蘭道亮,熊顯榮,柴志欣,艾 鷖,黃 偲,李 鍵*
(1.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院,成都 610041;2.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,成都 610041)
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牦牛發(fā)情期卵巢比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
蘭道亮1,2,熊顯榮2,柴志欣1,艾鷖1,黃偲2,李鍵1,2*
(1.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院,成都 610041;2.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,成都 610041)
旨在進(jìn)一步了解牦牛發(fā)情期卵巢的分子機(jī)制,解析牦牛繁殖的特殊性。本研究應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)牦牛和平原黃牛發(fā)情期卵巢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及全基因組差異表達(dá)模式比對(duì)分析。通過(guò)比較分析牦牛和黃牛卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),共篩選出1 307個(gè)差異表達(dá)基因,其中661個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)和646個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。進(jìn)一步功能分析表明,這些差異基因涉及多種 GO分類及KEGG通路。其中GO分類注釋顯示,差異基因與細(xì)胞粘附、激素調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程存在密切關(guān)聯(lián),同時(shí)鈣離子結(jié)合、陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等分子事件表現(xiàn)活躍。KEGG通路分析顯示,補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路的富集水平最高,其次為細(xì)胞色素P450相關(guān)通路。晝夜節(jié)律等一些新型通路,盡管與生殖功能沒(méi)有明顯關(guān)聯(lián),但也表現(xiàn)出顯著富集。本研究首次對(duì)比牦牛和黃牛發(fā)情期卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選并分析相關(guān)差異基因。該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡述牦牛卵巢的基本分子機(jī)理提供基礎(chǔ),同時(shí)也為全面理解牦牛繁殖特異性提供新的思路。
牦牛;發(fā)情期卵巢;轉(zhuǎn)錄組;比較分析;分子機(jī)制
牦牛(Bosgrunniens)素有 “高原之舟”的美譽(yù),是主要分布在中國(guó)青藏高原及其毗鄰高山或亞高山地區(qū)的特有物種,也是當(dāng)今世界上已知唯一一種能夠在高海拔地區(qū)(平均海拔高度3 000米)生存的牛屬動(dòng)物[1-2]。牦牛能夠很好地適應(yīng)高山草原環(huán)境,并在惡劣的高原環(huán)境條件下(如空氣稀薄、低溫和草料短缺)自由生長(zhǎng)和繁殖[3]。同時(shí)牦牛可以為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┠?、肉、毛等豐富的生產(chǎn)和生活資料,是高原地區(qū)不可或缺的重要畜種[1,4-5]。與生活在平原地區(qū)的普通牛類相比,牦牛的性成熟發(fā)育得更慢,其生殖能力普遍更低[6-7]。一頭成年牦牛的平均繁殖率僅為48.61%,其中超過(guò)一半的牦牛為每?jī)赡晟惶セ蛎咳晟齼商?。此外,雌性牦牛發(fā)情率也很低,超過(guò)90%產(chǎn)后雌性牦牛無(wú)法在同年的發(fā)情期發(fā)情[8-9]。
卵巢是雌性哺乳動(dòng)物的重要生殖器官。它具有眾多功能,包括提供能受精的卵母細(xì)胞、分泌生殖激素以及維持雌性動(dòng)物發(fā)情周期。卵巢功能直接影響著雌性動(dòng)物的繁殖能力[10]。每個(gè)發(fā)情周期過(guò)程中,卵巢都會(huì)經(jīng)歷增殖、侵襲、分化和細(xì)胞凋亡;這些正常的生理變化直接影響和決定了雌性動(dòng)物的排卵、受精率和產(chǎn)仔數(shù)[11]。與其他普通牛類相比,牦牛的卵巢較小,卵巢系膜更短,其位置也相對(duì)固定,但與前者的整體結(jié)構(gòu)是相似的[12]。迄今為止,針對(duì)牦牛卵巢的研究多集中于其形狀和解剖結(jié)構(gòu),而對(duì)牦牛卵巢的分子基礎(chǔ)及其分子機(jī)制仍然尚不明確。卵巢功能的實(shí)現(xiàn)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,這個(gè)過(guò)程涉及大量基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。另外,基因表達(dá)的差異性是物種進(jìn)化的重要組成部分,也是產(chǎn)生生物多樣的根本途徑[11,13]。