奶牛子宮內(nèi)膜組織體外培養(yǎng)方法的建立及前列腺素E2和F2α受體分布的研究

張雙翼 ，毛 偉 ，劉 博 ，曹金山

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

奶牛子宮內(nèi)膜組織體外培養(yǎng)方法的建立及前列腺素E2和F2α受體分布的研究

張雙翼1，2，毛 偉1，2，劉 博1，2，曹金山1，2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

［目的］建立體外培養(yǎng)荷斯坦奶牛子宮內(nèi)膜組織的方法及檢測子宮內(nèi)膜組織中前列腺素E2和前列腺素F2α受體的分布情況。［方法］挑選新鮮、健康的發(fā)情前期奶牛子宮內(nèi)膜組織，采集雙側(cè)子宮角部位內(nèi)膜組織，體外懸浮培養(yǎng)組織小塊并通過組織學(xué)形態(tài)鑒定培養(yǎng)效果。通過RT-qPCR方法檢測PGE2受體 EP1、EP2、EP3（EP3A、EP3B、EP3C、EP3D）、EP4 和 PGF2α受體 FP 的表達情況。 ［結(jié)果］HE 染色表明，體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)完整，細胞和腺體形態(tài)完好，細胞核完好；發(fā)情前期奶牛子宮角部位內(nèi)膜組織中PGE2和PGF2α受體均有表達，且表達量存在差異，其中PGE2受體EP4相對表達量最高，而EP1、EP3B及PGF2α受體FP的相對表達量較低。［結(jié)論］成功地建立了奶牛子宮內(nèi)膜組織的體外培養(yǎng)方法；PGE2和PGF2α的受體在奶牛子宮內(nèi)膜組織中均有表達，但不同受體的表達量有所不同。

前列腺素；PGE2；PGF2α；受體；實時熒光定量 PCR

提高奶牛繁殖能力是保障和促進奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康和快速發(fā)展的重要基礎(chǔ)。目前，導(dǎo)致奶牛繁殖力下降的主要疾病為奶牛不孕癥。研究表明，在臨床上引起奶牛不孕的主要因素是生殖器官疾病和機能障礙。對內(nèi)蒙地區(qū)奶牛不孕癥的病因進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎性的不孕癥占不孕癥奶牛的2/3。奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療方法主要有子宮沖洗法、子宮灌注抗生素法、全身抗生素療法、激素療法、生物療法、中草藥療法等。但是這些治療方法中均沒有考慮到子宮內(nèi)膜的保護與修復(fù)問題。此外，奶牛的分娩、流產(chǎn)或其他疾病過程也可能對子宮內(nèi)膜造成損傷。子宮內(nèi)膜與胎兒的孕育過程密切相關(guān)，其微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)與健全對胚胎的順利生長非常重要。因此，在治療子宮疾病及日常奶牛養(yǎng)殖過程中，應(yīng)該考慮子宮內(nèi)膜的保護與修復(fù)問題。大量研究表明，子宮內(nèi)膜有很強的自我修復(fù)功能，那么，其中的修復(fù)機制能否為獸醫(yī)臨床提供一些潛在的治療子宮內(nèi)膜損傷的方法？但是目前，子宮內(nèi)膜的自我修復(fù)機制尚未被闡明。

