乳酸鏈球菌素對(duì)大腸桿菌所致腹瀉小鼠的腦-腸軸中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

賈知鋒，王純潔*，敖日格樂(lè)，高瑞娟，巴森胡

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

?

乳酸鏈球菌素對(duì)大腸桿菌所致腹瀉小鼠的腦-腸軸中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

賈知鋒1，王純潔1*，敖日格樂(lè)2，高瑞娟1，巴森胡1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

旨在研究乳酸鏈球菌素(nisin)對(duì)應(yīng)激性腹瀉導(dǎo)致的腸道菌群與腦-腸軸功能之間的相關(guān)性，進(jìn)一步揭示nisin對(duì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)注入3種血清型大腸桿菌混合菌懸液(1∶1，1.0×109CFU·mL-1)制備小鼠腹瀉模型，并用nisin和蒙藥復(fù)方進(jìn)行治療；在造模后0、 72 h，ELISA檢測(cè)5-HT、DA和NE水平，以及平板涂布法將盲腸內(nèi)容物分別10倍稀釋成8個(gè)梯度涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基，計(jì)算菌落數(shù)。結(jié)果表明，(1)在腦組織中，造模后72 h時(shí)nisin、傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方、成分復(fù)方、抗生素組中5-HT分別升高到0 h時(shí)的108.60%、124.04%、117.47%、115.57%；并且使十二指腸中5-HT分別增加到0 h時(shí)的289.18%、200.30%、271.59%，nisin組顯著高于其他各組(P<0.05)；造模后除空腸外，72 h與0 h相比，nisin和傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方對(duì)小鼠血清、腦、十二指腸、回腸以及結(jié)腸中5-HT都有顯著提升作用(P<0.05)；(2)造模后72 h時(shí)，nisin、蒙藥復(fù)方、成分復(fù)方及抗生素可提高正常小鼠腦、腸中多巴胺，并以回腸中增加最多，且差異顯著(P<0.05)；(3)在腦組織中0 h與72 h時(shí)NE的濃度，傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方、nisin分別升高到115.62%和106.17%，且均與空白、陰性對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；在十二指腸、回腸中，nisin組72 h比0 h升高了170.97%、121.74%，尤其十二指腸明顯高于其他各組且差異顯著(P<0.05)；(4)nisin、有效成分復(fù)方和傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方可顯著提高感染E.coli小鼠腸道內(nèi)有益菌乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量，顯著降低有害菌腸桿菌和腸球菌數(shù)量(P<0.05)?？梢?jiàn)，nisin和蒙藥復(fù)方均顯著提高細(xì)菌感染小鼠血液、腦和各腸段中5-HT、NE含量，尤以十二指腸突出，nisin和傳統(tǒng)蒙藥能打破腸道中5-HT的平衡，并伴隨著腸道各段、血液中5-HT的升高腦組織中5-HT含量也增加。

nisin；傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方；神經(jīng)遞質(zhì)；應(yīng)激性腹瀉；腸道菌群；腦-腸軸

