山羊INSIG1基因超表達對乳腺上皮細胞中脂質(zhì)合成的影響

王　苗，羅　軍，許會芬，朱江江，赫秋亞，姚大為，史懷平

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，楊凌 712100)

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山羊INSIG1基因超表達對乳腺上皮細胞中脂質(zhì)合成的影響

王苗，羅軍*，許會芬，朱江江，赫秋亞，姚大為，史懷平

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室，楊凌 712100)

本研究旨在通過構建西農(nóng)薩能奶山羊胰島素誘導基因1 (INSIG1) 的重組腺病毒(Adenovirus，Ad) 超表達載體，研究該基因超表達后對乳腺上皮細胞中脂質(zhì)合成的影響，從而為該基因在山羊乳腺脂質(zhì)合成調(diào)控中的功能研究奠定基礎。根據(jù)GenBank (登錄號：JQ665439)中山羊INSIG1基因序列設計引物，PCR擴增得到其CDS區(qū)序列。將目的基因連接到穿梭載體pAdTrack-CMV后獲得pAdTrack-CMV-INSIG1質(zhì)粒，將該質(zhì)粒PmeⅠ線性化后轉入大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細胞進行同源重組，獲得pAdEasy-INSIG1重組腺病毒超表達載體。該重組質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ線性化后轉染293A細胞進行病毒的包裝及擴繁，利用LaSRT法測定其滴度。將獲得的重組腺病毒Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮細胞，利用實時熒光定量PCR檢測INSIG1及脂質(zhì)合成相關基因的mRNA表達情況，利用GPO-Trinder酶學反應檢測細胞中甘油三酯的含量。結果表明，成功構建了奶山羊INSIG1基因重組腺病毒超表達載體，獲得了具有較高滴度 (2×108U·mL-1) 的超表達腺病毒Ad-INSIG1；Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮細胞48 h后，與Ad-GFP組相比，INSIG1基因的mRNA表達量上調(diào)約500倍，固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1 (SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白 (SCAP) 的mRNA表達量無明顯變化，參與脂肪酸從頭合成 (ACCα、FASN) 及去飽和 (SCD1) 基因的mRNA表達量均顯著下降 (P<0.05)；參與甘油三酯合成的3個關鍵基因中，GPAM及DGAT2的mRNA表達量顯著下降 (P<0.05)，AGPAT6的表達無顯著變化；同時，催化甘油三酯分解 (ATGL)的基因mRNA表達量也顯著下降 (P<0.05)；細胞內(nèi)甘油三酯含量無顯著變化。綜上所述，在山羊原代乳腺上皮細胞中，INSIG1能夠抑制脂質(zhì)合成相關基因的表達，對山羊乳腺脂質(zhì)合成具有調(diào)控作用。

山羊乳腺上皮細胞；胰島素誘導基因1 (INSIG1)；超表達；脂質(zhì)合成

胰島素誘導基因 (Insulin-induced gene，INSIG) 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，哺乳動物中有INSIG1和INSIG2兩個亞型[1-2]。前人研究顯示，INSIGs能夠與固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白 (Sterol regulatory element binding protein，SREBPs) 裂解活化蛋白 (SREBP cleavage-activating protein，SCAP) 及3-羥基-3甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶 (HMG CoA reductase，HMGR) 結合，從而發(fā)揮其生物學功能。INSIGs能使SCAP/SREBP復合體固定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，阻止其向高爾基體轉運活化[3]，并且能夠促進HMGR的降解[4]。其中SREBP在哺乳動物中是參與膽固醇及脂肪酸合成調(diào)節(jié)的重要轉錄因子，HMGR是膽固醇合成的限速酶，因此，INSIGs對脂質(zhì)及膽固醇代謝有重要的調(diào)控作用[5]。但INSIG1和INSIG2轉錄調(diào)節(jié)的機制是不同的，前者的表達受核SREBPs的正調(diào)節(jié)[2]，而后者的表達主要受胰島素的負調(diào)節(jié)[6]；INSIG1與SCAP的親和力強于INSIG2，在對SREBP的抑制過程中INSIG1蛋白起快速調(diào)節(jié)作用[7]；在肝中，INSIG1表達量占總INSIGs的75%以上[8]。因此，一般認為主要通過INSIG1蛋白實現(xiàn)對SREBPs和HMGR的反饋抑制。另外，研究發(fā)現(xiàn)，在牛分娩期前后，乳腺組織中INSIG1的mRNA表達量上調(diào)了12倍[9]，在對鼠的研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)[10]，提示INSIG1在乳腺組織中可能具有重要作用。然而，INSIG1基因在山羊乳脂生成中的調(diào)控功能及分子機制還不清楚。