因此,為了解牦牛卵巢的分子機(jī)制和牦牛繁殖的特殊性,需要對(duì)其轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行研究。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,RNA高通量測(cè)序(RNA sequencing)為大范圍的轉(zhuǎn)錄學(xué)研究提供強(qiáng)有力的工具,與傳統(tǒng)方法相比,其優(yōu)勢(shì)十分明顯[11]。而且隨著牦?;蚪M測(cè)序的完成也使進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究成為可能[1]。本研究應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)牦牛和平原黃牛發(fā)情期卵巢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序及比對(duì)分析,深入了解牦牛卵巢在發(fā)情周期中的差異表達(dá)基因及其調(diào)控通路,為進(jìn)一步研究牦牛卵巢的分子機(jī)制及全面了解牦牛繁殖的特異性提供基礎(chǔ)。
1.1樣本采集
參照文獻(xiàn)[14-15]的方法對(duì)牦牛的發(fā)情期進(jìn)行鑒定。從高原屠宰場(chǎng)(中國(guó)四川紅原,緯度31°51′ N~33°19′ N,經(jīng)度101°51′ E~103°23′ E;平均海拔高度為3 600 m)隨機(jī)選擇3頭處于自然發(fā)情周期且體型相當(dāng)?shù)慕】?歲雌性麥洼牦牛。同樣從高原屠宰場(chǎng)(中國(guó)四川成都,緯度30°05′ N~31°26′ N,經(jīng)度102°54′ E~104°53′ E;平均海拔高度為750米)隨機(jī)選擇3頭處于自然發(fā)情期的健康4歲雌性黃牛(Bostaurusdomesticus)。屠宰后立即采集牦牛和黃牛的卵巢組織并進(jìn)行觀察確認(rèn)后,將組織放液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2RNA提取、cDNA文庫(kù)構(gòu)建和Illumina測(cè)序
應(yīng)用TRIzol試劑(Life Technologies公司,美國(guó))提取牦牛和黃牛卵巢組織的總RNA。提取后的各RNA樣品均以無(wú)RNase的DNase I(TaKaRa公司,大連)進(jìn)行處理,以消除可能存在基因組DNA污染。然后分別等量混合3個(gè)牦牛和黃牛的RNA樣品,組成兩個(gè)RNA池(RNA Pool,各30 μg)。使用Oligotex mRNA小量提取試劑盒(Qiagen公司,德國(guó))從RNA池中分離和純化mRNA。整個(gè)流程 RNA 的質(zhì)量和含量通過(guò)Agilent 2100生物分析儀(Agilent公司,美國(guó))進(jìn)行測(cè)定。使用 TruSeq RNA Sample Prep Kit試劑盒(Illumina公司,美國(guó)),參照其說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)流程構(gòu)建隨機(jī)片段測(cè)序文庫(kù)。即用中段試劑在恒溫混勻儀中對(duì)純化的mRNA進(jìn)行片段化(約200 bp),而后將其作為cDNA第一鏈合成的模板。隨后使用RNase H、dNTP及DNA聚合酶I合成第二鏈cDNA。純化和配對(duì)末端修復(fù)后,將cDNA片段連接到測(cè)序接頭并通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,以此獲得最終的雙末端(Paired-end,PE)測(cè)序文庫(kù)。使用Agilent2100生物分析儀和ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)執(zhí)行質(zhì)控(QC)測(cè)試后,在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。
1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
對(duì)Hiseq 2500測(cè)序產(chǎn)生的原始讀數(shù)進(jìn)行QC測(cè)試后,通過(guò)去除接頭序列、空序列及低質(zhì)量測(cè)序序列(≤Q20質(zhì)量值),將原始讀數(shù)過(guò)濾為凈測(cè)序序列(Clean reads)。使用SOAPaligner/SOAP2軟件,將過(guò)濾后序列與牦?;蚪M(版本1.0)進(jìn)行比對(duì)[16]。然后利用比對(duì)數(shù)據(jù)計(jì)算這些測(cè)序序列在基因組及基因上的分布,并統(tǒng)計(jì)覆蓋率。根據(jù)RPKM法 (Reads per kilobase transcriptome per million mapped reads)計(jì)算基因表達(dá)水平。采用 “數(shù)字基因表達(dá)譜顯著性”算法(The significance of digital gene expression profiles)界定牦牛和普通牛類文庫(kù)之間的差異表達(dá)基因(Differential expressed genes,DEGs)[17],同時(shí)用P值檢測(cè)對(duì)應(yīng)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平的差異基因表達(dá)。偽發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.001和log2Ratio的絕對(duì)值≥1作為確定基因表達(dá)差異顯著性的閾值。通過(guò)GO和KEGG通路富集分析(P≤0.05),對(duì)DEGs的功能進(jìn)行注釋。