腸道菌群與人類的行為、情緒以及疾病(如抑郁癥、阿爾茨海默病、帕金森癥等)有著奇妙關(guān)聯(lián)，通過(guò)攝入一些益生菌可在一定程度上改善情緒，從而改變腸道微生物環(huán)境達(dá)到治療部分心理疾病作用[1]。人體腸道中定植了大量的細(xì)菌，可達(dá)到人體基因總數(shù)的150倍，另外，腸黏膜生物屏障是一個(gè)由腸道內(nèi)的有益菌和宿主的三維空間結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成的微生態(tài)系統(tǒng)，當(dāng)其被破壞時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致致病菌(如：大腸桿菌等)的入侵和定植[2]。研究發(fā)現(xiàn)，胃腸道不僅受大腦的調(diào)控，而且還反作用于大腦，并且腸道菌群還參與人體諸多生理功能和疾病等相關(guān)活動(dòng)[3]。隨著對(duì)腹瀉型IBS患者血漿中5-HT研究的不斷深入，腸嗜鉻細(xì)胞釋放5-HT逐漸增加[4]。同時(shí)，B.Isgar等[5]認(rèn)為，5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)在功能性胃腸道疾病中扮演著重要的角色，5-HT異?？捎绊懳改c道動(dòng)力以及功能性異常和內(nèi)臟高敏感性。另一方面，腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可顯著增加5-HT分泌，并且使結(jié)腸收縮增強(qiáng)，腸道動(dòng)力增加[6]。目前，在臨床上對(duì)細(xì)菌性腹瀉普遍采用抗生素治療，然而長(zhǎng)期濫用抗生素產(chǎn)生的殘留、耐藥性和降低家畜免疫力等問(wèn)題備受關(guān)注[7]。因此，人們開(kāi)始尋求一種新型、環(huán)保并用于替代抗生素的新產(chǎn)品。而乳酸鏈球菌素(nisin)屬乳酸乳球菌乳酸亞種，通過(guò)發(fā)酵經(jīng)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一種多肽抗菌類物質(zhì)、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物，其作為一種天然殺菌物質(zhì)具有高效無(wú)毒副作用、能耐高溫、無(wú)殘留、不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)[7]。在1988年nisin首次用于食品添加劑，并得到FDA的認(rèn)可，從而促進(jìn)了人們對(duì)細(xì)菌素這類綠色環(huán)保型產(chǎn)品在其畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用[8]。據(jù)研究，nisin的肽聚糖前體分子在結(jié)合脂質(zhì)Ⅱ時(shí)，nisin嵌入到細(xì)胞膜中，導(dǎo)致膜快速去極化和細(xì)菌細(xì)胞死亡，nisin的抗菌活性通過(guò)不同的結(jié)構(gòu)域活性的雙重作用來(lái)抑制和干擾細(xì)胞壁的生物合成[9]。據(jù)A.M.Brand等[10]研究表明，使用單劑量的乳酸鏈球菌素可以抑制小鼠腹腔內(nèi)葡萄球菌(1×108CFU·mL-1)的代謝活動(dòng)，其抑菌機(jī)制是通過(guò)蛋白水解酶降解乳酸鏈球菌素在小鼠腹腔內(nèi)起到抗菌作用，并作用于細(xì)菌細(xì)胞壁引起的免疫反應(yīng)。本研究通過(guò)大腸桿菌建立小鼠腹瀉模型，并探索nisin對(duì)細(xì)菌性腹瀉小鼠血清、腦-腸中5-HT、DA、NE的影響和機(jī)體應(yīng)激時(shí)相關(guān)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的相關(guān)性以及機(jī)體內(nèi)益生菌對(duì)致病菌的定植拮抗作用。為今后用nisin調(diào)節(jié)腦中5-HT、DA、NE來(lái)治療與之相關(guān)的腦神經(jīng)疾病提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄各半，體重20 g±2 g(內(nèi)蒙醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.1.2受試菌3種血清型牛源致病性大腸桿菌分別為O14、O2、O8，使用前將斜面保存的3種血清型Escherichiacoli分別接種于肉湯中，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期18～24 h，調(diào)整混合指示菌為1×109CFU· mL-1；鹽酸環(huán)丙沙星(廣州白云山制藥股份有限公司)；ELISA試劑盒(購(gòu)自北京誠(chéng)林生物科技有限公司)。細(xì)菌素(nisin)配成0.1 mg·mL-1[6]，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牛生產(chǎn)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取保存。成分復(fù)方制備：茜草素0.34 mg/20 g、大黃素0.8 mg/20 g、大黃酸4.8 mg/20 g等(西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司)等劑量[11]，均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牛生產(chǎn)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。蒙藥復(fù)方的制備：稱取茜草、草烏葉、黑云香、多葉棘豆等，制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]，蒙藥復(fù)方藥物均購(gòu)自內(nèi)蒙古呼和浩特市京遠(yuǎn)大藥房。

1.2試驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀(Synergy HT，上海迭戈生物科技有限公司)；Multifuge XIR離心機(jī)(美國(guó)Thermo Heraeus公司)等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1試驗(yàn)分組給與給藥方案每組10只小鼠，詳細(xì)處理見(jiàn)表1。

表1Nisin及其有效成分復(fù)方對(duì)小鼠腹瀉病模型的治療方案(n=10)

Table 1Effect of nisin and Mongolian Compound of active efficiency ingredient for the calf disease model mice (n=10)

組別Groups給藥方案Administrationgroups乳酸鏈球菌素組Nisingroup灌服0.1mg·mL-1,連續(xù)7d,2次/d,每次0.3mL,第5天腹腔注射80%MLD的混合菌懸液0.3mL·只-1,繼續(xù)給藥3d蒙藥有效成分復(fù)方Activeingredientcompound灌服“巴布-7”有效成分復(fù)方0.5g·kg-1,同上傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方Mongolianmedicinecompound灌服傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方0.5g·kg-1,同上抗生素組Antibioticgroup灌服環(huán)丙沙星0.13g·kg-1,如上注菌陰性對(duì)照組Controlgroup灌服生理鹽水20g·kg-1,同上空白對(duì)照Blankcontrolgroup不做任何處理

以上復(fù)方粉劑及環(huán)丙沙星每次配合蒸餾水灌服，單只動(dòng)物單次所用藥量需用0.3 mL蒸餾水配合灌服

Above compound powder and ciprofloxacin each with distilled water gavage，in a single animal single used single dosage required 0.3 mL of distilled water with gavage