本研究采用同源重組技術構建INSIG1腺病毒 (Adenovirus，Ad) 超表達載體，利用293A細胞包裝、擴增得到高滴度的腺病毒，為后續(xù)研究提供試驗材料；病毒液感染山羊原代乳腺上皮細胞后，檢測脂質(zhì)合成相關基因表達及細胞中甘油三酯含量的變化，初步探討INSIG1基因在山羊乳腺上皮細胞中的功能，為明確INSIG1基因在山羊乳腺脂質(zhì)代謝調(diào)控過程中的功能，揭示其對于乳脂合成代謝調(diào)控的意義，提供試驗依據(jù)和理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

腺病毒穿梭載體 (pAdTrack-CMV)、含有腺病毒骨架載體(pAdEasy-1)的大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)BJ5183 菌液、山羊原代乳腺上皮細胞及293A細胞系均由本實驗室保存。

試驗所用T4 DNA 連接酶、PrimeScript?反轉錄試劑盒及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、Taq酶、SalⅠ酶及BglⅡ酶等購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司 (大連)；DNA marker D2000 分子標量、E.coliTOP 10感受態(tài)細胞、DNA Marker Ⅲ分子標量、λDNA/Hind Ⅲ marker分子標量、細胞總RNA提取試劑盒、高純度小提中量試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒等購自北京天根生化科技有限公司 (北京)；限制性內(nèi)切酶PmeⅠ、PacⅠ等購自NEB 公司 (美國)；FuGENE HD轉染試劑購自羅氏 (Roche) 公司 (瑞士)；細胞培養(yǎng)板購自NUNC公司 (丹麥)；DMEM高糖培養(yǎng)基和DMEM/F-12 培養(yǎng)基均購自HyClone 公司 (北京)；胎牛血清購自浙江天杭生物有限公司 (杭州)；細胞/組織甘油三酯 (Triacylglycerol，TAG)提取試劑盒購自北京普利萊生物有限公司 (北京)。

1.2方法

1.2.1INSIG1基因的擴增根據(jù)西農(nóng)薩能奶山羊INSIG1基因的序列 (GenBank登錄號：JQ665439)，設計特異性引物，在上游引物前添加BglII酶切位點 (加粗部分) 及Kozak序列(下劃線部分)，下游引物添加SalI酶切位點 (陰影部分)，并在引物5′端添加保護堿基 (斜體部分)。上下游引物序列：INSIG1-S (5′-3′)：GAAGATCTGCCACCATGCCCAGACTGGACGACCACCTCT；INSIG1-A (5′-3′)：ACGCGTCGACTCAATCAC-TGTGTGGCTTTTCGG。

以山羊泌乳期乳腺組織cDNA為模板，對INSIG1基因進行PCR擴增。PCR反應體系及反應程序參照王慧等[11]的研究，其中退火溫度為63 ℃，延伸時間為1 min。PCR產(chǎn)物采用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將900 bp左右的目的片段回收純化后連接載體pMD19-T，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞E.coliTop 10，提取質(zhì)粒即pMD19-T-INSIG1，進行SalⅠ/BglⅡ雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒由英濰捷基公司進行測序鑒定。

1.2.2pAdTrack-CMV-INSIG1穿梭載體的構建用SalI和BglII對測序正確的pMD19-T-INSIG1質(zhì)粒和腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pAdTrack-CMV進行雙酶切，電泳檢測并回收純化，用T4連接酶將純化產(chǎn)物4 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉化到E.coliTop10感受態(tài)細胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基 (含卡那霉素Kan，100 mg·L-1)，37 ℃培養(yǎng)12～14 h。選取較小單克隆菌落培養(yǎng)擴繁后提取質(zhì)粒，凝膠電泳檢測，并利用SalⅠ/BglⅡ進行雙酶切鑒定。陽性質(zhì)粒由英濰捷基公司進行測序鑒定。

