赤霉素處理對重樓種子萌發(fā)相關(guān)生理指標(biāo)的影響

宋發(fā)軍，羅　忠，黃　珍，孟艷艷，張　鵬

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)國家民委重點實驗室/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074)

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赤霉素處理對重樓種子萌發(fā)相關(guān)生理指標(biāo)的影響

宋發(fā)軍，羅忠，黃珍，孟艷艷，張鵬*

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)國家民委重點實驗室/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點實驗室，武漢 430074)

為分析赤霉素(GA3)處理對重樓種子萌發(fā)相關(guān)生理指標(biāo)的影響，檢測了500 mg/L 外源GA3處理以及對照處理的華重樓種子萌發(fā)過程中SOD、POD、CAT和G6PDH酶活性以及內(nèi)源激素ZT、GA3、IAA和ABA含量的變化.結(jié)果表明：在90 d檢測范圍內(nèi)，GA3處理種子的SOD活性達(dá)到最大值的時間(第30 d)早于對照組(第60 d)，CAT酶活性最高峰值高于對照組；而且，除第0 d樣品外，GA3處理種子的G6PDH酶活性、CAT酶活性均大于對照組；GA3處理種子的ZT含量、內(nèi)源GA3含量和IAA含量的最高峰值及其出現(xiàn)時間均高于和早于對照組；POD酶活性則均低于對照；GA3處理種子的ABA含量比對照下降幅度更大，最低值更小.可見500 mg/L 外源GA3處理促進(jìn)了華重樓種子中SOD、CAT、G6PDH酶活性以及ZT、內(nèi)源GA3和IAA含量的增加，降低了POD酶活性以及ABA含量.

華重樓；種子萌發(fā)；赤霉素；生理生化指標(biāo)

重樓[ParispolyphyllaSmithvar.chinenensis(Franch.)Hand]是百合科(Liliaceae)重樓屬(Paris)多年生草本植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》中以“蚤休”之名記載，主要分布于湖北、云南、貴州、四川等地，具有抗菌抑菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用，市場需求量大.由于重樓資源的無序開發(fā)以及生態(tài)環(huán)境的破壞，導(dǎo)致重樓野生資源匱乏，重樓的人工繁育栽培是大量獲得重樓藥源植物的主要途徑之一.

重樓的人工繁育包括根莖繁育和種子繁育.重樓種子繁殖具有繁殖系數(shù)大、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，但也存在休眠期長，須經(jīng)過形態(tài)學(xué)后熟和生理學(xué)后熟才能萌發(fā)[1，2]，以及自然發(fā)芽率低等問題[3].人工打破重樓種子休眠，提高其發(fā)芽率是實現(xiàn)大規(guī)模重樓種子人工繁育種植關(guān)鍵.相關(guān)研究表明赤霉素(Gibberellin A3，GA3)具有促進(jìn)種子萌發(fā)的作用[4，5]，本實驗前期工作發(fā)現(xiàn)500 mg/L GA3能有效打破華重樓種子休眠并促進(jìn)其萌發(fā)[6].GA3處理后17 d華重樓種子開始萌發(fā)，與對照組(CK)(29 d萌發(fā))相比，萌發(fā)時間提前了12 d；30 d時， GA3處理種子萌發(fā)率達(dá)到35.07%；50 d時，萌發(fā)率達(dá)到81.58%，而90 d時萌發(fā)率則高達(dá)95.19%.GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)的機制尚不清楚，因此本文在前期工作基礎(chǔ)上，分析了GA3處理華重樓種子萌發(fā)過程中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)活性及玉米素(ZT)、赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)含量的變化規(guī)律，為深入研究GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)的生理生化機理以及重樓種子的快繁研究提供參考.

1　材料和方法

1.1材料

2014年秋季采集于武陵山區(qū)試驗田的成熟華重樓3年生種子，除掉穎殼以及紅色外種皮，室溫晾干后裝入透氣帶，置于4℃冰箱低溫處理3個月，備用.GA3、ZT、IAA和IBA購自Sigma公司.

1.2浸種處理

挑選籽粒飽滿的華重樓種子兩份，先用蒸餾水浸泡約48 h至種子吸水發(fā)脹變白為止.一份用500 mg/L赤霉素溶液浸泡48 h；另一份繼續(xù)使用蒸餾水浸泡48 h作對照(CK).

1.3接種處理

浸種后，用75%乙醇消毒30～40 s，再用0.1%的升汞消毒10～12 min，并稱取4 g種子作為第0 d樣品，其余種子在鋪有2層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每皿100粒左右，培養(yǎng)溫度(19±1 ) ℃，濕度80%，暗培養(yǎng)，并分別于培養(yǎng)的第15、30、45、60、90 d各取樣4 g，-80 ℃保藏備用.

