熱應(yīng)激狀態(tài)下牛血清生化指標(biāo)、miRNA表達(dá)變化及其相關(guān)性分析

胡　煜，蔡明成，王　玲，譚　林，畢　武，張佳卉，左福元*

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科學(xué)系，榮昌 402460；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種研究所，溫江 611130 )

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熱應(yīng)激狀態(tài)下牛血清生化指標(biāo)、miRNA表達(dá)變化及其相關(guān)性分析

胡煜1，蔡明成2，王玲1，譚林1，畢武1，張佳卉1，左福元1*

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科學(xué)系，榮昌 402460；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種研究所，溫江 611130 )

本研究旨在探索熱應(yīng)激對牛miRNA表達(dá)量和血清生化指標(biāo)的影響及其相互關(guān)系，篩選牛血清中與熱應(yīng)激相關(guān)的調(diào)控因子。選擇20頭體況相近、飼養(yǎng)管理一致的紅安格斯公牛，分別于熱應(yīng)激期和非熱應(yīng)激期采集血樣，進(jìn)行血清生化指標(biāo)及miRNA表達(dá)量的測定。結(jié)果表明，與非熱應(yīng)激期相比，熱應(yīng)激下血清Cl-濃度、LDH活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量極顯著升高(P<0.01)；T-AOC活性、GSH-Px活性、IgA含量、 IgG含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性、IL-2含量極顯著降低(P<0.01)。對血清miRNA定量分析發(fā)現(xiàn)，miR-181a、miR-486表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，分別與IgA、IL-2含量均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，分別與IgG含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。而miR-1246表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)，與MDA含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。綜上表明，miR-1246、miR-181a、miR-486在機(jī)體熱應(yīng)激狀態(tài)下參與了調(diào)控免疫應(yīng)答及抗氧化等方面的作用，可作為肉?？篃釕?yīng)激的分子標(biāo)記。

熱應(yīng)激；miRNA；血清生化指標(biāo)；相關(guān)性

熱應(yīng)激是外界環(huán)境溫度超過等熱范圍，物理調(diào)節(jié)不能維持機(jī)體熱平衡，機(jī)體散熱受阻，體溫升高而引起的非特異性防御反應(yīng)和特異性障礙在內(nèi)的全身性適應(yīng)癥[1-2]。肉牛屬于恒溫動(dòng)物，汗腺不發(fā)達(dá)，耐熱性差，在中國南方高溫高濕環(huán)境下極易出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)。

血液承擔(dān)著機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，是調(diào)節(jié)機(jī)體各代謝的主要途徑。血清生化指標(biāo)可以反映機(jī)體各組織器官的生理病理狀況。由于血液樣本較易獲取，常常作為尋找疾病分子標(biāo)志物最理想的材料。目前，世界各地科研工作者和臨床醫(yī)生已在心血管疾病、癌癥、腫瘤、組織損傷等領(lǐng)域開展了一系列外周血循環(huán)miRNA標(biāo)志物的研究與開發(fā)，并取得了一定進(jìn)展[3]。miRNA是一種微小RNA，發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控功能，在各種生理和病理過程中扮演著重要的角色[4]。血液中的miRNA表達(dá)十分穩(wěn)定，可作為潛在的生物標(biāo)志物應(yīng)用于疾病的早期診斷、預(yù)后判斷以及化療監(jiān)測[5]。miRNA是熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛血清中高表達(dá)的調(diào)控因子，參與機(jī)體各組織器官免疫及抗氧化的調(diào)控過程[6]，而關(guān)于肉牛血清miRNA的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在通過對熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激狀態(tài)下牛血清生化指標(biāo)及基因表達(dá)量的測定，探討熱應(yīng)激、miRNA及其與機(jī)體免疫功能和抗氧化作用的關(guān)系，為篩選牛抗熱應(yīng)激調(diào)控因子提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

在重慶市良種肉牛場選擇20頭體況相近、體重450 kg左右，飼養(yǎng)管理一致的紅安格斯公牛為試驗(yàn)動(dòng)物，試驗(yàn)期分熱應(yīng)激期(9月11日-17日)和非熱應(yīng)激期(10月17日-23日)兩階段進(jìn)行，每階段為期7 d。