1.4Real-time PCR (qRT-PCR) 驗(yàn)證
從測(cè)序的差異表達(dá)基因中隨機(jī)選擇15個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(基因、引物信息見附表1)。使用TRIzol試劑(Life Technologies公司,美國(guó))提取同期取樣的牦牛和黃牛卵巢組織總RNA。用無(wú)核酸酶ddH2O將各RNA樣品的濃度調(diào)整至1 μg·μL-1,并用SuperScript?Ⅲ第一鏈合成系統(tǒng)(Life Technologies公司,美國(guó))在20 μL的反應(yīng)系統(tǒng)中對(duì)2 μg的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。然后使用SYBRH Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa公司,大連)和Bio-Rad CFX96 TouchTM實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR操作。反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 40 s,總共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行最終熔解度曲線分析。采用β-Actin作為內(nèi)參基因,根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。
2.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)已遞交于NCB數(shù)據(jù)庫(kù)(接受號(hào):SRX335453、SRX1302580)。去除低質(zhì)量序列(即僅包含接頭、接頭序列的讀數(shù)和空讀序列)后,在牦牛轉(zhuǎn)錄測(cè)序文庫(kù)中共獲得53 653 032條過(guò)濾測(cè)序序列,包含4 828 772 880 堿基(bp)。在黃牛轉(zhuǎn)錄測(cè)序文庫(kù)中共獲得54 855 396條過(guò)濾測(cè)序序列,包含4 936 985 640堿基(bp)。堿基組成和質(zhì)量分析結(jié)果顯示,原始測(cè)序數(shù)據(jù)表現(xiàn)出均衡的堿基組成,且牦牛和普通黃牛文庫(kù)的Q20(即堿基質(zhì)量值≥20)的比率分別為94.7%和94.5%,這一結(jié)果表明,文庫(kù)構(gòu)建成功且測(cè)序質(zhì)量良好。本研究以牦?;蚪M作為參考基因組。比對(duì)分析顯示,牦牛文庫(kù)中有33 168 751條(61.82%)測(cè)序序列、普通黃牛文庫(kù)中有31 730 973條測(cè)序序列(57.84%)可比對(duì)至牦牛基因組?;蚋采w率統(tǒng)計(jì)表明,牦牛和普通黃牛發(fā)情期卵巢文庫(kù)中分別有16 992條和16 904條牦?;虻玫接成?。此外,筆者發(fā)現(xiàn)一定比例的、無(wú)法映射至現(xiàn)有基因的測(cè)序序列(約30%),但是這些測(cè)序序列均位于基因組上,為進(jìn)一步挖掘牦牛新轉(zhuǎn)錄子或基因提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
2.2差異表達(dá)基因篩選
通過(guò)比較分析牦牛和黃牛發(fā)情期卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),共篩選出1 307個(gè)差異表達(dá)基因,其中661個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)和646個(gè)基因表達(dá)量下調(diào)。為驗(yàn)證這些基因表達(dá)數(shù)據(jù),筆者隨機(jī)選擇15個(gè)差異表達(dá)基因,以同期取樣的牦牛和黃牛卵巢組織為樣本進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示,這些差異基因的基本表達(dá)模式表現(xiàn)出與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相似的變化趨勢(shì)(表1),表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可靠。
2.3差異基因功能分析
為深入了解差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義,筆者對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集分析表明,差異表達(dá)基因在分布于生物學(xué)過(guò)程(Biological processes,BP)、細(xì)胞組分(Cellular components,CC) 及 分 子 功 能 (Molecular functions,MF)3大類中的GO類別上均出現(xiàn)富集。按生物過(guò)程分類,共有3 067個(gè)GO類別出現(xiàn)富集,富集前10的類別(Top 10)已列于表1中。在富集前10的GO類別中,“生物粘附”(Biological adhesion)、“細(xì)胞粘附”(Cell adhesion)和“細(xì)胞間粘附”(Cell-cell adhesion)等3個(gè)粘附相關(guān)GO類別的富集水平最高。