1.2.3重組腺病毒載體pAdEasey-INSIG1的構建及鑒定利用氯化鈣法，制備含骨架載體pAdEasey-1的感受態(tài)細胞E.coliBJ5183[12]。對pAdTrack-CMV-INSIG1陽性質(zhì)粒進行PmeI酶切線性化，回收產(chǎn)物轉化含腺病毒骨架載體pAdEasey-1的E.coliBJ5183感受態(tài)細胞中，其中熱激時間為55 s，進行同源重組。涂布于LB固體培養(yǎng)基 (Kan，100 mg·L-1)，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，挑取較小單克隆菌落培養(yǎng)擴繁。提取質(zhì)粒DNA，凝膠電泳檢測，并利用內(nèi)切酶PacI酶切鑒定。將陽性的重組質(zhì)粒轉化E.coliTOP10感受態(tài)細胞中進行大量擴繁。提取質(zhì)粒送往公司進行測序鑒定。

1.2.4腺病毒Ad-INSIG1的包裝、擴增及滴度測定取10 μg重組質(zhì)粒pAd-INSIG1用PacⅠ酶線性化，通過異丙醇沉淀法純化回收大片段。按照FuGENE HD Transfection Reagent說明書操作步驟，將回收產(chǎn)物轉染6孔細胞培養(yǎng)板中生長融合度為70%～80%的293A細胞中，進行重組腺病毒包裝。腺病毒包裝過程及擴增方法參考王偉等[13]的研究。利用LaSRT法測定病毒滴度[14]。

1.2.5腺病毒感染乳腺上皮細胞最佳MOI (Multiplicity of infection) 值的測定將生長良好的乳腺上皮細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待生長到匯合度達到70%～80%時，更換培養(yǎng)基，同時分別加入5、10、20和40 μL的腺病毒液，每個處理3個重復。每間隔24 h更換新鮮培養(yǎng)基，72 h后觀察細胞中的綠色熒光情況及細胞生長狀況，熒光較亮且細胞無明顯病變 (細胞變圓且成串分布)的量為在乳腺上皮細胞中最佳的感染量，計算MOI值。

1.2.6Ad-INSIG1腺病毒超表達效果檢測將生長狀態(tài)良好的F12代乳腺上皮細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞匯合度達到80%～90%后更換新鮮培養(yǎng)基，接種腺病毒，每間隔24 h更換一次培養(yǎng)基。設置2個組：對照組 (Ad-GFP)、試驗組 (Ad-INSIG1)，每個處理設置3個生物學重復。48 h后收集細胞提取總RNA，檢測濃度及純度，將合格的RNA樣品反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 分析。反應體系和反應條件均參考孫雨婷等[15]的研究，每個樣品重復3次。選擇UXT、MRPL39及RSP9為內(nèi)參基因[16-18]。實時定量引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，其中ΔCt=CtINSIG1-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCtAd-INSIG1-ΔCtAd-GFP，Ct內(nèi)參為3個內(nèi)參基因Ct值的幾何平均數(shù)[19]。