1.2牛舍溫濕度測定

參考A.Srikandakumar等[7]方法，在各試驗(yàn)階段每天下午02：00，牛舍中部和兩端，離地面1.5 m處懸掛溫濕度表，測定干濕球溫度，計(jì)算溫濕指數(shù)(THI)，THI= 0.72( Td+Tw)+40.6，其中Td是干球溫度，Tw是濕球溫度。(判斷標(biāo)準(zhǔn)：THI<72為正常生理狀態(tài)；72～79為輕度熱應(yīng)激狀態(tài)；79～89為中度熱應(yīng)激狀態(tài)；> 90為重度熱應(yīng)激狀態(tài))

1.3指標(biāo)測定

1.3.1血樣采集在各試驗(yàn)期第7 天下午02：00利用真空采血進(jìn)行頸靜脈采血(10 mL·頭-1)，并于離心機(jī)中，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清于-20 ℃冷凍保存供生化指標(biāo)測定。

1.3.2直腸溫度、呼吸頻率測定參考楊游等[8]方法，采用獸用體溫計(jì)及秒表計(jì)數(shù)器測定直腸溫度及呼吸頻率。

1.3.3血清生化指標(biāo)測定用全自動(dòng)生化分析儀及酶標(biāo)儀進(jìn)行血清生化指標(biāo)的測定。測定內(nèi)容：血清離子含量(K+、Na+、Cl-、Ca2+)；血清酶(ALT、AST、ALP、CK、LDH)；抗氧化指標(biāo)(T-AOC、SOD、GSP-Px、MDA)；免疫指標(biāo)(ALB、IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、IL-6)；內(nèi)分泌指標(biāo)(T3、T4)；血脂指標(biāo)(TC、TG、HDL、LDL)；測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

1.4.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄采用Trizol法提取血清總RNA，用紫外分光光度計(jì)確定RNA的濃度及OD值，并通過瓊脂糖凝膠電泳和毛細(xì)血管電泳檢測RNA完整性。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(上海生工，B532451)的步驟，反轉(zhuǎn)錄總RNA得到miRNA第一鏈cDNA。

1.4.2引物設(shè)計(jì)與合成利用miRBase、NCBI等在線工具，獲取的miRNAs的成熟序列，采用加尾法設(shè)計(jì)miRNA引物，同時(shí)以U6為內(nèi)參，下游引物為通用引物(試劑盒自帶)。上游引物由上海生工合成(表1)。

1.4.3熒光定量PCR反應(yīng)采用SYBR?Green I染料法，參照熒光定量說明書(Bio-Rad，1725272)進(jìn)行。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，同時(shí)取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測引物特異性。隨機(jī)取1個(gè)cDNA樣品，用10倍梯度連續(xù)稀釋回收產(chǎn)物得到實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。

表1熒光定量PCR引物及擴(kuò)增條件

Table 1Primer pairs and amplification requirement for real-time PCR

名稱Name上游引物序列(5'→3')Primersequences登錄號Accessionnumber退火溫度/℃Tm產(chǎn)物大小/bpSizemiR-1246AATGGATTTTTGGAGCAGGMI002111258.8miR-31AGGCAAGATGCTGGCATAGCTMI000476258.8miR-486TCCTGTACTGAGCTGCCCCGAGTMI000984358.8mR-148a-5pAAAGTTCTGAGACACTCCGACTMIMAT000454958.880～120mR-340TCCGTCTCAGTTACTTTATAGCCMI000980960.0miR-181aAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTMIMAT000354360.0miR-21TAGCTTATCAGACTGATGTTGACMI000474260.0

1.5統(tǒng)計(jì)分析

采用2-△△ct法分析定量結(jié)果。使用EXCEL2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，所得數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件Paired-Samplesttest進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用Bivariate Correlations估計(jì)各變量間的簡單相關(guān)。

2　結(jié)　果

2.1牛舍THI及生理指標(biāo)的測定

由表2可知，熱應(yīng)激期THI平均為84.83，為79～88，屬于中度熱應(yīng)激狀態(tài)，非熱應(yīng)激期THI平均為62.51，<72，屬于正常生理狀態(tài)。熱應(yīng)激期牛直腸溫度達(dá)39.24 ℃、呼吸頻率達(dá)49.60 次·min-1，極顯著高于非熱應(yīng)激期(P<0.01)。