此外,與激素相關(guān)的兩個(gè)GO類別,即“類固醇激素刺激響應(yīng)”(Response to steroid hormone stimulus)和“雌激素刺激響應(yīng)”(Response to estrogen stimulus),也富集于前10 GO類別中。在分子功能的分類下,共有667個(gè)GO類別出現(xiàn)富集,位列前10的顯著富集GO類別已列于表2中。在位列前10的GO類別中,“鈣離子結(jié)合”(Calcium ion binding)的富集水平最高。在前10富集GO類別中,陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)(Cation transmembrane transport-related)GO類別占據(jù)了絕大部分(6/10)。在細(xì)胞組分的分類下,共有427個(gè)GO類別出現(xiàn)富集。在位列前10的富集GO類別中(表3),所有類別均屬于細(xì)胞外(Extracellular parts)或質(zhì)膜部分(Plasma membrane parts)。KEGG富集分析表明,DEGs中共有243個(gè)通路出現(xiàn)富集,在位列前10的通路中(表4),“補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)”(Complement and coagulation cascades)通路的富集水平最高,其次 “細(xì)胞色素P450引起的外源性物質(zhì)代謝”(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)和“藥物代謝-細(xì)胞色素P450”(Drug metabolism-cytochrome P450)等與細(xì)胞色素P450相關(guān)通路也得到顯著富集。一些與卵巢生殖功能無(wú)顯著關(guān)聯(lián)的新型通路如“晝夜節(jié)律”通路(Circadian rhythm)也出現(xiàn)在富集水平前10的通路中。
表1生物學(xué)過(guò)程前10富集 GO 分類
Table 1Top 10 enrichment GO categories in the biological processes of DGEs
GO分類GOterm集群頻率a/%Clusterfrequency基因組頻率b/%GenomefrequencyP值CorrectedP-valueBiologicaladhesion9.44.68.88e-08Celladhesion9.34.61.54e-07Cell-celladhesion4.62.00.00078Anatomicalstructuredevelopment32.325.50.00139Anatomicalstructuremorphogenesis17.612.30.00142Developmentalprocess35.828.70.00182Responsetosteroidhormonestimulus4.92.30.00355Responsetoestrogenstimulus2.91.10.00577Responsetoxenobioticstimulus2.30.80.03572Glutathionemetabolicprocess1.20.30.03925
a.不同GO分類中的差異基因占所有GO分類總差異基因(965)的比例;b.該GO分類包含的基因占基因組所有基因(15 573)的比例
a.The proportion of differentially expressed genes with biological processes GO categories in total differentially expressed genes(965)with GO annotation;b.The proportion of genes with GO annotation in the entire yak genome(15 573)
表2分子功能過(guò)程前10富集 GO 分類
Table 2Top 10 enrichment GO categories in the molecular functions of DGEs
GO分類GOterm集群頻率a/%Clusterfrequency基因組頻率b/%GenomefrequencyP值CorrectedP-valueCalciumionbinding9.44.00.00232Metaliontransmembranetransporteractivity9.32.40.00237Cationchannelactivity4.61.80.00647Transmembranetransporteractivity32.36.50.01108Glycosaminoglycanbinding17.61.10.01124Monovalentinorganiccationtransmembranetransporteractivity35.82.20.01168Cationtransmembranetransporteractivity4.93.70.01386Gatedchannelactivity2.91.90.01587Inorganiccationtransmembranetransporteractivity2.33.10.02024Carbohydratederivativebinding1.21.20.03270
a.不同GO分類中的差異基因占所有GO分類總差異基因(944)的比例;b.該GO分類包含的基因占基因組所有基因(15 811)的比例
a.The proportion of differentially expressed genes with molecular functions GO categories in total differentially expressed genes(944)with GO annotation;b.The proportion of genes with GO annotation in the entire yak genome(15 811)