1.3.2nisin對(duì)小鼠腦-腸中5-HT、DA及NE神經(jīng)遞質(zhì)含量的檢測(cè)給藥方案同表1，于灌藥第5、7天，分別作為0 h和72 h，將分別取其小鼠腦、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸制備組織勻漿，收集上清液，分離血清，-20 ℃保存，按照5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)及去甲腎上腺素(NE)ELISA試劑盒說(shuō)明操作(購(gòu)于上海寶曼生物科技有限公司)。

1.3.3nisin對(duì)小鼠盲腸微生物影響給藥方案同表1，連續(xù)給藥7 d，末次給藥2 h后，將每組小鼠頸部脫臼之后(在無(wú)菌操作臺(tái)上)，對(duì)小鼠消毒，打開(kāi)腹腔。接著取出全部盲腸，置于無(wú)菌瓶中。將盲腸內(nèi)容物分別10倍稀釋8個(gè)梯度，即為原液的101～108倍，分別吸取 50 μL涂布于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(MRS)、雙歧桿菌培養(yǎng)基(BBL)、腸球菌選擇性培養(yǎng)基(EF)上，按不同的培養(yǎng)所需要的條件，分別檢測(cè)E.coli、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌數(shù)量，每個(gè)稀釋度做三個(gè)重復(fù)，待菌落長(zhǎng)出，選適合的稀釋度計(jì)數(shù)菌落數(shù)(同稀釋度平均菌落數(shù)為X)，菌群數(shù)量用1 g CFU·g-1盲腸內(nèi)容物表示，計(jì)算公式：菌落數(shù)量(1 g CFU·g-1)=lg[X/0.5×稀釋倍數(shù)/盲腸內(nèi)容物質(zhì)量(g)][13]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2　結(jié)　果

2.1動(dòng)物腹瀉觀察

觀察小鼠模型0 h 時(shí)，各試驗(yàn)組中小鼠無(wú)明顯的臨床癥狀變化，采食和飲水均正常。對(duì)照組小鼠注菌后其臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉、被毛聳立、精神沉郁、瞇眼、嗜睡、行為遲鈍、食欲不振，有的小鼠出現(xiàn)死亡，解剖死亡小鼠后發(fā)現(xiàn)其腸管腔內(nèi)充滿黃色不明物，然后在EMB和甘露醇平板上劃線，經(jīng)革蘭染色、形態(tài)觀察和生化鑒定菌符合E.coli菌株[14]。然而，72 h時(shí)，陰性對(duì)照組表現(xiàn)為，體重下降，且出現(xiàn)死亡小鼠增加，昏睡、呼吸急促、厭食。而nisin、有效成分復(fù)方組小鼠癥狀逐漸減輕。

2.2血清及組織5-HT、DA、NE含量的變化

小鼠血清及組織5-HT、DA、NE含量的變化見(jiàn)表2 。

2.2.1nisin對(duì)小鼠腦-腸中5-HT的影響由表2可知，小鼠腹腔注射0.3 mL 1.0×109CFU·mL-1混合大腸桿菌后，在血清中72 h時(shí)，成分復(fù)方、nisin、蒙藥復(fù)方及抗生組中5-HT的量明顯增加，且均顯著高于0 h(P<0.05)，小鼠血清中5-HT濃度，同時(shí)間點(diǎn)各組間比較：0 h時(shí)，蒙藥復(fù)方和抗生素組顯著高、成分復(fù)方組顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)；72 h時(shí)，nisin組和其他各用藥組顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，而這4個(gè)用藥組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。十二指腸中，72 h時(shí)nisin組、蒙藥成分復(fù)方及蒙藥復(fù)方組的5-HT分別增加到0 h時(shí)的289.18%、271.59%、200.30%，nisin組與其他各組相比差異顯著(P<0.05)，nisin和蒙藥復(fù)方對(duì)于細(xì)菌感染小鼠的腦和各腸段中的5-HT的含量顯著提高，尤其nisin對(duì)十二指腸中5-HT的提高突出(P<0.05)；空腸中，72 h時(shí)蒙藥成分復(fù)方、nisin組使5-HT分別增加到0 h時(shí)的249.54%、134.34%；回腸中蒙藥有效成分復(fù)方對(duì)5-HT的含量增加到0 h時(shí)的204.80%；結(jié)腸中，蒙藥有效成分復(fù)方對(duì)5-HT的含量增加到0 h時(shí)的149.31%，而nisin對(duì)結(jié)腸中5-HT增加到0 h時(shí)的161.43%，兩者之間nisin優(yōu)于蒙藥有效成分復(fù)方組，且nisin組之間差異顯著(P<0.05)。