2.2熱應(yīng)激對牛血清生化指標(biāo)的影響

對兩個(gè)時(shí)期血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明(表3)，熱應(yīng)激期測得的Cl-濃度、 LDH活性顯著高于非熱應(yīng)激期(P<0.05)；T-AOC活性、GSP-PX活性、IgA含量、IgG含量、T4含量、TC含量顯著低于非熱應(yīng)激期(P<0.05)；而MDA活性、HDL含量極顯著高于非熱應(yīng)激期(P<0.01)；SOD活性、IL-2含量、LDL含量極顯著低于非熱應(yīng)激期(P<0.01)；剩余指標(biāo)除熱應(yīng)激期IL-4含量較非熱應(yīng)激期有所升高外，其余指標(biāo)均有所下降，但差異均不顯著(P>0.05)。

表2牛舍環(huán)境THI及生理指標(biāo)測定結(jié)果

Table 2The results of barn environment THI and physiological index determination

項(xiàng)目Items溫濕指數(shù)THI直腸溫度/℃RT呼吸頻率/(次·min-1)Respiratoryrate狀態(tài)Condition熱應(yīng)激期Heatstress84.83±0.2939.24±0.34A49.60±2.77A中度熱應(yīng)激狀態(tài)非熱應(yīng)激期Nonheat-stress62.51±0.4238.34±0.11B32.00±2.83B正常生理狀態(tài)

同行數(shù)據(jù)無字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同

No letter in the same row means not significant difference between treatments(P>0.05)；Different small letters in the same row means significant difference between the treatments(P<0.05)；Different capital letters in the same row means extremely significant difference between the treatments(P<0.01).The same as below

表3血清生化指標(biāo)的測定結(jié)果

Table 3The results of biochemical indexes in serum

項(xiàng)目Items熱應(yīng)激Heatstress非熱應(yīng)激Nonheat-stress鉀/(U·L-1)K+4.47±0.495.23±0.66鈉/(U·L-1)Na+138.72±2.53139.36±2.14氯/(mmol·L-1)Cl-100.94±3.04a98.52±1.86b鈣/(mmol·L-1)Ca2+2.18±0.182.35±0.12谷丙轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1)ALT25.60±7.2028.40±4.88谷草轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1)AST60.20±8.2665.20±10.43堿性磷酸酶/(U·L-1)ALP40.20±8.9340.20±15.35肌酸激酶/(U·L-1)CK188.80±100.51194.60±38.06乳酸脫氫酶/(U·L-1)LDH1320.60±206.03a1075.20±212.67b總抗氧化能力/(U·mL-1)T-AOC4.39±0.47a6.41±0.81b超氧化物歧化酶/(U·mL-1)SOD99.65±3.53A113.00±3.19B谷胱甘肽過氧化/(μmol·L-1)GSP-Px104.81±15.88a141.70±9.60b丙二醛/(nmol·mL-1)MDA3.52±0.35A1.67±0.34B白蛋白/(U·L-1)ALB34.00±3.2536.70±2.50免疫球蛋白A/(μg·mL-1)IgA257.54±41.67a320.33±36.19b免疫球蛋白G/(mg·mL-1)IgG7.68±1.38a14.95±4.97b免疫球蛋白M/(mg·mL-1)IgM3.02±1.913.67±1.76白細(xì)胞介素2/(ng·L-1)IL-2360.84±215.75A628.42±213.06B白細(xì)胞介素4/(ng·L-1)IL-4380.14±117.14335.57±82.18白細(xì)胞介素6/(ng·L-1)IL-61255.48±459.511461.43±322.67三碘甲狀腺原氨酸/(nmol·L-1)T32.36±0.962.46±1.82甲狀腺素/(nmol·L-1)T493.93±14.14a126.93±8.56b總膽固醇/(g·L-1)TC3.13±0.39a3.96±0.93b甘油三酯/(g·L-1)TG0.23±0.110.33±0.16高密度脂蛋白/(mmol·L-1)HDL2.53±0.31A1.66±0.41B低密度脂蛋白/(mmol·L-1)LDL0.50±0.11A2.15±0.58B

2.3總RNA抽提結(jié)果及引物特異性檢測

用Nanodrop 2000檢測提取的總RNA，OD值均為1.8～2.0，將總RNA進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后，可見28S、18S、5S 3條條帶，28S和18S條帶亮度比約為2，條帶明亮清晰且無雜帶，RNA無降解(圖1)；同時(shí)用Agilent 2100毛細(xì)管電泳檢測RNA完整性，結(jié)果顯示，RIN≥8.0，且28S/18S≥0.8，樣品完整性好，質(zhì)量合格(圖2)。最后將miRNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2% 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示的片段大小與預(yù)期一致，引物特異性好(圖3)。