表3細(xì)胞組分過(guò)程前10富集 GO 分類
Table 3Top 10 enrichment GO categories in the cellular components of DGEs
GO分類GOterm集群頻率a/%Clusterfrequency基因組頻率b/%GenomefrequencyP值CorrectedP-valueExtracellularregion19.811.77.08e-13Extracellularregionpart12.06.41.32e-09Plasmamembranepart17.311.23.74e-07Extracellularspace9.05.04.77e-06Cellperiphery31.524.53.42e-05Intrinsictoplasmamembrane11.07.00.00024Plasmamembrane30.223.90.00045Cellsurface5.62.90.00065Integraltoplasmamembrane10.56.80.00078Extracellularmatrix4.72.50.00364
a.不同GO分類中的差異基因占所有GO分類總差異基因(1 054)的比例;b.該GO分類包含的基因占基因組所有基因(17 161)的比例
a.The proportion of differentially expressed genes with cellular components GO categories in total differentially expressed genes(1 054)with GO annotation;b.The proportion of genes with GO annotation in the entire yak genome(17 161)
表4富集前 10 (Top 10) KEGG 通路列表
Table 4Top 10 enrichment KEGG pathways in the DGEs
信號(hào)通路Pathway基因數(shù)(通路頻率/%)aGenenumber(Pathwayfrequency)基因數(shù)(基因組頻率/%)bGenenumber(Genomefrequency)P值CorrectedP-valueExtracellularregion31(2.68)206(1.09)2.910213e-06Extracellularregionpart83(7.17)938(4.95)0.00039214Plasmamembranepart20(1.73)145(0.76)0.00051927Extracellularspace66(5.70)720(3.80)0.00060855Cellperiphery14(1.21)89(0.47)0.00095037Intrinsictoplasmamembrane15(1.30)117(0.62)0.00501102Plasmamembrane34(2.94)366(1.93)0.009756936Cellsurface60(5.19)729(3.84)0.01112557Integraltoplasmamembrane12(1.04)94(0.50)0.01174199Extracellularmatrix6(0.52)36(0.19)0.02055234
a.不同通路中的差異基因占所有通路總差異基因(1 157)的比例;b.該通路包含的基因占基因組所有基因(18 965)的比例
a.The proportion of differentially expressed genes with pathway annotation in total differentially expressed genes(1 157)with pathway annotation;b.The proportion of genes with GO annotation in the entire yak genome(18 965)
為了解牦牛卵巢的分子機(jī)制和牦牛繁殖的特殊性,本研究應(yīng)用RNA-seq技術(shù)對(duì)牦牛和平原黃牛發(fā)情期卵巢進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序及比對(duì)分析,共篩選獲得1 307個(gè)差異表達(dá)基因,進(jìn)一步功能分析這些差異表達(dá)基因涉及多個(gè)GO分類和KEGG信號(hào)通路。在生物過(guò)程GO分類中,發(fā)現(xiàn)“生物粘附”(Biological adhesion)、“細(xì)胞粘附”(Cell adhesion)和“細(xì)胞間粘附”(Cell-cell adhesion)等3個(gè)粘附相關(guān)GO類別的富集水平最高。以往的研究表明,卵巢中的卵泡處于無(wú)血管的微環(huán)境中,卵母細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和其他卵泡細(xì)胞間存在廣泛的間隙連接,從而形成一個(gè)功能完備的聯(lián)合體。卵母細(xì)胞主要通過(guò)細(xì)胞黏附和連接與其周圍細(xì)胞(卵泡顆粒及膜細(xì)胞)進(jìn)行通訊[18-19]。本研究結(jié)果表明,處于發(fā)情周期中的牦牛和黃牛卵巢間可能存在不同的細(xì)胞粘附方式。在分子功能GO分類中,在前10富集的GO類別中,“鈣離子結(jié)合”(Calcium ion binding)的富集水平最高。作為第二細(xì)胞內(nèi)信使,鈣離子調(diào)節(jié)著細(xì)胞中許多重要的生理和病理過(guò)程。