表1實時熒光定量PCR引物

Table1 Primers for qRT-PCR

基因名稱Gene引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物長度/bpLength擴增效率EfficiencyUXTF:TGTGGCCCTTGGATATGGTTR:GGTTGTCGCTGAGCTCTGTG1012.06MRPL-39F:AGGTTCTCTTTTGTTGGCATCCR:TTGGTCAGAGCCCCAGAAGT1011.94RPS-9F:CCTCGACCAAGAGCTGAAGR:CCTCCAGACCTCACGTTTGTTC642.10INSIG1F:AGCCTCACAAGTTCAAGCGR:ACAGTGCTGCTAATGTCAAGG1322.21SCAPF:CCATGTGCACTTCAAGGAGGAR:TGTCGATCTTGCGTGTGGAG1071.95SREBP1F:CTGCTGACCGACATAGAAGACATR:GTAGGGCGGGTCAAACAGG811.98ACCF:CTCCAACCTCAACCACTACGGR:GGGGAATCACAGAAGCAGCC1712.03FASNF:GGGCTCCACCACCGTGTTCCAR:GCTCTGCTGGGCCTGCAGCTG2261.93SCD1F:CCATCGCCTGTGGAGTCACR:GTCGGATAAATCTAGCGTAGCA2571.92GPAMF:ATTGACCCTTGGCACGATAGR:AACAGCACCTTCCCACAAAG1882.16DGAT2F:CATGTACACATTCTGCACCGATTR:TGACCTCCTGCCACCTTTCT1002.10AGPAT6F:AAGCAAGTTGCCCATCCTCAR:AAACTGTGGCTCCAATTTCGA1002.06ATGLF:GGAGCTTATCCAGGCCAATGR:TGCGGGCAGATGTCACTCT1802.16HSLF:GGGAGCACTACAAACGCAACGR:TGAATGATCCGCTCAAACTCG1361.98

1.2.7INSIG1基因超表達后對脂質(zhì)合成相關基因表達的影響脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)、硬脂?；o酶A去飽和酶1基因(Stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1) 、乙酰輔酶A羧化酶α基因(Acetyl-CoA carboxylas α，ACCα)、甘油-3-磷酸?；D移酶基因(Glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAM)、二脂酰甘油?；D移酶2基因(Diacylgycerol acyltransferase 2，DGAT2)、磷酸甘油?；D移酶基因6 (1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 6，AGPAT6)、脂肪三酰甘油酯酶 (Adipose triacylglycerol lipase，ATGL)及激素敏感脂肪酶 (Hormone-sensitive lipase，HSL) 被證實為脂質(zhì)代謝相關基因。利用Primer Premier5.0 軟件設計上述基因的qRT-PCR引物(表1)。反應體系、反應條件及數(shù)據(jù)分析方法同上。

1.2.8INSIG1基因超表達后對乳腺上皮細胞中甘油三酯含量的影響 將生長狀態(tài)良好的F12代乳腺上皮細胞接種于6 cm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞匯合度達到80%～90%后接種腺病毒，每間隔24 h更換一次培養(yǎng)基。病毒感染48 h后棄盡培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，利用試劑盒提取并利用GPO-Trinder酶學反應測量細胞內(nèi)甘油三酯的含量。每個處理設置3個生物學重復，每個樣品測量3次。

2　結　果

2.1INSIG1基因的擴增與鑒定

以泌乳期山羊乳腺組織cDNA為模板，PCR擴增得到山羊INSIG1基因CDS區(qū)序列831 bp (圖1A)。將PCR產(chǎn)物回收，連接到pMD19-T載體，進行雙酶切鑒定 (圖1B) 及測序，結果與GenBank中收錄的序列一致。表明成功克隆了西農(nóng)薩能奶山羊INSIG1基因的CDS區(qū)序列。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.INSIG1基因CDS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物；2.pMD19-T-INSIG1質(zhì)粒；3.pMD19-T-INSIG1經(jīng)SalⅠ和 Bgl Ⅱ的雙酶切產(chǎn)物M.DNA marker Ⅲ；1.Amplification product of INSIG1 CDS region by PCR；2.pMD19-T-INSIG1 vector；3.pMD19-T-INSIG1 vector digested by SalⅠand Bgl Ⅱ圖1　INSIG1基因的克隆與鑒定Fig.1　Cloning and identification of INSIG1 gene

2.2腺病毒穿梭載體pAdTrack-CMV-INSIG1的構建與鑒定

用SalⅠ和BglⅡ雙酶切pMD19-T-INSIG1及pAdTrack-CMV，回收后連接，獲得pAdTrack-CMV-INSIG1質(zhì)粒，再進行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約9 kb的質(zhì)粒條帶和831 bp的目的基因條帶 (圖 2)，與預期結果相符。另外，測序結果顯示插入的序列與設計序列完全一致，表明腺病毒穿梭載體構建成功。