圖1　總RNA電泳檢測Fig.1　Electrophoresis of total RNA extraction

圖2　RNA完整性檢測Fig.2　Integrity detection of RNA

圖3　miRNAs qRT-PCR產(chǎn)物檢測Fig.3　Results of miRNAs qRT-PCR

2.4血清miRNA表達(dá)情況及其與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

血清中miRNA的表達(dá)情況如圖4所示。與非熱應(yīng)激期相比，熱應(yīng)激期miR-181a、miR-486表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，miR-1246表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)。將上述差異顯著的血清生化指標(biāo)與血清miRNA表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)如表4所示。由分析結(jié)果可知：血清 miR-1246表達(dá)量與Cl-、MDA含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與TC含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；血清miR-181a表達(dá)量與IgG含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與IgA、IL-2含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；血清miR-486表達(dá)量與IgG含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與LDH、T-AOC、IgA、IL-2含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其余變量之間無顯著相關(guān)性。

**.P<0.01；*.P<0.05，表4同 **.P<0.01；*.P<0.05.The same as Table 4圖4　血清miRNA 的表達(dá)情況Fig.4　The expression of miRNA in serum

表4血清miRNA表達(dá)量與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

Table 4The correlation analysis of miRNA expression and biochemical indexes in serum

Cl-LDHT-AOCSODGSP-PXMDAIgAIgGIL-2T4TCmiR-12460.730**-0.446-0.156-0.367-0.2270.823**0.123-0.357-0.2930.109-0.621*miR-181a0.1300.5200.4220.1710.2020.1840.574*0.781**0.632*0.4710.315miR-486-0.1190.658*0.596*0.2330.499-0.2660.586*0.775**0.564*0.4050.385

2.5 miRNA-靶基因的網(wǎng)絡(luò)互作

相關(guān)性分析結(jié)果表明，miRNAs與抗氧化指標(biāo)及免疫指標(biāo)存在顯著相關(guān)性，提示miRNAs可能在機(jī)體免疫應(yīng)答、抗氧化等方面具有調(diào)控作用，用TargetScan和 microRNA.Org 等軟件對miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，將預(yù)測到的靶基因在KEGG、DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO分析和KEGG分析。并用Cytoscape軟件對篩選結(jié)果進(jìn)行分析處理，由圖5可知，這些miRNA與靶基因構(gòu)成一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多中心基因互作結(jié)構(gòu)圖，處于網(wǎng)絡(luò)中心的節(jié)點(diǎn)除與網(wǎng)絡(luò)周邊節(jié)點(diǎn)之間存在相互作用外，與其他網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)之間也存在廣泛的互作關(guān)系。GO和KEGG分析表明，這些基因廣泛參與多種生物學(xué)過程，并在免疫系統(tǒng)發(fā)育信號通路、B細(xì)胞受體信號通路、T受體信號通路和MAPK級聯(lián)反應(yīng)等信號通路中發(fā)揮重要作用(表5)。

3　討　論

熱應(yīng)激是一種全身性的反應(yīng)，對機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌、消化吸收、血液循環(huán)、泌尿生殖、免疫和物質(zhì)代謝等方面均會(huì)產(chǎn)生影響。血清中無機(jī)離子含量對牛的正常生理代謝具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激下，牛血清K+、Ca2+、Na+均降低，血清Cl-則顯著升高，其原因可能是在熱應(yīng)激早期，由于環(huán)境溫度變化，引起機(jī)體呼吸中樞興奮，呼吸加快，使血液CO2含量下降，引起呼吸性堿中毒。從而引起腎中碳酸氫鹽的分泌能力增強(qiáng)，使腎小管對Cl-的吸收增加，最終導(dǎo)致血清中Cl-含量增加[9]。這與Z.Arad等[10]研究結(jié)果基本一致，說明熱應(yīng)激影響了機(jī)體電解質(zhì)平衡。本研究還發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激狀態(tài)下血清LDH升高，可能原因是LDH參與了無氧酵解，LDH可能導(dǎo)致機(jī)體乳酸水平增加，引起酸中毒，而酸中毒會(huì)影響呼吸，使機(jī)體出現(xiàn)呼吸功能障礙，機(jī)體缺氧。然而在此情況下，為保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心等重要器官供氧充足，其他組織則采取無氧酵解的方式供能，而無氧酵解運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)的同時(shí)，又會(huì)使機(jī)體LDH升高。說明隨著熱應(yīng)激程度的加深，機(jī)體出現(xiàn)呼吸性堿中毒和代謝性酸中毒的混合型酸堿紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激期T-AOC、SOD、GSP-PX含量均降低，而MDA含量升高，這是由于在熱應(yīng)激情況下，機(jī)體抗氧化防御體系受到破壞，自由基產(chǎn)生過多，自由基與不飽和脂肪酸作用，生成脂質(zhì)過氧化物，最終降解為MDA代謝物，這與李忠浩[11]的研究結(jié)果一致。說明熱應(yīng)激下?？寡趸芰ο陆?，自由基清除減少，對機(jī)體組織、細(xì)胞造成了氧化攻擊。