前列腺素類化合物（prostaglandin）是花生四烯酸在環(huán)氧合酶 （cyclooxygenase，COX）作用下的產(chǎn)物， 包括 prostaglandin E2（PGE2）、prostaglandin I2（PGI2）、prostaglandin F2α（PGF2α）、prostaglandin D2（PGD2），前列腺素類化合物通過與G蛋白偶聯(lián)的受體結(jié)合后發(fā)揮作用。目前，已發(fā)現(xiàn)的PGE2受體有EP1、EP2、EP3 及其亞型 EP3A、EP3B、EP3C、EP3D，EP4，這些受體與不同的G蛋白偶聯(lián)發(fā)揮作用。EP2、EP4與Gs偶聯(lián)，導(dǎo)致第二信使cAMP升高，而EP1與哪一種G蛋白偶聯(lián)還未被發(fā)現(xiàn)，但EP1被激活后可以導(dǎo)致Ca2+濃度升高。EP3A與Gi偶聯(lián)，導(dǎo)致cAMP含量下降，EP3B、EP3C與Gs偶聯(lián)，可以使胞內(nèi) cAMP含量升高，EP3D 與 Gi、Gs、Gq偶聯(lián)，在不同情況下升高或下調(diào)cAMP，也可以促進磷脂酰肌醇分解為三磷酸腺苷和二?；视停^而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。PGF2α受體（FP）與Gq結(jié)合，促進磷脂酰肌醇分解為三磷酸腺苷和二?；视?，進而發(fā)揮作用。研究表明，COX-1和COX-2存在于子宮內(nèi)膜中［1］。COX-2的分泌量隨著生理周期的變化呈現(xiàn)周期性變化。在增殖期的子宮內(nèi)膜上皮細胞中COX-2表達量升高，在子宮內(nèi)膜癌細胞中COX-2表達量也升高［2］。COX-2的抑制劑能夠抑制子宮內(nèi)膜移位組織的生長和移位組織中血管的發(fā)生［3］。研究證實，PGE2和PGF2α的受體在增殖期的子宮內(nèi)膜上皮細胞中表達量明顯上升［4］。研究表明，PGF2α在子宮內(nèi)膜的重建過程中發(fā)揮重要作用［5］。在mPGES（PGE2合成酶）基因敲除鼠上開展的研究證實，PGE2能夠影響子宮內(nèi)膜組織的生長［6］。在子宮內(nèi)膜上皮細胞中，PGE2和PGF2α能夠誘導(dǎo)結(jié)締組織生長因子（CTGF）mRNA 和蛋白的表達［7］。在人的子宮內(nèi)膜上皮細胞中，PGF2α能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達［8］。EP2/EP4 的特異性抑制劑能夠抑制子宮內(nèi)膜異位組織部位的生長以及血管和神經(jīng)的生長［9-10］。以上提示，PGE2和 PGF2α在子宮內(nèi)膜的自我修復(fù)過程中可能發(fā)揮作用。

為了研究PGE2和PGF2α在奶牛子宮內(nèi)膜自我修復(fù)過程中是否發(fā)揮作用，首先應(yīng)明確PGE2和PGF2α受體在奶牛子宮內(nèi)膜中的表達情況。該研究旨在通過建立體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜組織的方法并檢測PGE2和PGF2α受體在子宮內(nèi)膜中的分布情況，為前列腺素類藥物在奶牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜損傷治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 組織：采集內(nèi)蒙古呼和浩特市某屠宰場當天宰殺的健康荷斯坦奶牛雙側(cè)子宮角，通過肉眼觀察卵泡大小及黃體形態(tài)，選取發(fā)情前期的子宮角部位組織。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清 （ExCell Biology，Inc.，China），DMEM/F-12（Gibco，USA），青鏈霉素（Gibco，USA），兩性霉素 B（GENERAY，China），AxyPrep Multisource Total mRNA Miniprep Kit（Axygen Scientific，USA），SYBR PremixExTaq Ⅱ （TaKaRa，Japan），PrimerScriptRT MasterMix （TaKaRa，Japan），6×Loading Buffer （TaKaRa，Japan）， 瓊脂糖（Invitrogen，China）。 引物由 Invitrogen 公司合成。