除了調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的增長(zhǎng)和減數(shù)分裂、參與激素和生長(zhǎng)因子分泌外,鈣離子也與卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟調(diào)節(jié)密切相關(guān)[20-21]?!扳}離子結(jié)合”類別在本研究中的富集水平最高,這說(shuō)明牦牛和黃牛卵巢間的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟調(diào)節(jié)可能存在差異。在前10富集GO類別中,陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)(Cation transmembrane transport-related)GO類別占據(jù)大部分(6/10)。細(xì)胞膜的離子活性與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)密切相關(guān),如pH、滲透壓、營(yíng)養(yǎng)吸收和膜電位;它在神經(jīng)遞質(zhì)分泌和激素代謝調(diào)節(jié)中也起著重要的作用[22]。另外,離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)建立的細(xì)胞膜濃度梯度為一系列細(xì)胞代謝活動(dòng)提供能量來(lái)源。在許多陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)中,鈣和鋅離子的轉(zhuǎn)運(yùn)在卵母細(xì)胞成熟調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用[23-25]。本研究中,陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)GO類別的富集證實(shí),與黃牛類卵巢相比,牦牛卵巢的離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)有所不同,但其確切功能仍有待進(jìn)一步研究。在細(xì)胞組分的分類下,位列前10的富集GO類別中,所有類別均屬于細(xì)胞外或質(zhì)膜部分。這一結(jié)果與生物過(guò)程和分子功能分類一致。例如,粘附、激素和陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)類別均發(fā)生于細(xì)胞外或質(zhì)膜部分,進(jìn)一步證實(shí)富集的準(zhǔn)確性。
在KEGG富集分析中,其中“補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)”(Complement and coagulation cascades)通路的富集水平最高。補(bǔ)體是在具有酶活性組織液中發(fā)現(xiàn)的一組不耐熱性球蛋白,在先天性和獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[26]。補(bǔ)體通過(guò)經(jīng)典、凝集素和旁路這3種途徑,可以激活一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而觸發(fā)補(bǔ)體分子效應(yīng)。激活后的補(bǔ)體可以調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞和免疫細(xì)胞,并增強(qiáng)炎癥反應(yīng);還可以通過(guò)溶解細(xì)胞壁直接殺滅某些細(xì)菌或細(xì)胞[27]。血凝是指血漿中的纖維蛋白通過(guò)外在和內(nèi)在凝血級(jí)聯(lián)通路轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白的過(guò)程[28]。“補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)”通路屬于一種內(nèi)源性代謝級(jí)聯(lián)。除了主體生理功能,該通路也與許多其他生理和病理調(diào)節(jié)過(guò)程密切相關(guān)。例如,補(bǔ)體系統(tǒng)在許多生物過(guò)程中都起著重要作用,其中包括繁殖、發(fā)育、干細(xì)胞分化和組織再生[29-30]。補(bǔ)體系統(tǒng)的Bf和DAF因子在卵細(xì)胞和配子的卵泡發(fā)育和成熟中扮演重要角色[31]。如圖1所示,3種級(jí)聯(lián)方式激活補(bǔ)體的關(guān)鍵基因的表達(dá)水平都出現(xiàn)升高。這一結(jié)果說(shuō)明,包括細(xì)胞裂解、肌肉收縮、趨化、吞噬細(xì)胞復(fù)原和炎癥在內(nèi)的下游生理功能可能得到增強(qiáng)。在凝血級(jí)聯(lián)通路中發(fā)現(xiàn),激活凝血的外在通路中基因僅出現(xiàn)少量表達(dá)。表明,包括血管損傷、纖維蛋白降解產(chǎn)物和一氧化氮生物合成在內(nèi)的主要生理功能可能出現(xiàn)下降。然而,內(nèi)在通路中的基因也出現(xiàn)大量表達(dá),表明包括炎癥和細(xì)胞粘附在內(nèi)的相關(guān)下游生理功能可能被加強(qiáng)。導(dǎo)致細(xì)胞粘附過(guò)程的強(qiáng)化與GO類別生物過(guò)程的富集結(jié)果是相一致的,證明細(xì)胞粘附過(guò)程是牦牛和黃牛卵巢生理活動(dòng)的重要差異之一。該結(jié)果表明,“補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)”通路在牦牛卵巢的生理活動(dòng)中具有重要作用,除能夠調(diào)節(jié)免疫力、炎癥外還可能與繁殖和發(fā)育密切相關(guān)。該通路可能與牦牛生活的特殊環(huán)境有關(guān)。為了抵御惡劣的高原環(huán)境引起的卵巢損傷和功能障礙,牦??赡苄纬梢环N比黃牛更強(qiáng)的分子防御機(jī)制。
