豬鼻支原體表面可變脂蛋白vlpA黏附宿主細(xì)胞功能研究

張必雄，熊祺琰，王　佳，紀(jì)　燕，倪　博，韋艷娜，馮志新，劉茂軍，邵國(guó)青,3*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京210014；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 0308003;3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095)

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豬鼻支原體表面可變脂蛋白vlpA黏附宿主細(xì)胞功能研究

張必雄1，2，熊祺琰1*，王佳1，紀(jì)燕1，倪博1，韋艷娜1，馮志新1，劉茂軍1，邵國(guó)青1,3*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京210014；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 0308003;3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095)

豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis)可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎及中耳炎等多種慢性炎癥，感染率極高，且與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。已有研究表明豬鼻支原體表面可變脂蛋白(vlp)家族參與支原體黏附宿主細(xì)胞的過(guò)程，本試驗(yàn)主要詳細(xì)研究vlp家族成員之一vlpA的黏附細(xì)胞功能，特別是其Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)變化對(duì)其黏附能力的影響。根據(jù)GenBank中已公布的vlpA的基因序列，設(shè)計(jì)引物，從菌體DNA中擴(kuò)增獲得vlpA基因，或者人工合成Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)不等的一系列vlpA基因，均克隆至pET-32a(+)質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)，獲得目的蛋白質(zhì)。同時(shí)利用固相合成法制備含兩段Ⅲ區(qū)重復(fù)片段的多肽。利用間接免疫熒光試驗(yàn)和微孔板黏附試驗(yàn)檢測(cè)所制備的各種重組vlpA蛋白和多肽的黏附功能。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和鎳柱親和層析純化，成功獲得純度較高的各個(gè)目的蛋白質(zhì)。利用間接免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)vlpA可以黏附宿主細(xì)胞；利用微孔板黏附試驗(yàn)定量檢測(cè)不含Ⅲ區(qū)的重組vlpA0蛋白及Ⅲ區(qū)重復(fù)片段多肽的黏附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)vlpA0可黏附細(xì)胞，而Ⅲ區(qū)重復(fù)片段多肽無(wú)明顯黏附能力；進(jìn)一步利用微孔板黏附試驗(yàn)檢測(cè)含Ⅲ區(qū)重復(fù)片段次數(shù)分別為3、6、9、12次的重組蛋白vlpA3、vlpA6、vlpA9、vlpA12的黏附能力，結(jié)果顯示四種重組蛋白質(zhì)均可黏附細(xì)胞，但黏附水平均低于不含Ⅲ區(qū)的重組vlpA0蛋白，且隨著Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)的增加黏附能力下降。本研究結(jié)果提示vlpA為豬鼻支原體黏附因子之一，其Ⅱ區(qū)含有黏附位點(diǎn)，而整體分子的黏附能力隨著Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)的增加明顯減弱。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步研究豬鼻支原體的黏附及致病機(jī)制。

豬鼻支原體；可變脂蛋白vlpA；細(xì)胞黏附；重復(fù)次數(shù)

豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，M.hyorhinis)可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎及中耳炎等多種慢性炎癥[1-4]，通常由母豬或大豬經(jīng)呼吸道傳染給小豬，進(jìn)而從呼吸道侵染全身引發(fā)疾病。M.hyorhinis也是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)的常見(jiàn)污染物[5]。同時(shí)近年來(lái)研究者在人胃癌組織中檢測(cè)到M.hyorhinis，并進(jìn)而發(fā)現(xiàn)M.hyorhinis的感染與包括胃癌、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等在內(nèi)的多種癌癥有明顯相關(guān)性，提示M.hyorhinis與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅[6-13]。支原體一般不通過(guò)直接的毒力因子致病，而是通過(guò)長(zhǎng)期持續(xù)性感染引發(fā)機(jī)體慢性炎癥應(yīng)答而導(dǎo)致病變的發(fā)生。幾乎所有的人和動(dòng)物支原體都通過(guò)最初的黏附宿主細(xì)胞從而實(shí)現(xiàn)后續(xù)在體內(nèi)的增殖和感染，因此黏附因子在支原體感染致病的過(guò)程中起著極為重要的作用。到目前為止M.hyorhinis的黏附因子尚不清楚，這嚴(yán)重阻礙了其致病機(jī)制的深入研究。