1.1.3 儀器設(shè)備：高壓自動蒸汽滅菌鍋，購自Hirayama公司；低速臺式離心機，購自上海安亭公司；高速低溫離心機，購自Beckman公司；超純水儀，購自Biotech公司；制冰機，購自Panasonic公司；-80℃低溫冰箱，購自Thermo公司；-20℃低溫冰箱，購自美菱公司；酶標儀，購自Bio-Tek公司；ABIViiATM7型實時熒光定量PCR儀，購自Life公司；光學(xué)顯微鏡，購自O(shè)LYMPUS公司；Champ GelTM 5000型凝膠成像系統(tǒng)，購自Vilber公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織樣品采集及處理：在屠宰場，以無菌操作取新鮮的奶牛子宮角，長度4 cm左右，用冰盒保存，盡快送到實驗室。在實驗室內(nèi)，將新鮮組織用PBS （含 100 IU/mL 雙抗，2.5 μg/mL 兩性霉素 B）沖洗3遍，4℃保存1 h，然后在無菌條件下縱向剖開子宮角，用彎剪刀和眼科鑷將含有子宮內(nèi)膜上皮細胞和間質(zhì)細胞的子宮內(nèi)膜組織取下，把子宮內(nèi)膜組織剪成直徑大約為2 mm的碎塊，放入含有5 mL培養(yǎng)液（DEME/12 20%胎牛血清，100 IU/mL雙抗，2.5 μg/mL兩性霉素 B）的 6孔板中，在 5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，間隔24 h更換1次培養(yǎng)基，直到進行下一步處理。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察：為了考查體外培養(yǎng)對子宮內(nèi)膜活性的影響，將培養(yǎng)10 d后的子宮內(nèi)膜組織和正常的子宮內(nèi)膜組織用4%多聚甲醛固定，然后進行HE染色，在顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.2.3 RT-PCR：總RNA提取：將用液氮凍存的、經(jīng)體外培養(yǎng)10 d后的奶牛子宮內(nèi)膜組織進行研磨，按照RNA提取試劑盒說明書提供的方法提取組織總RNA，總 RNA 的 OD260nm/OD280nm值在 1.9～2.0。反轉(zhuǎn)錄：將總RNA濃度調(diào)整至500 ng/μL以下，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法進行RNA反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系見表1。

表1 RT-PCR反應(yīng)體系

1.2.4 實時熒光定量PCR：使用ABI公司提供的ViiATM7 Real-time PCR檢測系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μL（見表2）。引物序列見表3。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 30 s；95℃變性 15 s，58℃退火溫度 34 s；72℃延伸 30 s，共40個循環(huán)；從 70℃到95℃隔 0.5℃制作融解曲線。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理：以β-actin作為內(nèi)參基因，通過對目的基因和內(nèi)參基因進行均一化處理，計算目的基因轉(zhuǎn)錄的相對表達量。采用2-ΔCt法計算目的基因的相對表達量，利用目的基因及內(nèi)參基因Ct值計算ΔCt值，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

表2 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)觀察 從外觀來看，體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)與正常組織相似。HE染色表明，培養(yǎng)10 d后的子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)完整（見圖1）?？v向切片表明，子宮內(nèi)膜組織完整且沒有肌層，子宮內(nèi)膜的腺體清晰可見，貫穿子宮內(nèi)膜。橫向切片表明，細胞間距狹窄，細胞連接處可見細胞膜，細胞核完整圓潤。

2.2 前列腺素受體的表達 由圖2可知，在發(fā)情前期的奶牛子宮內(nèi)膜組織中，PGE2的受體EP4的表達量最高，EP1、EP2、EP3、EP3A、EP3C、EP3D 均有表達，EP3B表達量最低；PGF2α的受體FP也有表達。