在位列前10的KEGG通路中,“細(xì)胞色素P450引起的外源性物質(zhì)代謝” (Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)和“藥物代謝-細(xì)胞色素P450”(Drug metabolism-cytochrome P450)等與細(xì)胞色素P450相關(guān)通路也出現(xiàn)富集。細(xì)胞色素P450為一類亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族,主要包括CYP1、CYP2和CYP3亞家族。細(xì)胞色素P450是一種重要的代謝酶系統(tǒng),可以催化體內(nèi)多種內(nèi)源性和外源性化合物的氧化反應(yīng),更改化學(xué)物質(zhì)中的活性基團(tuán)或有毒化合物,以及改變藥物的療效。細(xì)胞色素P450參與外源物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化,并與內(nèi)源性物質(zhì)的代謝存在關(guān)聯(lián),同時(shí)它也是機(jī)體代謝調(diào)節(jié)中一種重要的化合物[32]。此外,細(xì)胞色素P450參與了固醇和類固醇激素的生物合成,尤其是性激素的生物合成,在生殖激素調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[33-34]。這一結(jié)果與生物過(guò)程中激素相關(guān)GO類別的富集相一致,證明牦牛和黃牛卵巢之間存在著激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)方面的差異。缺氧,包括高海拔缺氧,能夠顯著改變各細(xì)胞色素P450亞家族中的基因表達(dá)水平。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1),一種在低氧刺激下調(diào)節(jié)耐缺氧基因的重要因子,尤其是在高海拔缺氧調(diào)節(jié)扮演重要角色。研究表明作為細(xì)胞色素P450成員的CYP3A6啟動(dòng)子可以與HIF-1基因的特異性和轉(zhuǎn)錄激活相結(jié)合,從而誘導(dǎo)耐低氧基因的表達(dá)[35]。細(xì)胞色素P450的成員CYP17A1和CYP2E1基因也與藏族人存在密切聯(lián)系,能夠幫助他們適應(yīng)高原的低氧環(huán)境[36]。牦牛長(zhǎng)久以來(lái)一直生活在青藏高原。鑒于本研究中有兩個(gè)細(xì)胞色素P450通路出現(xiàn)顯著富集,可能也與牦牛對(duì)高原低氧環(huán)境的適應(yīng)能力有關(guān)。
加粗黑框基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。下同Bold boxes indicate the genes that were differentially expressed.The same as below圖1 補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路Fig.1 Differentially expressed genes in the complement and coagulation cascades pathways
一些與卵巢生殖功能無(wú)顯著關(guān)聯(lián)的通路也出現(xiàn)在富集水平前10的通路中,比如 “晝夜節(jié)律”(Circadian rhythm)通路。不同生物的生理和代謝活動(dòng)以及行為均遵循著某種晝夜節(jié)律,這種特殊的機(jī)制稱之為“生物鐘”。該機(jī)制的分子基礎(chǔ)有賴于相關(guān)生物鐘基因的協(xié)調(diào)表達(dá);產(chǎn)生的生物鐘蛋白會(huì)形成一個(gè)負(fù)向轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋環(huán)路,這個(gè)環(huán)路維持著晝夜節(jié)律并幫助哺乳動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境的變化[37]。哺乳動(dòng)物中已確定的主要生物鐘蛋白包括CLOCK蛋白、BMALL蛋白、CRY家族以及PER家族,其中CLOCK和BMALL蛋白在晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中處于核心地位[38]。本研究中,“晝夜節(jié)律”通路出現(xiàn)富集,且與黃牛數(shù)據(jù)相比,牦牛的CLOCK基因表達(dá)量下調(diào)(圖2)。筆者推測(cè),這可能與牦牛生活的特殊環(huán)境有關(guān)。由于青藏高原的高海拔、缺氧環(huán)境與強(qiáng)紫外線,牦牛對(duì)環(huán)境條件如溫度和光線的微弱波動(dòng)感受更加敏感。同時(shí)牦牛的繁育活動(dòng)具有典型的季節(jié)性特征,易受到季節(jié)性變化的影響,這可能也與該通路具有相關(guān)聯(lián)系。該通路在牦牛卵巢中的確切功能,仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。