2.3重組腺病毒載體pAdEasy-INSIG1的構建與鑒定

將PmeⅠ線性化的pAdTrack-CMV-INSIG1轉入制備好的E.coliBJ5183感受態(tài)細胞中，進行同源重組得到重組質(zhì)粒pAdEasy-INSIG1，PacⅠ酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測得到約30 kb的載體條帶和4.5 kb的條帶 (圖 3)，并且測序結果與INSIG1基因克隆的測序結果一致，表明重組腺病毒載體構建成功。

2.4腺病毒的包裝、擴增與滴度測定

pAdEasy-INSIG1腺病毒重組質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切線性化后，轉染293A細胞，2 d后熒光顯微鏡下可觀察到部分細胞有綠色熒光蛋白表達，7 d后綠色熒光蛋白表達量增多，同時開始出現(xiàn)噬菌斑，13 d后70%的細胞從培養(yǎng)瓶底脫落時收集病毒，反復感染293A細胞2次后，獲得高滴度的腺病毒 (圖 4)。經(jīng)過LaSRT法測定其滴度為2×108U·mL-1。

2.5腺病毒感染乳腺上皮細胞最佳MOI值的確定

將不同劑量的腺病毒感染乳腺上皮細胞72 h后，利用顯微鏡觀察熒光強度及細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)24孔板中最適宜的病毒接種量為20 μL，MOI值為200 (圖 5)。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.pAdTrack-CMV-INSIG1質(zhì)粒；2.pAdTrack-CMV-INSIG1質(zhì)粒的SalⅠ和 Bgl Ⅱ雙酶切鑒定M.λ/Hind Ⅲ DNA marker；1.pAdTrack-CMV-INSIG1 vector；2.pAdTrack-CMV-INSIG1 digested by SalⅠ and Bgl Ⅱ圖2　穿梭載體pAdTrack-CMV-INSIG1的構建Fig.2　Construction of pAdTrack-CMV-INSIG1 vector

M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1.pAdEasy-INSIG1質(zhì)粒的Pac Ⅰ酶切鑒定 M.λ/Hind Ⅲ DNA marker；1.pAdEasy-INSIG1 digested by Pac Ⅰ圖3　pAdEasy-INSIG1重組質(zhì)粒的Pac Ⅰ酶切鑒定Fig.3　Digestion identification of pAdEasy-INSIG1 by Pac Ⅰ

2.6Ad-INSIG1腺病毒超表達效果檢測

山羊乳腺上皮細胞感染Ad-GFP及Ad-INSIG1 48 h后，收集細胞提取總RNA，qRT-PCR檢測INSIG1基因的超表達效果。結果表明，與Ad-GFP感染組相比，Ad-INSIG1感染組中INSIG1基因的mRNA表達量顯著上調(diào)了500倍左右 (P<0.01) (圖 6)。

2.7INSIG1基因超表達后對脂質(zhì)合成相關基因表達的影響

利用2.6中獲得的RNA樣品，經(jīng)qRT-PCR檢測脂質(zhì)合成相關基因的表達情況。結果表明，與對照組相比，超表達INSIG1后，SCAP、SREBP1的mRNA表達量均無顯著變化 (圖 7A)；參與脂肪酸從頭合成及去飽和的基因中ACCα、FASN及SCD1的mRNA表達量均顯著下降，分別為 32%、21% 和23% (P<0.05) (圖 7B)；參與甘油三酯合成的3個關鍵基因中GPAM和DGAT2的mRNA表達量顯著下降 (P<0.05)，AGPAT6的表達量無明顯變化 (圖 7C)；催化甘油三酯水解的關鍵酶中ATGL的mRNA表達量顯著下降 (P<0.05)，HSL的mRNA表達量無明顯變化 (圖 7D)。

2.8INSIG1基因超表達后對細胞中甘油三酯含量的影響

Ad-GFP、Ad-INSIG1感染乳腺上皮細胞48 h后，收集細胞，利用試劑盒檢測細胞中甘油三酯的含量。結果表明，與Ad-GFP組相比，Ad-INSIG1組細胞中甘油三酯的含量無明顯變化 (圖 8)。