支原體的基因組中常常含有可變基因家族，用于編碼大容量的可變抗原庫(kù)，使得菌體表面的抗原性發(fā)生變化，有效逃避宿主免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期感染[14-15]。M.hyorhinis中發(fā)現(xiàn)的可變蛋白質(zhì)被稱為可變脂蛋白(variable lipoprotein，vlp)家族[16-18]。目前共發(fā)現(xiàn)有7個(gè)成員，即vlpA、vlpB、vlpC、vlpD、vlpE、vlpF和vlpG。M.hyorhinis可表達(dá)一種或多種vlp，構(gòu)成不同的表達(dá)組合；同時(shí)每個(gè)vlp成員內(nèi)部都含有“數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)(variable number of tandem repeats，VNTR)區(qū)”，可通過(guò)插入或缺失基因片段改變重復(fù)次數(shù)，從而使整個(gè)分子的長(zhǎng)度發(fā)生變化。通過(guò)這兩種表達(dá)變異，幫助支原體改變表面抗原性，逃避宿主免疫系統(tǒng)。

在前期研究中作者已經(jīng)證明vlp家族具有黏附細(xì)胞功能，本試驗(yàn)主要針對(duì)vlp 7個(gè)成員之一的vlpA的黏附功能進(jìn)行具體研究，包括黏附能力檢測(cè)、黏附功能區(qū)域鑒定、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)區(qū)(即Ⅲ區(qū))的片段重復(fù)次數(shù)對(duì)黏附能力的影響。

1　材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1材料與試劑質(zhì)粒pET-32a(+)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存；大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。PCR各種試劑、T4 DNA連接酶、DNA和蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、XhoⅠ和HindⅢ均購(gòu)自TaKaRa公司；引物由南京金斯瑞生物科技公司合成；HRP-羊抗兔IgG、FITC-羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德公司；兔抗硫氧還蛋白多抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2PK-15細(xì)胞培養(yǎng) PK-15細(xì)胞用含10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至90%以上時(shí)，胰蛋白酶消化。細(xì)胞以2×105·孔-1接種于96孔細(xì)胞板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2vlpA基因的擴(kuò)增及重組vlpA蛋白構(gòu)建

vlpA基因結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中Ⅰ區(qū)編碼信號(hào)肽，Ⅲ區(qū)為數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)區(qū)。根據(jù)GenBank中已公布的豬鼻支原體vlpA基因序列，利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物，從豬鼻支原體基因組中擴(kuò)增vlpA基因(不含信號(hào)肽)。PCR引物序列如下：vlpA-F，5′-GACGGATCCTGTGGACAAACAGATAATA-A-3′；vlpA-R，5′-CGCAAGCTTCTATTGTG-TGTTTTCAGTTTTTG-3′，兩端分別添加BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與pEASY-E1載體酶連接構(gòu)建pEASY-E1/vlpA重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR及測(cè)序驗(yàn)證正確后以vlpA上下游引物擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)雙酶切后插入pET-32a(+)空載體質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET-32a(+)/vlpA。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，以引物vlpA-F和T7終止子引物進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性克隆，并測(cè)序鑒定序列的正確性。制備甘油管保存菌種，命名為vlpA。

1.3vlpA蛋白Ⅱ區(qū)重組蛋白構(gòu)建

根據(jù)GenBank 上公布的豬鼻支原體vlpA基因序列，合成編碼vlpAⅡ區(qū)肽段的基因(圖1)，同時(shí)進(jìn)行大腸桿菌偏愛(ài)密碼子的優(yōu)化。合成基因的兩端添加EcoRⅠ和HindⅢ位點(diǎn)，通過(guò)雙酶切連入pET-32a(+)中，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET-32a(+)/vlpA0。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，以T7啟動(dòng)子和T7終止子引物進(jìn)行PCR篩選陽(yáng)性克隆，并測(cè)序鑒定序列的正確性。制備甘油管保存菌種，命名為vlpA0。

圖1　vlpA結(jié)構(gòu)和試驗(yàn)中用到的重組蛋白質(zhì)、多肽結(jié)構(gòu)示意Fig.1　Gene structure of vlpA and recombinant vlp proteins and peptides used in the present study

