1的分析定量限提高到2.7倍和3.6倍。 玉米基質中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2在添加水平為 10、3、10、3 μg/L 時其回收率分別為 90.3%、85.65%、93.5%、92.8%，其線性范圍分別為 0～20μg/L、0～6 μg/L、0～20 μg/L、0～6 μg/L，RSD 分別為 2.3%、1.5%、2.7%、3.2%。筆者所在檢驗室按照國標方法前處理樣品 （包括配合飼料、濃縮飼料和玉米、麩皮、豆粕、棉籽粕、玉米酒精糟等飼料原料），實驗結果表明：黃曲霉毒素濃度在0～50 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數(shù)R達到0.999 99以上。與液相色譜—串聯(lián)質譜法相比，不同樣品基質之間干擾不大，黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2回收率均能達到90%左右。

HPLC法的優(yōu)點是測定準確、靈敏度高、凈化效果好、回收率高，可同時測定多種黃曲霉毒素成分，完成定性、定量測定。但缺點是免疫親和柱的價格昂貴，檢測成本高，前處理復雜，檢驗速度較慢，且需要在專業(yè)實驗室經專業(yè)人員進行檢測，不能滿足黃曲霉毒素現(xiàn)場篩查和質量控制的需求。

2.5 液相色譜—串聯(lián)質譜法 我國農業(yè)行業(yè)標準NY/T 2071-2011規(guī)定了飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素含量的液相色譜—串聯(lián)質譜測定方法。該方法原理為試樣中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素經乙腈溶液提取，正己烷脫脂及霉菌毒素多功能凈化柱凈化后，氮氣吹干，甲酸乙腈溶液注解，采用色譜保留時間和質譜碎片及其離子豐度比定性，外標法定量［12］。相比于HPLC法，該方法無需進行柱前或柱后衍生處理，操作相對簡捷，分析時間較短，且可以同時檢測黃曲霉素毒素和其他各類真菌毒素，降低檢測成本。

LC-MS/MS法具有比HPLC更高的靈敏度和準確性，但在我國測定飼料黃曲霉毒素的方法標準中，靈敏度卻低于HPLC法。我國農業(yè)部行業(yè)標準中 LC-MS/MS 法黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的檢出限均為1 μg/kg，高于國家標準HPLC法的檢出限。而且LC-MS/MS法的基質抑制效應對檢測結果定量準確性影響較大［13］。

筆者所在檢驗室按照NY/T 2071-2011標準方法前處理樣品（包括配合飼料、濃縮飼料和玉米、麩皮、豆粕、棉籽粕、玉米酒精糟等飼料原料），質控點選用2倍定量限，標準工作液外標法單點校正，實驗結果表明不同飼料樣品之間基質干擾不同，不同飼料回收率差異較大。進一步優(yōu)化前處理方法，降低基質效應、提高檢測靈敏度是LC-MS/MS法測定飼料中黃曲霉毒素所面對的首要問題。王秀嬪等［14］建立了超聲提取—液相色譜—電噴霧三重串聯(lián)四極桿質譜測定玉米、大米、大豆等糧油固體樣品中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的方法， 結果表明以黃曲霉毒素M1作為內標，可以有效地降低基質效應的影響，相比于外標法能極大地提高方法的準確度。該方法為今后黃曲霉毒素的液相色譜—質譜檢測提供了新的思路。

3 結論

隨著檢測技術的不斷發(fā)展，飼料黃曲霉毒素的檢測方法越來越多，檢測效率越來越高。由于各種單一方法的局限及不同方法的互補性，衍生出復合型的檢測方法，不僅綜合了不同方法的優(yōu)點，提高了檢測精度，而且通過互補使其靈敏度更高，特異性更強，前處理更加簡單。在未來，一方面要推動黃曲霉毒素向集成、準確、快速、簡便、智能化的快速檢測技術發(fā)展；另一方面，要大力發(fā)展技術特異性強、靈敏度高、檢測限低、定量結果準確、自動化程度高的先進儀器技術，二者的相互結合使用，將是以后的發(fā)展趨勢。

［1］中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB 13078-2001，飼料衛(wèi)生標準［S］.北京：中國標準出版社，2001.

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［5］中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 8381-2008，飼料中黃曲霉毒素B1的測定 半定量薄層色譜法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［6］中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 17480-2008，飼料中黃曲霉毒素B1的測定酶聯(lián)免疫吸附法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

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S816.17

A文章順序編號：1672-5190（2016）03-0033-03

2016－03－01

劉利曉（1982—），女，畜牧師，碩士，主要從事獸藥、飼料與畜產品檢測工作。

（責任編輯：錢英紅）