表5miRNA 靶基因GO和KEGG分析參與的主要信號通路

Table 5GO and KEGG analyze the main pathway of miRNA target genes

通路名稱PathwaynameID號IDnumber基因數(shù)GenenumberP值P-value免疫系統(tǒng)發(fā)育ImmunesystemdevelopmentGO0002520378.8E-4白細(xì)胞分化LeukocytedifferentiationGO0002521170.03細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)CellularstressresponseGO0033554290.04MAPK級聯(lián)反應(yīng)MAPKcascadereactionGO0000165174.1E-4B細(xì)胞受體信號通路BcellreceptorsignalingpathwayKO04662182.7E-4T細(xì)胞受體信號通路TcellreceptorsignalingpathwayKO04660122.8E-6

紫框、黃框、藍(lán)框分別表示各miRNA的靶基因域，紅圈表示這些miRNA所共有的靶基因，調(diào)控關(guān)系用灰色箭頭表示Purple box，yellow box and blue box represents the three miRNAs target genes，respectively.Red circle represents common target genes.Grey arrows represent regulatory relationships圖5　miRNA-靶基因刪除部分節(jié)點(diǎn)后的網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)Fig.5　Delete a part of the nodes of miRNA-target genes in network

本研究發(fā)現(xiàn)MDA含量與miR-1246表達(dá)量極顯著相關(guān)，其原因可能是熱應(yīng)激加速了機(jī)體組織的脂質(zhì)過氧化，并導(dǎo)致其抗氧化能力下降。通過靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其調(diào)控的靶基因中，ENOX2、GCLC、CAV1與機(jī)體抗氧化功能有關(guān)。在熱應(yīng)激狀態(tài)下，CAV1表達(dá)升高，導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)脫偶聯(lián)，eNOS出現(xiàn)功能障礙將不再生成NO，促使NO水平下降和超氧陰離子(O2-)增多，自由基水平升高，最終造成機(jī)體過氧化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激下免疫球蛋白IgA、IgG顯著降低，炎癥因子IL-2極顯著降低，可能是熱應(yīng)激影響了機(jī)體免疫水平和T淋巴細(xì)胞亞群的平衡。本研究中miR-181a和miR-486表達(dá)量與免疫指標(biāo)(IL-2、IgA、IgG)顯著相關(guān)，這與C.Z.Chen等[13]、Y.B.Ouyang等[14]的結(jié)果相似。C.Z.Chen等[13]發(fā)現(xiàn)miR-181a在小鼠造血器官差異表達(dá)，miR-181a可以調(diào)控B細(xì)胞發(fā)育和調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞抗原反應(yīng)。Y.B.Ouyang等[14]用生物信息學(xué)識別研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可能會(huì)調(diào)控?zé)釕?yīng)激蛋白家族(HSP70家族)幾個(gè)基因成員(如GRP78)的mRNA表達(dá)。心肌細(xì)胞在缺氧/復(fù)養(yǎng)損傷過程中，miR-486表達(dá)水平在Toll-like receptor 4的缺少或者 Pam3CSK4治療過程中有明顯增加。同時(shí)用慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染H9C2肌細(xì)胞能顯著減緩缺氧/復(fù)氧引起的LDH釋放[15]。這也與本研究發(fā)現(xiàn)的miR-486表達(dá)量與LDH含量呈極顯著相關(guān)存在一定的相似性。通過靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-181a和miR-486可能調(diào)控CD38、IL17F、CD4基因的表達(dá)與T細(xì)胞活化、B細(xì)胞分泌和免疫響應(yīng)等信號通路相關(guān)。研究表明CD4+T淋巴細(xì)胞約占成熟T淋巴細(xì)胞70%，主要為輔助性T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞分為 TH1和TH2兩個(gè)功能性細(xì)胞亞群。 TH細(xì)胞分泌 IL-2、IFN-γ、TNF-β，而 TH2細(xì)胞分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，說明CD4+T細(xì)胞通過這些炎癥因子，參與免疫反應(yīng)[16]。綜上表明，本研究初步確定了熱應(yīng)激、miRNA及其與機(jī)體免疫功能和抗氧化作用的關(guān)系，預(yù)測了miRNA可能調(diào)控的靶基因，但是關(guān)于miRNA如何調(diào)控目標(biāo)基因，進(jìn)而影響機(jī)體免疫、抗氧化、代謝等功能的具體機(jī)制尚需要更加系統(tǒng)的生物試驗(yàn)來驗(yàn)證。