1.4vlpA蛋白Ⅲ區(qū)重復(fù)片段多肽的合成

采用固相化學(xué)合成的方法合成2次重復(fù)的vlpAⅢ區(qū)重復(fù)片段(圖1)，其N(xiāo)端添加一個(gè)半胱氨酸用于偶聯(lián)KLH(keyhole limpet hemocyanin)。具體序列為“NH2-CKTENTQQSEAPGTKTENTQQSEAPGT-COOH”，合成肽經(jīng)高效液相色譜純化，純度大于85%。短肽的合成及偶聯(lián)由Synpeptide有限公司完成。

1.5Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)不等的系列vlpA重組蛋白的構(gòu)建

根據(jù)GenBank 上公布的豬鼻支原體vlpA基因序列，采用基因合成方法獲得Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)分別為3、6、9、12次的vlpA基因，同時(shí)進(jìn)行大腸桿菌偏愛(ài)密碼子的優(yōu)化。合成的基因的兩端添加EcoRⅠ和HindⅢ位點(diǎn)，通過(guò)雙酶切裝入pET-32a(+)中，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET-32a(+)/vlpAn(n為3、6、9或12)。同前轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，命名為vlpA3、6、9、12。

1.6重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化

接種100 μL重組工程菌甘油管菌液至5 mL氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，次日將菌液以2%的量接種至250 mL氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至OD630 nm值達(dá)0.6～1.0時(shí)加入IPTG(終濃度為1 mmol·L-1)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，5 h后收集菌體。同時(shí)設(shè)立轉(zhuǎn)化pET-32a(+)空載體的工程菌為陰性對(duì)照。收集菌液后超聲裂解菌體，離心收集上清并用鎳柱親和層析純化。

1.7間接免疫熒光檢測(cè)蛋白黏附功能

PK-15細(xì)胞以2×105·孔-1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL·孔-1，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，PBS(pH 7.4)洗滌1次，每次5 min(以下簡(jiǎn)稱洗滌)；用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液將vlpA蛋白稀釋至0.5 mg·mL-1，100 μL·孔-1，37 ℃孵育2 h后洗滌3次；每孔加入100 μL冰乙醇4 ℃固定30 min，洗滌3次；每孔加入200 μL 1%BSA于4 ℃封閉過(guò)夜，洗滌4次；加入1∶10倍稀釋的兔抗vlpA高免血清，100 μL·孔-1，于37 ℃孵育1.5 h，洗滌4次；加入1∶50倍稀釋的FITC-羊抗兔IgG抗體，50 μL·孔-1，于37 ℃避光孵育1 h，洗滌5次，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，以PBS和空載體蛋白質(zhì)為對(duì)照。

1.8微孔板黏附試驗(yàn)定量檢測(cè)蛋白質(zhì)黏附能力

收獲細(xì)胞后用試劑盒(細(xì)胞膜蛋白質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑盒，碧云天公司)抽提細(xì)胞膜蛋白質(zhì)。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol·L-1；pH9.6)將蛋白質(zhì)稀釋至10 μg·mL-1，100 μL·孔-1包被酶標(biāo)板，4 ℃過(guò)夜，次日用PBST(pH 7.4)洗4次，每次5 min(以下簡(jiǎn)稱洗滌)；每孔加入200 μL 含5%BSA的PBS于37 ℃封閉1.5 h，洗滌；將重組蛋白質(zhì)或多肽偶聯(lián)物稀釋至100、50、25、12.5、6.25、3.125、1 μg·mL-1，每孔加入100 μL于37 ℃黏附1.5 h，洗滌；加入1∶2 000倍稀釋的兔抗硫氧還蛋白多抗或兔抗KLH多抗，100 μL·孔-1，于37 ℃孵育1 h，洗滌；加入1∶15 000倍稀釋的HRP-羊抗兔IgG抗體，100 μL·孔-1，于37 ℃孵育1 h，洗滌；每孔加入TMB顯色液100 μL，避光孵育5 min；每孔加入2 mol·L-1H2SO4終止液50 μL終止反應(yīng)，于450～630 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，以PBS、空載體蛋白或KLH為對(duì)照。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行one-Way ANOVA分析，P<0.05判定為具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)　果