表2nisin及其蒙藥有效成分復(fù)方對(duì)小鼠腹瀉病血清中5-HT、DA、NE的影響

Table 2 Effect of nisin and Mongolian medicine active ingredient compounds on the 5-HT，DA，NE in mice with diarrhea ng·L-1

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

表2(續(xù))Continued

大寫(xiě)字母不同表示同列(0 h vs 72 h)間差異顯著(P<0.05)，小寫(xiě)字母不同表示同行差異顯著(P<0.05)

Different capital letters means significant difference within the same column between 0 h and 72 h (P<0.05)，however different lowercase capital letters mean significant within the same peer

2.2.2nisin對(duì)小鼠腦-腸中NE的影響由表2知，72 h時(shí)，小鼠血清中NE濃度，不同時(shí)間點(diǎn)各組之間比較傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方、nisin、抗生素及蒙藥有效成分復(fù)方組分別提高到0 h時(shí)的129.17%、122.86%、110.23%、105.95%，且除蒙藥有效成分復(fù)方組外，其他各用藥組0 h與72 h之間差異顯著(P<0.05)。由0 h到72 h，在十二指腸中NE濃度，傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方、nisin、蒙藥有效成分復(fù)方及抗生素243.59%、170.97%、114.86%、97.83%；且0 h時(shí)，蒙藥有效成分復(fù)方與其他各用藥組差異顯著(P<0.05)，nisin組與抗生素組相當(dāng)；然而，72 h時(shí)，nisin組明顯高于其他各用藥組且差異顯著(P<0.05)；在空腸中72 h時(shí)，nisin和傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方中NE的濃度明顯降低并低于其他各用藥組；在回腸中，傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方、nisin、蒙藥有效成分復(fù)方及抗生素中NE的濃度分別升高了130.88%、121.74%、102.47%、92.59%，傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方和nisin組仍然比對(duì)照組高26.77%和17.63%；在72 h結(jié)腸中，nisin組對(duì)NE的濃度的影響明顯，72 h時(shí)與傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方相當(dāng)，且均與其他組差異顯著(P<0.05)；在腦組織中72 h時(shí)，傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方、nisin分別升高到129.17%和122.86%，與對(duì)照相比升高了31.87%和25.56%，且均與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

2.2.3nisin對(duì)小鼠腦-腸中DA的影響由表2知，小鼠血清中成分復(fù)方組、蒙藥復(fù)方、nisin及抗生素對(duì)DA增加量，72 h時(shí)，分別為0 h時(shí)的260.34%、241.84%、234.42%、239.08%，且與0 h差異顯著(P<0.05)，然而各用藥組間差異不顯著(P>0.05)。由0 h到72 h，各用藥組顯著提高大腸桿菌感染小鼠腦組織中多巴胺含量，且蒙藥復(fù)方組顯著低于抗生素組(P<0.05)，在72 h時(shí)，蒙藥復(fù)方組、抗生素組、nisin及成分復(fù)方提高小鼠十二指腸中多巴胺的含量分別為965.67%、700.26%、692.11%、490.67%，且與陰性組相比差異顯著(P<0.05)；nisin對(duì)回腸和空腸中多巴胺提升了4864%和484.40%，而抗生素也提升了139.22%和131.57%；蒙藥復(fù)方、成分復(fù)方、nisin及抗生素可提高正常小鼠腦中多巴胺，并以回腸中增加最多(P<0.05)。

2.3蒙藥復(fù)方及其有效成分復(fù)方對(duì)小鼠盲腸微生物影響

由表3可知，小鼠盲腸中大腸桿菌數(shù)量，陰性對(duì)照組顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，nisin組、傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方組、蒙藥有效成分復(fù)方組顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)，其三者組之間差異不顯著(P>0.05)、抗生素組顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，但其余組與空白對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；腸球菌數(shù)量，各用藥組和空白對(duì)照組顯著低于生理鹽水組(P<0.05)，蒙藥有效成分復(fù)方組、傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方組之間均差異不顯著(P>0.05)，nisin組顯著高于抗生素組和蒙藥有效成分復(fù)方組(P<0.05)，但與傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方組差異不顯著(P>0.05)；乳酸桿菌數(shù)量，各用藥組和空白對(duì)照組均顯著高于生理鹽水組(P<0.05)，蒙藥有效成分復(fù)方組顯著高于傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方組(P<0.05)，但顯著低于抗生素組(P<0.05)；雙歧桿菌數(shù)量，傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方組、nisin組顯著低于抗生素組、蒙藥有效成分復(fù)方組和空白對(duì)照組顯著(P<0.05)，但顯著高于生理鹽水組(P<0.05)，蒙藥有效成分復(fù)方組顯著高于傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方組、nisin組和生理鹽水組(P<0.05)，但顯著低于抗生素照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，抗生素組顯著高于傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方組、nisin組、蒙藥有效成分復(fù)方組和生理鹽水組(P<0.05)，但顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。