3　討　論

超表達技術是研究基因功能的重要手段之一，腺病毒超表達系統(tǒng)具有轉染效率高、感染細胞范圍廣、病毒滴度高等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛用于基因表達、疫苗制作和基因治療等領域[20]。本研究采用的是pAdEasy-1系統(tǒng)，兩步法構建重組腺病毒超表達載體，利用293A細胞進行病毒包裝與擴增，根據(jù)腺病毒載體上GFP熒光情況可方便地觀察到基因的表達情況及計算病毒的滴度。該方法操作簡便，成功率高。第一代腺病毒的成功包裝是獲得高滴度病毒液的關鍵。選擇生長狀態(tài)良好的細胞，當細胞匯合度達到70%左右時，轉染腺病毒載體。每天更換培養(yǎng)基以滿足病毒包裝過程中細胞的高營養(yǎng)需要，觀察并記錄熒光表達情況及細胞生長狀態(tài)，一般需要12～14 d[21-22]。試驗中在第7 天出現(xiàn)噬菌斑，第13 天發(fā)現(xiàn)80%細胞變圓脫壁，及時收毒。經(jīng)過2次擴增后獲得高滴度病毒，滴度為2×108U·mL-1。將該病毒感染乳腺上皮細胞48 h后，發(fā)現(xiàn)INSIG1基因mRNA的表達量上升約500倍，超表達效果顯著，可作為后續(xù)進一步功能研究的試驗材料。

INSIG1基因最早由K.L.Mohn等在胰島素處理鼠的肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)[23]，隨后從人體肝細胞中克隆得到該基因，命名為胰島素誘導基因1 (INSIG1)[1]。人INSIG1基因位于染色體7q36，含5個外顯子，編碼277個氨基酸，含有6個跨膜區(qū)[24]。王慧等[11]和C.F.Wu等[25]分別發(fā)現(xiàn)山羊、牛的INSIG1基因CDS區(qū)長度均為831 bp，編碼276個氨基酸，比人少1個氨基酸，且蛋白跨膜區(qū)也只有5個。這一差異提示了在蛋白結構及受調(diào)控機制方面，反芻動物INSIG1可能與先前對人INSIG1的研究結果存在差異。近年來對乳腺脂質(zhì)代謝基因網(wǎng)絡的研究發(fā)現(xiàn)，INSIG1具有重要的作用。在體外培養(yǎng)的脂肪細胞、牛及山羊乳腺上皮細胞中添加過氧化物酶體增殖物激活受體 (Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR) 的激動劑羅格列酮，導致INSIG1基因的表達量顯著上升，SREBP靶基因表達受到抑制，脂質(zhì)合成減少[22，26-27]；用t10，c12-CLA處理牛的乳腺上皮細胞后，油紅O染色顯示細胞內(nèi)脂質(zhì)積累增加，而INSIG1基因表達受到抑制，推測INSIG1可能介導了外源多不飽和脂肪酸對脂合成的抑制[27]。此外，在對鼠肝脂質(zhì)代謝的研究中，發(fā)現(xiàn)并驗證了INSIG1是miR-24的靶基因之一，miR-24能上調(diào)INSIG1基因的表達，脂質(zhì)合成變化則呈相反趨勢[28]。這些研究結果表明，INSIG1可能作為中間媒介，在多種因素對機體脂代謝調(diào)控中具有非常重要的作用。但這些因子是直接還是間接作用于INSIG1從而影響脂代謝仍需要進一步驗證。

A～C.腺病毒感染293A細胞2、7、13 d后的綠色熒光表達情況；A.2 d后出現(xiàn)少量熒光；B.7 d后出現(xiàn)噬菌斑；C.13 d后細胞脫壁變圓；D.高滴度的腺病毒感染293A細胞24 h后綠色熒光表達情況A-C.Fluorescence of 293A cell after transfection of pAdEasy-INSIG1 for 2，7 and 13 d，respectively；A.Slight green fluorescence was observed after 2 d；B.Plaques were observed after 7 d；C.Desquamated cells were observed after 13 d；D.Fluorescence microscopic image of 293A cell infected by high titer virus for 24 hours圖4　腺病毒的包裝與擴增 100×Fig.4　Adenovirus packaging and amplification 100×