4　結(jié)　論

熱應(yīng)激引起牛血液LDH、MDA、IgA、IgG、IL-2含量及miR-1246、miR-181a和miR-486表達(dá)的顯著性變化，并且兩者變化具有相關(guān)性。miR-1246、miR-181a、miR-486在機(jī)體熱應(yīng)激狀態(tài)下參與了調(diào)控免疫應(yīng)答及抗氧化防疫等方面的作用，可作為肉?？篃釕?yīng)激的分子標(biāo)記。

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(編輯程金華)

The Serum Biochemical Indexes and miRNA Expression in Cattle under Heat Stress and Their Correlation Analysis

HU Yu1，CAI Ming-cheng2，WANG Ling1，TAN Lin1，BI Wu1，ZHANG Jia-hui1，ZUO Fu-yuan1*

(1.DepartmentofAnimalScience，RongchangCampusofSouthwestUniversity，Rongchang402460，China；2.InstituteofAnimalGeneticsandBreeding，SichuanAgriculturalUniversity，Wenjiang611130，China)

The aim of the present study was to assess the changes of miRNA expression levels and serum biochemical indexes of cattle in heat stress.Twenty Red Angus bulls with similar body condition and consistent feeding and management selected from Chongqing Improved Beef Cattle Farm were used in the experiment.Blood samples were collected from each bull in heat stress and non heat-stress to analyze miRNA expression levels and serum biochemical indexes.The results showed that the serum concentrations of Cl-(P<0.05) and malondialdehyde (MDA) (P<0.01) and the activities of lactate dehydrogenase (LDH) (P<0.05) were significantly increased in heat stress in comparison with control.Whereas，the activities of total antioxidation (T-AOC) (P<0.05)，glutathione peroxidase (GSH-Px) (P<0.05) and superoxide dismutase (SOD) (P<0.01) as well as the contents of IgA (P<0.05)，IgG (P<0.05) and interleukin-2 (IL-2) (P<0.01) were remarkably decreased.Meanwhile，the expression levels of miR-181a (P<0.05) and miR-486 (P<0.05) were significantly downregulated and positively correlated with the contents of IgA (P<0.05)，IL-2 (P<0.05) and IgG (P<0.01)，respectively，but that of miR-1246 were significantly upregulated (P<0.01) and positively correlated with serum contents of MDA (P<0.05).In conclusion，the current results suggested that miR-1246，miR-181a，miR-486 might be involved in regulating the immune response and antioxidation process of cattle in heat stress，and could be as a molecular indicator of anti-heat stress.

heat stress；miRNA；serum biochemical index；correlation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.012

2016-04-01

重慶市科技支撐示范工程項(xiàng)目/豐都肉牛產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新與關(guān)鍵技術(shù)攻關(guān)(jcsf121-2012-01-1)；中央高?；緲I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(XDJK2016E086)；西南大學(xué)榮昌校區(qū)青年基金 (20700426)

胡煜(1991-)，女，湖南益陽人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail: huyu_186@163.com

左福元，教授，主要從事反芻動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail: zfuyuan@163.com

S823.2

A

0366-6964(2016)09-1840-08