表3蒙藥復(fù)方及其有效成分復(fù)方對(duì)小鼠盲腸微生物的影響

Table 3Effect of Mongolian compound and its active ingredients on caecal microflora in mice

組別Group大腸桿菌E.coli腸球菌Enterococcus乳酸桿菌Lactobacillus雙歧桿菌Bifidobacte空白對(duì)照組Blankcontrolgroup6.95±0.15b6.62±0.30b6.26±0.15bc11.08±0.44a陰性對(duì)照組Negativecontrolgroup8.59±0.53a7.17±0.06a5.94±0.07d8.83±0.08e抗生素組Antibioticgroup6.49±0.08c5.49±0.16d6.82±0.11a10.47±0.25b蒙藥有效成分復(fù)方Activeingredientcompound6.66±0.21bc5.66±0.24d6.39±0.14b9.73±0.10c傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方Mongolianmedicinecompound6.80±0.08bc5.73±0.11cd6.15±0.18c9.25±0.09d乳酸鏈球菌素Nisingroup6.57±0.11bc5.83±0.12bc6.35±0.06bc9.21±0.07d

肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異無(wú)顯著(P>0.05)

Values with different letter superscripts mean significant difference(P<0.05)，while with the same letter superscripts mean no significant difference(P>0.05)

3　討　論

據(jù)研究表明，5-HT可使大多數(shù)交感節(jié)前神經(jīng)元興奮，然而使副交感節(jié)前神經(jīng)元抑制；損壞動(dòng)物的中縫核或使用藥物阻止5-HT的合成，都可使腦組織中5-HT的含量明顯降低，從而引起動(dòng)物睡眠障礙和嗎啡的陣痛作用減弱乃至消失[15]。用外界電刺激大鼠的中縫核能導(dǎo)致大鼠體表溫度升高，腦內(nèi)5-HT更新加速，并且用來(lái)治療抑郁癥患者能夠調(diào)節(jié)亢進(jìn)的腎上腺HPA軸功能，這些現(xiàn)象解釋了腦組織中5-HT與睡眠、陣痛及體表溫度的調(diào)節(jié)有著緊密的關(guān)系，同時(shí)，5-HT能改變垂體的內(nèi)分泌機(jī)制，而破壞5-羥色胺使神經(jīng)元出現(xiàn)幻覺(jué)，因此，5-HT可能和精神疾病或者精神活動(dòng)存在一定的相關(guān)性[16]。B.Isgar等[5]認(rèn)為，炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制是由于腸功能性因素，5-HT系統(tǒng)在功能性胃腸道疾病中扮演著重要的角色，5-HT異?？捎绊懳改c道動(dòng)力以及功能性異常和內(nèi)臟高敏感性。研究表明，應(yīng)激腹瀉可以興奮腸道交感神經(jīng)系統(tǒng)，刺激NE的釋放，從而作用于主要合成5-HT的細(xì)胞腸嗜鉻細(xì)胞，在綜合征便秘型結(jié)腸黏膜中5-羥色胺的含量高于健康人和腹瀉型腸應(yīng)激綜合征患者[17]。通過(guò)本試驗(yàn)，傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方、蒙藥有效成分復(fù)方、抗生組及nisin對(duì)腦組織中5-HT分別增加了124.04%、117.47%、115.57%、108.60%，且蒙藥復(fù)方也能打破腸道中5-HT的平衡，然而隨著腦組織中5-HT的升高伴隨著腸道各段中5-HT的含量也增加，蒙藥復(fù)方對(duì)其作用有可能是作用于腸道，從而影響腦組織5-HT的含量，然而這兩者之間的生物學(xué)意義還尚不清楚。

試驗(yàn)中，蒙藥復(fù)方能提高正常小鼠血液、十二指腸中的5-HT的含量，細(xì)菌素能提高正常小鼠十二指腸、結(jié)腸中的5-HT的含量、卻降低空腸中含量，對(duì)其腦組織中的5-HT的含量無(wú)顯著影響；但是，nisin和蒙藥復(fù)方對(duì)于細(xì)菌感染小鼠的血液、腦和各腸段中的5-HT的含量卻有提高作用，尤其對(duì)十二指腸中5-HT的提高明顯。與陰性對(duì)照組相比，蒙藥復(fù)方能打破腸道中5-HT的平衡，并且隨著血液、腦組織中5-HT的升高伴隨著腸道各段中5-HT的含量也增加。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，nisin組能提高十二指腸中NE的濃度且均與其他用藥組差異顯著，然而nisin組對(duì)空腸無(wú)提高作用；在72 h回腸中相對(duì)于對(duì)照組提高了17.63%；在72 h結(jié)腸中(除傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方外)nisin組均高于其他組且差異顯著；在腦組織中72 h時(shí)，傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方、nisin分別升高到129.17%和122.86%，與對(duì)照相比升高了31.87%和25.56%，且均與對(duì)照組差異顯著。