圖2 晝夜節(jié)律通路Fig.2 Differentially expressed genes in the circadian rhythm pathway
應(yīng)用 RNA-Seq 技術(shù)首次對(duì)牦牛和黃牛發(fā)情期卵巢進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)比對(duì)分析,共篩選出1 307個(gè)顯著差異表達(dá)基因,同時(shí)對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行相關(guān)功能分析。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解牦牛卵巢的基本分子機(jī)制,以及牦牛繁殖的特殊性提供分子基礎(chǔ)。
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(編輯程金華)
Comparative Transcriptome Analysis between Yak and Cattle Estrus Ovary
LAN Dao-liang1,2,XIONG Xian-rong2,CHAI Zhi-xin1,AI Yi1,HUANG Cai2,LI Jian1,2*
(1.InstituteofQinghai-TibetanPlateau,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China;2.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China)
For elaborate the general physiological molecular features of the estrus ovary of yaks and particularity of yak reproduction.RNA-seq technology was applied to analyze transcriptome data comparatively between the yak and plain cattle estrus ovaries in this study.Compared with cattle,genome-wide divergent expression patterns during the ovary transcriptome data revealed that 1 307 genes were significantly and differentially expressed,in which 661 genes were upregulated and 646 genes were downregulated.Functional analysis showed that the differentially expressed genes were involved in various GO categories and KEGG pathways.GO annotations indicated that the genes were closely related to cell adhesion,hormonal biological processes,whereas the calcium ion binding,cation transmembrane transport molecular events were significantly active.KEGG pathway analysis showed that the complement and coagulation cascade pathway was the most enriched,followed by the cytochrome P450 related pathways.Moreover,several novel pathways,such as circadian rhythm,were significantly enriched despite having no evident associations with the reproductive function.This study is the first to compare the ovary transcriptome data between yak and cattle and to identify and analyze the related differential genes.Our findings provide a theory support for further investigation of the molecular mechanism of yak ovary and offer new insights to understand comprehensively the specificity of yak reproduction.
yak;estrus ovary;transcriptome;comparative analysis;general molecular mechanism
10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.011
2016-03-31
西南民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2015NZYTD01)
蘭道亮(1984-),男,畬族,江西德興人,副研究員,博士,主要從事高原動(dòng)物遺傳育種研究,E-mail:landaoliang@163.com;Tel:028-85522552
李鍵,教授,E-mail:lijian@swun.cn
S823.8+5.2
A
0366-6964(2016)09-1830-10