3 討論

子宮內(nèi)膜的自我修復(fù)過程復(fù)雜，其包含一系列的生理反應(yīng)過程。研究表明，PGE2和PGF2α在子宮內(nèi)膜組織修復(fù)過程中可能發(fā)揮作用，通過激活PGE2和PGF2α的受體參與組織修復(fù)相關(guān)因子的調(diào)控。在人的子宮內(nèi)膜上皮細胞中，PGE2能夠促進結(jié)締組織生長因子（CTGF）的表達，而CTGF能夠促進細胞分化，其在組織生長、傷口愈合、血管發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用［11］。PGE2在黃體溶解過程中促進FGF-2的表達，F(xiàn)GF-2能夠促進新組織的生長［12］。在體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細胞中，PGF2α能夠促進VEGF的表達，而VEGF具有促進血管發(fā)生、細胞分化以及保護神經(jīng)的作用［13-14］。在PC細胞抑制前列腺素的合成后，單獨給予PGE2，發(fā)現(xiàn)PGE2能夠促進PC細胞的增殖、黏附、轉(zhuǎn)移和入侵能力［15］。PGE2還可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，如在機體抵抗病原微生物的侵染過程中發(fā)揮作用。以上研究探索了PGE2和PGF2α參與子宮內(nèi)膜保護和修復(fù)過程的可能性，但PGE2和PGF2α在奶牛子宮內(nèi)膜修復(fù)過程中的具體作用還沒有被闡明。探究PGE2和PGF2α在子宮內(nèi)膜修復(fù)中的可能作用，首先應(yīng)明確二者受體在子宮內(nèi)膜的表達情況。該研究結(jié)果表明，奶牛子宮內(nèi)膜中存在已知的PGE2和PGF2α的所有受體，且不同受體及受體亞型的表達存在差異。有研究證實，在奶牛輸卵管中沒有EP3的表達，說明在不同組織中，PGE2和PGF2α的受體分布可能有所不同。該研究成功地建立了體外培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜組織的方法。通過RT-qPCR方法檢測了PGE2和PGF2α的受體在發(fā)情前期奶牛子宮內(nèi)膜組織中的分布情況，并分析了受體之間表達量的差異。結(jié)果表明，PGE2和PGF2α的受體在子宮內(nèi)膜均有分布，而且受體的表達量存在差異，其中EP4表達量最高，EP1、EP3B的FP的表達量相對較低。

表3 實時熒光定量PCR反應(yīng)中所用的引物序列

圖1 子宮內(nèi)膜組織體外培養(yǎng)鑒定

圖2 奶牛子宮內(nèi)膜組織中PGE2和PGF2α受體的表達情況

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Establishment of Cultivation Method of Bovine Endometrial Tissue in vitro and Expression of PGE2and PGF2αReceptors

ZHANG Shuang-yi1，2，MAO Wei1，2，LIU Bo1，2，CAO Jin-shan1，2
（1.College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Techniques for Animal Disease，Ministry of Agriculture，Hohhot010018，China）

［Objective］ To establish the cultivation method of bovine endometrial tissue in vitro and to detect the expression of the receptors of PGE2and PGF2αin the cultured endometrium. ［Methods］ The fresh endometrial tissue samples from bilateral uterine horn of health dairy cows in proestrus were collected and used for suspension cultivation in vitro.The cultured endometrium was histologically identified,and the expression of the receptors of PGE2,including EP1,EP2,EP3（EP3A、EP3B、EP3C、EP3D）,EP4,and the receptors of PGE2αFP were evaluated by RT-qPCR. ［Results］ The histological assessment indicated that the structure of cultured bovine endometrium in vitro was intact,and the morphology of the glands and nuclear of the cells was normal.The expression of all the tested receptors of PGE2and PGF2αwere found in the cultured samples from bilateral uterine horn of dairy cows in proestrus.The expression of the receptors varied,the highest relative expression was observed in EP4,and the expression of EP1,EP3B and FP was relatively lower. ［Conclusion］ The in vitro cultivation method of bovine endometrial tissue was successfully established.The expression of the receptors of PGE2and PGF2αwere found in cultured endometrium,and the relative expression of different types of receptors varied.

prostaglandin；PGE2；PGF2α；receptor；RT-qPCR

S859.7；S858.237.23

A文章順序編號1672-5190（2016）03-0014-04

2016－03－06

項目來源：國家自然科學(xué)基金項目（31360627）；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新團隊項目（NDPYTD2013-1）。

張雙翼（1989—），男，碩士研究生，主要研究方向為獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)。

曹金山（1973—），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)。

（責(zé)任編輯：趙俊利）