2.1重組 vlpA黏附宿主細(xì)胞

從豬鼻支原體基因組中成功擴(kuò)增vlpA基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)/vlpA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，PCR鑒定結(jié)果如圖2A所示，DNA測(cè)序結(jié)果正確。重組菌用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)可見(jiàn)與空載體對(duì)照菌相比重組菌誘導(dǎo)后在34與43 ku之間出現(xiàn)一條明顯的表達(dá)條帶(圖2B，泳道2)。菌體超聲破碎后取上清和沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)目的蛋白質(zhì)主要以可溶性形式表達(dá)，重組蛋白質(zhì)經(jīng)Ni-柱純化后，得到單一的目的蛋白質(zhì)條帶(圖2B，泳道3)。

A.重組質(zhì)粒pET-32a(+)/vlpA的PCR鑒定[M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對(duì)照；2.pET-32a(+)/vlpA的PCR產(chǎn)物]；B.vlpA重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化[M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a(+)空載體對(duì)照菌誘導(dǎo)后；2.pET-32a(+)/vlpA重組菌誘導(dǎo)后；3.純化的vlpA重組蛋白]A.PCR identification of pET-32a(+)/vlpA[M.DNA molecular weight marker 1.Negative control；2.PCR product of pET-32a(+)/vlpA]；B.Expression and purification of the recombinant vlpA protein[M.Protein molecular weight marker；1.Total protein of E.coil BL-21 containing pET-32a(+) after induction；2.Total protein of E.coil BL-21 containing pET-32a(+)/vlpA after induction；3.Purified pET-32a(+)/vlpA protein]圖2　vlpA重組蛋白的構(gòu)建、表達(dá)與純化Fig.2　Construction，expression and purification of recombinant vlpA protein

向培養(yǎng)有PK-15的細(xì)胞孔中加入vlpA蛋白共同孵育，用間接免疫熒光法檢測(cè)黏附情況，顯微鏡觀察，結(jié)果如圖3A所示，vlpA蛋白可黏附細(xì)胞板中培養(yǎng)的細(xì)胞，空載體對(duì)照蛋白質(zhì)無(wú)明顯黏附。

用細(xì)胞膜蛋白質(zhì)包被酶標(biāo)板，加入不同質(zhì)量濃度的vlpA蛋白，定量檢測(cè)vlpA的黏附功能，結(jié)果見(jiàn)圖3B。在3.125～100 μg·mL-1蛋白質(zhì)量濃度區(qū)間，vlpA可黏附到PK-15細(xì)胞膜蛋白質(zhì)上(P<0.01)，呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.2vlpA黏附細(xì)胞功能區(qū)域初步鑒定

構(gòu)建僅含有Ⅱ區(qū)結(jié)構(gòu)的vlpA0重組蛋白質(zhì)，克隆及蛋白質(zhì)表達(dá)純化結(jié)果見(jiàn)圖4A泳道1，圖4B泳道2、3。用該重組蛋白鑒定Ⅱ區(qū)的黏附功能，微孔板黏附試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5A。結(jié)果顯示vlpA0可黏附PK-15細(xì)胞膜蛋白質(zhì)(P<0.01)，在12.5～100 μg·mL-1蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度區(qū)間呈現(xiàn)劑量依賴性。

化學(xué)合成含有2次重復(fù)的Ⅲ區(qū)重復(fù)片段的多肽，并與KLH偶聯(lián)，用微孔板黏附試驗(yàn)檢測(cè)其黏附功能，結(jié)果顯示與未偶聯(lián)的KLH相比，Ⅲ區(qū)重復(fù)片段多肽-KLH沒(méi)有明顯的黏附功能(圖5B)。

A.vlpA重組蛋白黏附細(xì)胞能力間接免疫熒光檢測(cè)(a.vlpA；b.陰性對(duì)照；c.空載體蛋白質(zhì))；B.微孔板黏附試驗(yàn)測(cè)定vlpA重組蛋白黏附PK-15細(xì)胞(與陰性對(duì)照相比，** 表示差異極顯著，P<0.01)A.The result of vlpA adhere to PK-15 cells (a.vlpA；b.Negative control；c.Blank vector protein control)；B.Identification of cytoadhesion function of recombinant vlpA protein by the microtiter plate adhesion test (compared with the negative control，** indicates statistical significance at P<0.01 level)圖3　vlpA重組蛋白黏附PK-15細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果Fig.3　The adhesion of recombinant vlpA protein to PK-15 cells