1.4指標(biāo)測定

SOD、POD、CAT、G6PDH活性測定采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司測試盒.內(nèi)源激素的提取方法參照文獻(xiàn)[7]并加以改進(jìn)：稱取1 g華重樓種子，加入0.1 g抗壞血酸和15 mL 80%預(yù)冷甲醇冰浴研磨成漿，轉(zhuǎn)移至燒杯中4℃浸提24 h，4℃ 4000 r/min離心10 min，取上清液保存于4℃，殘渣加入15 mL 80%冰凍甲醇，4℃浸提20 h，離心，合并上清液，35℃減壓濃縮至原體積的1/3后，加入等體積乙酸乙酯-石油醚(1∶1，V/V)溶液萃取3次，收集水相萃取液，并加入0.1 g PVPP，20℃下震蕩20 min，4℃ 10000 r/min離心10 min，取上清，1 mol/L檸檬酸調(diào)pH至3.0，30℃蒸干后，色譜甲醇溶解沉淀并定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后用于HPLC檢測.

內(nèi)源激素檢測：采用Agilent Technologies 1200 Series色譜儀，Venusil XBP C18色譜柱，柱溫35℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，紫外檢測波長254 nm.流動相為甲醇-0.8%乙酸，梯度洗脫(0～12 min，5%～25%A；12～20 min，25%～50%A；20～40 min，50%A).保留時間定性，外標(biāo)法定量.

1.5數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析處理.

2　結(jié)果與分析

2.1GA3處理對種子萌發(fā)過程中SOD酶活性的影響

SOD是植物體內(nèi)清除氧自由基的主要酶類， SOD活性強弱在某種程度上可以反映種子的活力[8].由圖1可知，GA3處理種子的SOD活性呈先升高后降低再升高的趨勢，于第30 d達(dá)到最大值23.38 U/g，而對照組SOD活性呈雙峰變化趨勢，最高峰值出現(xiàn)在第60 d(23.23 U/g)，說明GA3處理導(dǎo)致華重樓種子的SOD活性最大值的出現(xiàn)時間早于對照；而且，在15、30、45和90 d檢測點的SOD活性高于對照，也表明GA3處理可以促進(jìn)華重樓種子SOD的合成.顯著性分析結(jié)果表明，GA3處理種子的SOD活性在第0、15、60 d與對照組存在差異極顯著性(p<0.01)，在第30 d差異顯著(p<0.05).可見高的SOD活性是與GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)相關(guān)的一個生理生化指標(biāo).

圖1　華重樓種子萌發(fā)過程中SOD酶活性變化Fig.1　The change of SOD activity in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.2 GA3處理對種子萌發(fā)過程中POD酶活性的影響

POD既是植物體內(nèi)清除氧自由基的酶類，同時還參與植物體內(nèi)吲哚乙酸的氧化分解.圖2表明，GA3處理組及對照組種子POD活性均呈先降低后升高的趨勢，最小值分別出現(xiàn)在第30 d和第15 d.GA3處理種子POD活性從第0 d(62931.31 U/g)降至第30 d(32802.99 U/g)，隨后一直升高至90 d(47280.52 U/g，低于第0 d)；而對照組POD活性由第0 d(61995.55 U/g)降至第15 d(36546.11 U/g)，之后，持續(xù)升高至第90 d(62931.31 U/g，略高于第0 d).在0、30、45、60和90 d 檢測點GA3處理種子POD酶活性均低于對照，說明GA3處理會抑制華重樓種子體內(nèi)POD活性.顯著性分析結(jié)果表明，GA3處理種子的POD活性在第30，45和60 d與對照組間存在顯著差異(p<0.05)；在第90 d差異極顯著(p<0.01).因此低的POD活性是與GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)相關(guān)的一個生理生化指標(biāo).

圖2　華重樓種子萌發(fā)過程中POD酶活性變化Fig.2　The change of POD activity in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.3GA3處理對種子萌發(fā)過程中CAT酶活性的影響

CAT的主要作用是防止過量的過氧化氫對細(xì)胞膜系統(tǒng)的毒害以及對脂質(zhì)的氧化，減少過氧化氫對植物的傷害.圖3表明，GA3處理組和對照組種子的CAT酶活性均呈先升高后降低的趨勢，GA3處理和對照組種子的CAT酶活性最高峰值分別出現(xiàn)在第30 d(1409.06 U/g)和第15 d(573.58 U/g)，GA3處理種子的CAT酶活性最高峰值約是對照組的1.83倍，而且從第15 d至第90 d的各個檢測點，GA3處理種子的CAT酶活性均高于對照組，說明GA3處理可以更有效的提高華重樓種子的CAT活性，從而為種子快速萌發(fā)提供有利的條件.顯著性分析結(jié)果表明，GA3處理種子的CAT活性除第0 d外均與對照組存在極顯著差異(p<0.01).這些結(jié)果預(yù)示CAT活性升高與重樓種子的快速萌發(fā)有緊密的聯(lián)系，高CAT活性是與GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)相關(guān)的一個生理生化指標(biāo).