多巴胺(DA)是去甲腎上腺素的前體，其主要作用于多巴胺受體。多巴胺可以提高感染性休克患者心率失常的概率[7]。M.Argalious等[18]認(rèn)為，多巴胺是房顫發(fā)生的獨(dú)立因素。N.Rasheed等[19]認(rèn)為，多巴胺能系統(tǒng)失調(diào)與抑郁癥有著密切地聯(lián)系，多巴胺降低可改善小鼠絕望但是不影響其正常探究活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)灌注多巴胺D1受體能降低前額葉細(xì)胞外的谷氨酸及γ-氨基丁酸的含量，若在刺激前給予D1受體拮抗劑可提高抗抑郁藥的抗抑作用。 本試驗(yàn)表明，蒙藥復(fù)方組和成分復(fù)方提高大腸桿菌感染小鼠十二指腸中多巴胺的含量分別為965.67%和490.67%，并均高于抗生素組，且與陰對(duì)照性組相比差異顯著；蒙藥復(fù)方對(duì)結(jié)腸多巴胺提升了146.84%，而抗生素也提升了142.54%，說(shuō)明在多巴胺的效果更優(yōu)于抗生素組。蒙藥復(fù)方、成分復(fù)方、乳酸鏈球菌素及抗生素可提高正常小鼠血液、腦中多巴胺，卻可降低腸中的含量，并以回腸中降低最多，可達(dá)到顯著，多巴胺有可能由回腸經(jīng)血液到達(dá)腦。

腸道菌群系指動(dòng)物或人腸道內(nèi)存在的大量細(xì)菌，其主要包括厚壁菌、擬桿菌、放線菌以及變形桿菌組成，正常的菌群結(jié)構(gòu)是調(diào)節(jié)人體代謝、泌尿和免疫等功能，菌群紊亂則導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如人腸應(yīng)激綜合征(IBS)、小鼠腹瀉病、糖尿病等[20]。人腸綜合征患者接受益生菌和抗菌藥物的治療后可以緩解內(nèi)臟敏感性，改善腸道菌群關(guān)系。據(jù)A.Agrawal等[21]報(bào)道，便秘型IBS患者接受益生菌治療后，可促進(jìn)5-HT分泌增多，增強(qiáng)和加快結(jié)腸的收縮和傳輸速度，改善腸道動(dòng)力，也是保障機(jī)體健康的必要條件。大腸桿菌和腸球菌是腸道的條件致病菌，雙歧桿菌、乳酸桿菌是腸道的有益菌，它們數(shù)量的變化是腸道健康的重要指標(biāo)[22]。目前，研究發(fā)現(xiàn)，自閉癥兒童的腸道中糞球菌、普雷沃菌等菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)的改變[23]。試驗(yàn)表明：對(duì)小鼠腹腔注射致病性E.coli后可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，采用有效成分復(fù)方、傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方和細(xì)菌素進(jìn)行治療后可顯著改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。其中有效成分復(fù)方可顯著提高感染E.coli小鼠腸道內(nèi)有益菌(即乳酸菌和雙歧桿菌)數(shù)量，顯著降低有害菌(腸桿菌和腸球菌)數(shù)量。

Nisin、有效成分復(fù)方、傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方顯著提高腦、腸、血清中5-HT、DA、NE，有可能有利于改善抑郁癥時(shí)NE、5-HT的減少，改善老年性癡呆(SD)患者認(rèn)知障礙和血漿單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素、多巴胺和5-HT水平下降，改善帕金森病時(shí)多巴胺合成減少[24]。

4　結(jié)　論

Nisin和蒙藥復(fù)方均顯著提高E.coli感染小鼠血液、腦和各腸段中5-HT、DA、NE含量，尤以十二指腸突出；同時(shí)還增加盲腸有益菌數(shù)量、減少致病性有害菌數(shù)量。

[1]XU D，GAO J，GILLILLAND M Ⅲ，et al.Rifaximin alters intestinal bacteria and prevents stress-induced gut inflammation and visceral hyperalgesia in rats[J].Gastroenterology，2014，146(2)：484-496.

[2]QIN J，LI R，RAES J，et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature，2010，464(7285)：59-65.

[3]HSIAO EY，MCBRIDE SW，HSIEN S，et al.Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopment disorders[J].Cell，2013，155(7)：1451-1463.