A.重組質(zhì)粒pET-32a(+)/vlpA(0、3、6、9、12)的PCR鑒定[M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～5.pET-32a(+)/vlpA(0、3、6、9、12)的PCR產(chǎn)物]；B.vlpA(0、3、6、9、12)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)及純化[M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET-32a(+)空載體對(duì)照菌誘導(dǎo)后；2、4、6、8、10.重組菌誘導(dǎo)后；3、5、7、9、11.純化的vlpA(0、3、6、9、12)重組蛋白質(zhì)]A.PCR identification of recombinant plasmids pET-32a(+)/vlpA(0，3，6，9，12)[M.DNA molecular weight marker；1-5.PCR products of pET-32a(+)/vlpA(0，3，6，9，12) amplified by T7 promoter and T7 terminator primers]；B.Expression and purification of the recombinant vlpA (0，3，6，9，12) proteins[M.Protein molecular weight marker；1.Total protein of E.coil BL-21 containing pET-32a(+) after induction；2，4，6，8，10.Total protein of E.coil BL-21 containing pET-32a(+)/vlpA (0，3，6，9，12) after induction；3，5，7，9，11.Purified recombinant vlpA (0，3，6，9，12) proteins]圖4　Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)不等的系列vlpA重組蛋白質(zhì)的構(gòu)建、表達(dá)和純化Fig.4　Construction，expression and purification of recombinant vlpA proteins containing different repeats of repetitive unit in region Ⅲ

A.vlpA0重組蛋白黏附PK-15細(xì)胞；B.vlpAⅢ區(qū)重復(fù)片段多肽黏附PK-15細(xì)胞。與陰性對(duì)照相比，** 表示差異極顯著(P<0.01)A.The adhesion of recombinant vlpA0 protein to PK-15 cells；B.The adhesion of peptide of repetitive unit in region Ⅲ to PK-15 cells.Compared with PBS，** indicates statistical significance at P<0.01 level圖5　vlpA黏附功能區(qū)域鑒定Fig.5　Adhesion area identification of vlpA

2.3數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)區(qū)的重復(fù)次數(shù)對(duì)vlpA黏附能力的影響研究

設(shè)計(jì)構(gòu)建Ⅲ區(qū)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)區(qū)重復(fù)次數(shù)分別為3、6、9、12的系列重組vlpA蛋白，其鑒定與表達(dá)純化結(jié)果見(jiàn)圖4。利用微孔板黏附法對(duì)這四種蛋白的細(xì)胞黏附能力進(jìn)行了檢測(cè)，并與不含Ⅲ區(qū)的vlpA0蛋白進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)圖6。在3.125～100 μg·mL-1蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度區(qū)間，與空載體對(duì)照蛋白相比，四種vlpA重組蛋白均可明顯黏附PK-15細(xì)胞，呈現(xiàn)劑量依賴性；但這四種蛋白質(zhì)的黏附能力均低于不含Ⅲ區(qū)的vlpA0蛋白，且隨著重復(fù)次數(shù)的增多，黏附能力下降。

與空載體對(duì)照蛋白組相比較，* 表示差異顯著(P<0.05)，** 表示差異極顯著(P<0.01)；與vlpA0蛋白組相比較，# 表示差異顯著(P<0.05)，## 表示差異極顯著(P<0.01)Compared with the group of blank vector protein control，* indicates statistical significance at P<0.05 level，** indicates statistical significance at P<0.01 level；Compared with the group of vlpA0，# indicates statistical significance at P<0.05 level，## indicates statistical significance at P<0.01 level圖6?、髤^(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)不等的系列vlpA重組蛋白黏附細(xì)胞檢測(cè)Fig.6　Cytoadhesion detection of recombinant vlpA proteins containing different repeats of repetitive unit in region Ⅲ