0 h.感染前空白對照；null.不添加病毒的空白對照；72 h Ad-INSIG1.感染重組腺病毒Ad-INSIG1 72 h 后。上圖.白光觀察圖；下圖.熒光觀察圖0 h.Blank control before infection；null.Blank control without adenovirus infection；72 h Ad-INSIG1.Infected with recombinant adenovirus Ad-INSIG1 for 72 h.Upper panel.White light；Lower panel.Fluorescence圖5　感染腺病毒前后的乳腺上皮細胞 100×Fig.5　Goat mammary epithelial cells infected with and without adenovirus 100×

Ad-GFP.對照組；Ad-INSIG1.試驗組；**.與對照組相比差異極顯著P<0.01；下同Ad-GFP.Control group；Ad-INSIG1.Experiment group；**.P<0.01 compared with control group；The same as below圖6　INSIG1超表達效果檢測Fig.6　Overexpression analysis of INSIG1

A.SREBP通路；B.脂肪酸從頭合成及去飽和；C.甘油三酯合成；D.甘油三酯分解；*.與對照組相比差異顯著P<0.05A.SREBP pathway；B.Fatty acid de novo synthesis and desaturation；C.TAG synthesis；D.TAG degradation；*.P<0.05 compared with control group圖7　INSIG1基因超表達后對脂質(zhì)合成相關基因mRNA表達量的影響Fig.7　Effect of INSIG1 gene overexpression on the mRNA expression of lipid synthesis related genes

圖8　INSIG1超表達后對乳腺上皮細胞中甘油三酯含量的影響Fig.8　Effect of INSIG1 gene overexpression on the cellular triacylglycerol content

SREBP1是參與脂肪酸代謝調(diào)控的重要轉錄因子，直接調(diào)控參與膽固醇、甘油三酯、脂肪酸及磷脂的生物合成及攝取過程中30多個基因的表達[29-31]。SREBP蛋白以非活性的前體形式錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在SCAP的護送下進入高爾基體，進行蛋白水解活化成核SREBP轉入到細胞核內(nèi)，與靶基因啟動子上的固醇調(diào)節(jié)元件 (SRE) 序列結合而促進其表達[32]。INSIGs能與SCAP結合而抑制SREBP蛋白活化過程，而對其mRNA水平影響不大[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺上皮細胞中INSIG1超表達后，SCAP、SREBP1基因mRNA水平的表達均無顯著變化。這一結果與K.Takaishi 等[33]及L.J.Engelking等[34]在活體水平超表達INSIG1試驗中的結果一致；同時，在INSIG1基因敲除研究[35]中，也發(fā)現(xiàn)SCAP、SREBP1的mRNA表達量無顯著變化。另外，ACCα、FASN和SCD1是SREBP的3個重要靶基因，是參與脂肪酸從頭合成及去飽和的關鍵酶。INSIG1超表達后，脂肪酸合成關鍵基因ACCα、FASN及SCD1的mRNA表達量均顯著下降，這與前人研究[33-34]結果一致，表明在乳腺上皮細胞中超表達INSIG1基因能夠抑制SREBP蛋白的活化及其靶基因的轉錄，下調(diào)細胞內(nèi)脂肪酸從頭合成及去飽和過程。

甘油三酯是乳脂的主要成分，由長鏈脂肪酸和甘油形成。在甘油三酯合成的過程中包含3個關鍵的酶，GPAM參與催化的第一步反應，AGPAT催化甘油三酯 sn-2位置的酯化，DGAT催化二酰甘油加上脂肪酸?；o酶A形成三酰甘油，是甘油三酯合成限速酶[36]。細胞中甘油三酯的含量是動態(tài)變化的，也可被脂解并用于提供能量和膜脂。ATGL和HSL是催化甘油三酯水解的關鍵酶。本研究發(fā)現(xiàn)，INSIG1超表達后乳腺上皮細胞中GPAM和DGAT2的mRNA表達量顯著高于對照組，說明INSIG1對甘油三酯合成具有抑制作用。同時，ATGL基因的mRNA表達量也顯著下降。但檢測細胞中甘油三酯的含量發(fā)現(xiàn)，與Ad-GFP組相比，Ad-INSIG1組中的TAG含量無明顯變化，M.R.McFarlane等[35]也發(fā)現(xiàn)INSIG1敲除后小鼠血漿及肝中TAG無顯著變化。因此，我們推測INSIG1基因超表達后抑制了脂質(zhì)的合成，同時也導致了細胞中脂動員活動的減弱，最終使細胞內(nèi)甘油三酯的含量維持動態(tài)平衡狀態(tài)。具體的調(diào)控機制還需要進一步的研究探索。