[4]HOUGHTON L A，ATKINSON W，WHITAKER R P，et al.Increased platelet depleted plasma 5-hydroxytryptamine concentration following meal ingestion in symptomatic female subjects with diarrhoea predominant irritable bowel syndrome[J].Gut，2003，52(5)：663-670.

[5]ISGAR B，HARMAN M，KAYE M D，et al.Symptoms of irritable bowel syndrome in ulcerative colitis in remission[J].Gut，1983，24：190-192.

[6]AGRAWAL A，HOUGHTON L A，MORRIS J，et al.Clinical trial：the effects of a fermented milk product containingBifidobacteriumlactisDN-173 010 on abdominal syndrome with constipation[J].AlimentPharmacolTher，2009，29(1)：104-114.

[7]ESLAMI M，BOLOURCHI M，SEIFI H A，et al.Treatment of clinical endometritis in dairy cows by previously used controlled internal drug release devices[J].Theriogenology， 2015，84(3)：437-445.

[8]SINGH A P，PRABHA V，RISHI P.Value addition in the efficacy of conventional antibiotics by nisin againstsalmonella[J].PLoSOne，2013，8(10)：e76844.

[9]CAMPION A，CASEY P G，F(xiàn)IELDL D，et al.In vivo activity of nisin A and nisin V against listeria monocytogenes in mice[J].BMCMicrobiol，2013，13(1)：81-102.

[10]BRAND A M，KWAADSTENIET D M，DICKS L M.The ability of nisin F to controlStaphylococcusaureus in the peritoncal cavity，as studied in mice[J].LettApplMicroboil，2010，51(6)：645-649.

[11]OVERGAARD CB，DZAVIK V.Inotropes and vasopressors：review of physiology and clinical use in cardiovascular disease[J].Circulation，2008，118(10)：1047-1056.

[12]楊斯琴，敖日格樂(lè)，王純潔，等.蒙藥對(duì)牛源致病性大腸桿菌的體外抑菌效果研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，20(1)：124-128.

YANG S Q，AO-RI-GE-LE，WANG C J，et al.Antibacterial effects of Mongolian medicines on bovine pathogenicEscherichiacoliinvitro[J].JournalofChinaAgriculturalUniversity，2015，20(1)：124-128.(in Chinese)

[13]王斌，李京京，李秋榮，等.乳桿菌對(duì)致病性大腸桿菌感染小鼠腸黏膜屏障功能的影響[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)，2007，14(6)：321-325.

WANG B，LI J J，LI Q R，et al.Effect of lactobacillus in the intestinal barrier function on enteropathogenic Escherichia coli in fected mice[J].Parenteral&EnteralNutrition，2007，14(6)：321-325.(in Chinese)

[14]GHEBREMEDHIN B，LAYER F，K?NIGET W，et al.Genetic classification and distinguishing ofStaphylococcusspecies based on different partial gap，16srRNA，hsp60，rpoB，sodA，and tuf gene sequences[J].JClinMicrobiol，2008，46(3)：1019-1025.

[15]李訓(xùn)軍，嚴(yán)家川，潘峰，等.REM睡眠剝奪對(duì)大鼠額葉皮質(zhì)5-HT的含量及學(xué)習(xí)記憶的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，10：1151-1152.

LI X J，YAN J C，PAN F，et al.Effects of REM sleep deprivation on cognitive function and content of 5-HT in rat frontal cortex[J].ChongqingMedicine，2009，10：1151-1152.(in Chinese)

[16]陳沖，閆麗萍，王敏丹，等.不同頻率電針“解郁方”對(duì)抑郁大鼠海馬內(nèi)5-HT和血清ACTH含量的影響[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014(6)：23-24.

CHEN C，YAN L P，WANG M D，et al.“Jieyu” formula electric acupuncture of different frequencies on contents of 5-HT in hippocamp and ACTH in serum of depression rats[J].JournalofShanxiCollegeofTraditionalChineseMedicine，2014(6)：23-24.(in Chinese)

[17]MIWA J，ECHIZEN H，MATSUEDA K，et al.Patients with constipation-predominant irritable bowelsyndrome (IBS)may have elevated serotonin concentrations in colonic mucosa as compared bowel habits[J].Digestion，2001，63(3)：188-194.

[18]ARGALIOUS M，MOTTA P，KHANDWALA F，et al.“Renal dose” dopamine is associated with the risk of new-onset atrial fibrillation after cardiac surgery[J].CritCareMed，2005，33(6)：1327-1332.

[19]RASHEED N，AHMAD A，PANDEY CP，et al.Differential response of central dopaminergic system in acute and chronic unpredictablestress models in rats[J].NeurochemRes，2010，35(1)：22-32.