3　討　論

M.hyorhinis在豬場(chǎng)的臨床感染率極高，PCR檢出率可達(dá)50%～70%以上，并與多種人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，屬于人獸共患性病原。同時(shí)M.hyorhinis可污染各種體外培養(yǎng)細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)其可黏附甚至侵入細(xì)胞內(nèi)部。黏附是支原體感染的前提，而M.hyorhinis的黏附因子至今仍未有報(bào)道。在前期的研究中作者發(fā)現(xiàn)M.hyorhinis表面的vlp家族參與介導(dǎo)支原體對(duì)細(xì)胞的黏附。vlp家族共有7個(gè)成員，M.hyorhinis可以僅表達(dá)一種或者同時(shí)表達(dá)多種vlp成員。根據(jù)文獻(xiàn)中vlp家族表達(dá)情況的報(bào)道，vlpA是較為常見(jiàn)的表達(dá)成員之一，作者對(duì)vlpA的具體黏附能力進(jìn)行了更加深入的研究。

vlpA的基因編碼區(qū)可分為三個(gè)部分，見(jiàn)圖1：Ⅰ區(qū)編碼30aa的高度同源的信號(hào)肽，末端為A/T-I-S-C四肽的前脂蛋白信號(hào)肽酶識(shí)別切割位點(diǎn)，前脂蛋白經(jīng)酶切割產(chǎn)生由N端Cys殘基連接脂質(zhì)基團(tuán)的脂蛋白產(chǎn)物，其脂質(zhì)基團(tuán)嵌入細(xì)胞膜中，將vlp蛋白部錨定于細(xì)胞表面；Ⅱ區(qū)編碼的主要為不帶電荷的氨基酸，序列中有一定的重復(fù)性，在vlp各成員之間也呈現(xiàn)一定同源性，特別是包含一段8 aa的公共肽段；Ⅲ區(qū)為編碼重復(fù)肽段，由長(zhǎng)12～13個(gè)氨基酸的肽段串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成，各個(gè)vlp的重復(fù)序列具有特異性，vlp重復(fù)序列基因的重復(fù)次數(shù)容易發(fā)生突變，導(dǎo)致vlp產(chǎn)物的大小發(fā)生變化[16]。

目前，牛支原體的表面可變脂蛋白(variable surface protein，vsp)已被證實(shí)為牛支原體的黏附因子。K.Sachse等證實(shí)了vsp參與牛支原體的細(xì)胞黏附過(guò)程，后來(lái)又進(jìn)一步鑒定出了vsp重復(fù)肽段區(qū)中與黏附有關(guān)的黏附位點(diǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些重復(fù)區(qū)也是vsp主要抗原位點(diǎn)所在[19-21]。由此，試驗(yàn)前作者推測(cè)vlpA的Ⅲ區(qū)重復(fù)片段中可能包含黏附位點(diǎn)。但從Ⅲ區(qū)重復(fù)片段多肽-KLH偶聯(lián)物對(duì)細(xì)胞的黏附試驗(yàn)結(jié)果可以看出，2段重復(fù)的Ⅲ區(qū)重復(fù)片段不能黏附細(xì)胞。而從僅含Ⅱ區(qū)的vlpA0蛋白的黏附試驗(yàn)結(jié)果可以看出Ⅱ區(qū)含有黏附位點(diǎn)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)Ⅲ區(qū)不同重復(fù)次數(shù)的系列vlpA重組蛋白的黏附試驗(yàn)結(jié)果比較，顯示重復(fù)次數(shù)越多對(duì)細(xì)胞的黏附能力下降。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，作者認(rèn)為有兩種可能：第一，vlpA分子的Ⅱ區(qū)為黏附功能區(qū)，而Ⅲ區(qū)不具有黏附位點(diǎn)，Ⅲ區(qū)可在空間位阻上一定程度地遮蔽Ⅱ區(qū)的黏附位點(diǎn)，所以出現(xiàn)了Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)越多，對(duì)細(xì)胞的黏附能力下降的結(jié)果。同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在肺支原體上，報(bào)道顯示當(dāng)肺支原體上的表面可變脂蛋白基因編碼重復(fù)區(qū)串聯(lián)重復(fù)次數(shù)為35或40時(shí)，其黏附細(xì)胞能力要小于串聯(lián)重復(fù)次數(shù)為3、4或5時(shí)[22]。第二，Ⅲ區(qū)有可能也具有黏附能力，但需要更多的重復(fù)次數(shù)才能體現(xiàn)。如豬肺炎支原體的黏附因子P97的R1重復(fù)區(qū)重復(fù)次數(shù)必須大于8次才具有黏附能力，重復(fù)數(shù)目越多，黏附能力越強(qiáng)[23，24]。本試驗(yàn)用于直接檢測(cè)Ⅲ區(qū)重復(fù)片段黏附能力的重復(fù)次數(shù)為2次，鑒定發(fā)現(xiàn)其不具有黏附能力，而后試驗(yàn)利用不同重復(fù)次數(shù)的VlpA0、3、6、9、12進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)重復(fù)次數(shù)越多黏附能力下降，在此并沒(méi)有單獨(dú)鑒定Ⅲ區(qū)的重復(fù)能力，而是鑒定整個(gè)分子的黏附能力，可能受到Ⅱ區(qū)的影響。同時(shí)本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的Ⅲ區(qū)最大重復(fù)次數(shù)為12次，Ⅲ區(qū)重復(fù)12次以上才具有黏附細(xì)胞功能的可能性也不能完全排除。