4　結　論

本研究成功構建了奶山羊INSIG1基因重組腺病毒超表達載體，獲得了高滴度的重組腺病毒Ad-INSIG1。超表達INSIG1能夠下調(diào)山羊乳腺上皮細胞脂肪酸及甘油三酯合成相關基因的表達。這些結果將為進一步揭示INSIG1基因在乳脂合成中的功能奠定基礎。

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(編輯郭云雁)

Effect ofINSIG1 Overexpression on the Lipid Synthesis in Goat Mammary Gland Epithelial Cells

WANG Miao，LUO Jun*，XU Hui-fen，ZHU Jiang-jiang，HE Qiu-ya，YAO Da-wei，SHI Huai-ping

(ShanxiKeyLaboratoryofMolecularBiologyforAgriculture，CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

The aim of this study was to construct an insulin-induced gene-1 (INSIG1) recombinant adenovirus overexpression vector of Xinong Saanen dairy goat，and determine its effect on lipid synthesis in goat mammary epithelial cells (GMEC)，to lay the foundation for its functional study in regulating lipid synthesis in goat mammary gland.The primers were designed according to theINSIG1 sequence in GenBank (accession number：JQ665439)，then its coding sequences (CDS) was cloned by PCR.The gene fragments were inserted into shuttle vector pAdTrack-CMV to obtain pAdTrack-CMV-INSIG1 vector.After being linearized byPmeⅠ，pAdTrack-CMV-INSIG1 vector was transformed intoEscherichiacoliBJ5183 competent cells to obtain the recombinant adenovirus overexpression vector pAdEasy-INSIG1 by homologous recombination.Next，the pAdEasy-INSIG1 vector，linearized byPacⅠ，was transfected into 293A cells for viral packaging and amplification.LaSRT was used for titer assay.Finally，after infecting the goat mammary gland epithelial cells(GMEC) with Ad-INSIG1 recombinant adenovirus，qRT-PCR was used to measure the mRNA expression ofINSIG1 and genes related to lipid synthesis，and the GPO-Trinder enzyme reaction was used to measure the cellular triacylglycerol (TAG) content.The result showed thatINSIG1 overexpression recombinant adenovirus vector was successfully constructed，and the recombinant adenovirus Ad-INSIG1 with a high titer of 2×108U·mL-1was obtained.Compared with Ad-GFP infected group，the mRNA expression ofINSIG1 increased by about 500-fold after GMEC incubated with Ad-INSIG1 for 48 h.No obvious changes were observed on the mRNA expression of sterol regulatory element binding protein 1 (SREBP1) and SREBP cleavage-activating protein (SCAP)，however，there was a significant decrease in the expression genes related to fatty aciddenovosynthesis and desaturasion：acetyl-CoA carboxylas α (ACCα)，fatty acid synthase (FASN) and stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) (P<0.05).Among the 3 key genes involved in TAG synthesis，the transcript abundance of glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAM) and diacylgycerol acyltransferase 2 (DGAT2) were significantly decreased (P<0.05)，and 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase 6 (AGPAT6) had no obvious change.Meanwhile，the mRNA expression of adipose triacylglycerol lipase (ATGL)，an enzyme catalyzes the initial step of TAG hydrolysis，also decreased significantly (P<0.05).No significant difference was found in the cellular TAG content between 2 groups.In conclusion，INSIG1 can inhibit the expression of genes related to lipid synthesis in GMEC，and may have a regulatory function on lipid synthesis in goat mammary gland.

GMEC；INSIG1；overexpression；lipid synthesis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.008

2015-12-21

國家自然科學基金項目(31372281)；國家轉基因新品種培育重大專項(2014ZX08009-051B)

王苗(1992-)，女，湖北漢川人，碩士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：wangmiao9254@sina.com

羅軍，教授，博士生導師，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：luojun1@yahoo.com

S827；S813.3

A

0366-6964(2016)09-1806-11