[21]AGRAWAL A，HOUGHTON LA，MRRIS J，et al.Clinical trial：the effects of a fermented milk product containing Bifidobacterium lactis DN-173 010 on abdominal distension and gastrointestinal transit in irritable bowel syndrome with constipation[J].AlimentPharmacolTher，2009，29(1)：104-114.

[22]陳玉潔.酸馬奶源酵母菌代謝物對(duì)致病性大腸桿菌的抑菌作用機(jī)理研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015 ：87.

CHEN Y J.Study of antibacterial mechanism of yeasts metabolites from Koumiss on pathogenicEscherichiacoli[D].Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2015：87.(in Chinese)

[23]KANG D W，PARK J G，ILHAN Z E，et al.Reduced incidence of Prevotella and other fermenters in intestinal microflora of autistic children[J].PLoSOne，2013，8(7)：e68322.

[24]宋景貴，張寧，穆俊林，等.老年性癡呆患者認(rèn)知功能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010(1)：54-56.

SONG J G，ZHANG N，MU J L，et al.Relationship between cognition and the plasma levels of monoamine neurotransmitters of senile dementia patients[J].JournalofZhengzhouUniversity(MedicalSciences)，2010(1)：54-56.(in Chinese)

(編輯白永平)

Effect of Nisin on Monoamine Neurotransmitters of Mice with Diarrhea Induced byEscherichiacoli

JIA Zhi-feng1，WANG Chun-jie1*，AO-Ri-ge-le1，GAO Rui-juan1，BA Sen-hu1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China；2.Collegeofanimalscience，InnerMongoliaAgriculturalUniversity，Hohhot010018，China)

The paper aims to study the correlation betweenStreptococcusthermophilusand intestinal flora and brain-gut axis function during diarrhea irritable，and further reveals the regulation mechanism of nisin on monoamine neurotransmitters.By injecting three serotypes ofEscherichiacolimixed bacterium suspension liquid (1∶1，1.0×109CFU· mL-1),the diarrhea model of mice was prepared，and nisin and Mongolian medicine were used for treatment.Tissus samples were collected at 0 h，72 h post modeling and ELISA kits were used to detect the levels of 5-HT，DA and NE，as well as the caecum contents plate were diluted 10 fold into eight gradient coating on the responging medium to calculate bacterial colony number by using plat coating method.The results showed that：(1)In brain tissue,5-HT level at 72 h post modeling in the nisin，traditional Mongolian medicine(TMM) compound，TMM ingredients，and antibiotic groups were increased to 108.60%，124.04%，117.47%，115.57% of 0 h， respectively; and the duodenal 5-HT in the nisin， TMM compound and TMM ingredients groups at 72 h post modeling were increased to 289.18%，200.30%，271.59% of 0 h,respectively，nisin group was significantly higher than other groups (P<0.05).After modeling，in addition to the jejunum，compared 72 h’s with 0 h’s，nisin and TMM compound have signicantly improved 5-HT level (P<0.05) in mice serum，brain，duodenum，ileum and colon.(2) After 72 h，nisin，TMM compound，TMM ingredients and antibiotic can improve the dopamine in the intestine and brain of normal mice,and that in the ileum increased the most，and the difference was significant (P<0.05).(3)In brain tissue at 0 h and 72 h, NE concentration increased to 115.62% and 106.17%，respectively under the react of TMM compound and nisin,and which also have significant difference comparing with blank control，and the negative control group (P<0.05)；in the duodenum and ileum，the EN concentration of nisin group at by 72 h were increased by 170.97%，121.74%，especially that in the duodenum was higher than other groups and the difference was significant (P<0.05).(4) Nisin，TMM effective ingredients and TMM compound can significantly increase the number of intestinal probioticLactobacillusandBifidobacteriuminE.coliinfected mice，and significantly reduce the number of harmful bacteriaEnterobacterandEnterococcus(P<0.05).In addition，nisin and TMM compound were significantly increased bacterial infections in mice blood，brain and various intestinal segments in 5-HT，NE content，especially in the duodenum，nisin and traditional Mongolian medicine can break the balance of intestinal 5-HT，and accompanied by increase of 5-HT in the intestine and blood,the brain 5-HT content also increased.

nisin；Mongolian medicine；neurotransmitter；stress-diarrhea；intestinal flora

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.023

2016-05-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260590)，國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2015BAD29B06)

賈知鋒(1989-)，男，四川省巴中市人，碩士研究生，主要從事蒙獸藥的抗炎免疫，Tel:18847161462，E-mail: sicau2016_1@163.com

王純潔，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物生理調(diào)控機(jī)制研究，E-mail:chunjiewang200@sohu.com

S852

A

0366-6964(2016)09-1931-09