本研究證實(shí)了vlpA參與介導(dǎo)M.hyorhinis黏附宿主細(xì)胞，鑒定發(fā)現(xiàn)vlpAⅡ區(qū)中含有明顯的黏附位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)隨著Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)的增加，vlpA黏附細(xì)胞的能力明顯下降，該研究結(jié)果可有助于M.hyorhinis黏附因子的研究，也為進(jìn)一步研究M.hyorhinis感染及免疫逃逸機(jī)制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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(編輯白永平)

The Function of the Variable Lipoprotein A ofMycoplasmahyorhinisin Adherence to Host Cell

ZHANG Bi-xiong1，2，XIONG Qi-yan1*，WANG Jia1，JI Yan1，NI Bo1，WEI Yan-na1，F(xiàn)ENG Zhi-xin1，LIU Mao-jun1，SHAO Guo-qing1，3*

(1.InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，Nanjing210014，China；2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030800，China；3.JiangsuCollaborativeInnovationCenterforMeatProduction，ProcessingandQualityControl，Nanjing210095，China)

Mycoplasmahyorhinis(M.hyorhinis) is a swine pathogen that can cause multiple chronic inflammation including polyserositis，pneumonia，arthritis and otitis media.It is also a potential pathogen for human beings，associated with various human cancers.In previous study，vlp family has been revealed to play a role in mediating cytoadhesion ofM.hyorhinis.Herein，we furtherly studied the cytoadhesion function of vlpA，one of the vlp family member，particularly how the repeat time of repetitive unit impact the function.According to the sequence published on GenBank，thevlpAgene was amplified from bacterial genome.Furthermore，vlpAgenes containing 0，3，6，9 and 12 times of repetitive unit in region Ⅲ were artificially synthesized.The genes were inserted into pET-32a(+) and expressed inEscherichiacoli.At the same time，a peptide containing 2 times of repetitive unit in region Ⅲ was artificially synthesized.All the recombinant proteins，as well as the peptide were detected for their adherence to PK-15 cell by using the indirect immunofluorescence assay and microtiter plate adherence assay.All the recombinant proteins have been successfully induced for expression and purified by affinity chromatography.Adherence of vlpA to PK-15 cell was observed by the indirect immunofluorescence assay.vlpA0 could bind PK-15 cell in the microtiter plate adherence assay，but not the peptide containing 2 times of repetitive unit in region Ⅲ.Furthermore，we detected the adherence of recombinant proteins vlpA3，vlpA6，vlpA9，vlpA12 containing 3，6，9 and 12 times of repetitive unit in region Ⅲ by using the microtiter plate adherence assay，the results showed that all of the four recombinant proteins could adhere to the cell，but the adherence was lower than the recombinant protein vlpA0.Additionally，as the repeat times increased，the adherence significantly decreased.The results of this study suggest that vlpA is one of the adhesion factors ofM.hyorhinis.The region Ⅱof VlpA contains cytoadhesion site.The adhesion ability of the whole molecule significantly decreased as the times of repetitive unit in region Ⅲ increased.The results of this study laid the foundation for further study on the pathogenic mechanism ofM.hyorhinis.

M.hyorhinis；variable lipoprotein vlpA；cytoadhesion；the number of repeat times

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.019

2016-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31300155)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20130702)

張必雄(1989-)，男，湖北天門(mén)人，碩士生，主要從事免疫化學(xué)與分子免疫學(xué)研究，E-mail：zhangbixiongadc@163.com

邵國(guó)青，研究員，Tel:025-84391973，E-mail:gqshaojaas@163.com；熊祺琰，副研究員，Tel:025-84390880，E-mail:qiyanxiongnj@163.com

S852.62

A

0366-6964(2016)09-1897-08