圖3　華重樓種子萌發(fā)過程中CAT酶活性變化Fig.3　The change of CAT activity in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.4GA3處理對種子萌發(fā)過程中G6PDH酶活性的影響

戊糖磷酸途徑與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)，而G6PDH是戊糖磷酸途徑限速酶之一.圖4可看出，處理組和對照組種子的G6PDH活性呈先上升后降低再上升的趨勢，分別于第15 d達(dá)到峰值(160.41 U/g和118.73 U/g)，之后，G6PDH活性開始下降.GA3處理種子的G6PDH活性于第30 d后又開始上升，于第90 d達(dá)到171.58 U/g；而對照處理種子G6PDH活性于第45 d后開始上升，至第90 d達(dá)到87.34 U/g.在90 d檢測范圍內(nèi)，GA3處理種子的G6PDH酶活性均高于對照組，說明GA3處理能夠增強華重樓種子體內(nèi)G6PDH活性.顯著性分析結(jié)果表明，在第15、45、60和90 d檢測點，GA3處理種子與對照組G6PDH活性存在顯著差異(p<0.05).同樣G6PDH活性是GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)相關(guān)的一個生理生化指標(biāo).

圖4　華重樓種子萌發(fā)過程中G6PDH酶活性變化Fig.4　The change of G6PDH activity in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.5GA3處理對種子萌發(fā)過程中ZT含量的影響

玉米素(ZT)是一類細(xì)胞分裂素，ZT含量的提高有助于打破種子休眠[9].由圖5可見，GA3處理種子的ZT含量表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，于第30 d檢測點達(dá)到最高峰值(13.70 ng/g)，之后開始降低，并于第90 d檢測點時接近初始水平(第0 d)，說明此時重樓種子的萌發(fā)已無需過多的ZT參與.對照組種子的ZT含量呈現(xiàn)雙峰的趨勢，分別在第30 d(10.04 ng/g)和第60 d(13.17 ng/g)出現(xiàn)峰值，在第90 d檢測點時仍高于初始水平.在0～45 d檢測點，GA3處理種子的ZT含量一直高于對照，而且ZT含量的最高峰值出現(xiàn)時間(30 d,13.70 ng/g)早于和高于對照組(60 d,13.17 ng/g)，預(yù)示GA3處理能夠促進(jìn)華重樓種子提前合成大量ZT，從而有助于其萌發(fā).顯著性分析結(jié)果表明，GA3處理組與對照組的ZT含量在第30、45、60和90 d差異極顯著(p<0.01).因此高含量ZT是與GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)相關(guān)的一個生理生化因子.

圖5　華重樓種子萌發(fā)過程中ZT含量變化Fig.5　The content of ZT in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.6GA3處理對種子萌發(fā)過程中內(nèi)源GA3含量的影響

GA3促進(jìn)萌發(fā)的作用表現(xiàn)在兩方面：一是解除脫落酸的抑制作用，二是誘導(dǎo)物質(zhì)與能量代謝相關(guān)水解酶的合成與分泌[10,11].圖6表明，GA3處理和對照處理種子的內(nèi)源GA3含量均呈先降低后升高再降低再升高的趨勢.GA3處理種子和對照組種子的內(nèi)源GA3含量第一個峰值分別出現(xiàn)在第30 d(455.78 ng/g)和第45 d(442.76 ng/g)，說明GA3處理華重樓種子的內(nèi)源GA3含量的峰值早于和高于對照組.之后，內(nèi)源GA3含量下降，GA3處理組種子和對照組種子的內(nèi)源GA3含量分別于第45 d檢測點和第60 d檢測點開始上升，GA3處理種子的內(nèi)源GA3含量于第90 d檢測點達(dá)到最大值496.98 ng/g，而對照處理種子第90 d檢測點的內(nèi)源GA3含量低于其初始水平(第0 d)，表明GA3處理能夠更有效的促進(jìn)華重樓種子內(nèi)源GA3的合成.顯著性分析結(jié)果表明，GA3處理組與對照組間除第0 d外，其余5個檢測點差異均極顯著(p<0.01).可見高的內(nèi)源GA3含量是與華重樓種子快速萌發(fā)相關(guān)的一個生理生化因子.

圖6　華重樓種子萌發(fā)過程中內(nèi)源GA3含量變化Fig.6　The content of endogenous GA3 in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

2.7GA3處理對種子萌發(fā)過程中IAA含量的影響

圖7　華重樓種子萌發(fā)過程中IAA含量變化Fig.7　The content of IAA in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

吲哚乙酸(IAA)是自然界中存在最廣泛的生長素，具有能促進(jìn)細(xì)胞核的分裂及細(xì)胞的伸長的作用.圖7表明，GA3處理組和對照組種子的IAA含量均呈先降低后升高再降低再升高的趨勢.GA3處理組種子和對照組種子的IAA含量第一個峰值分別出現(xiàn)在第30 d檢測點(63.41 ng/g)和第45 d檢測點(46.51 ng/g)，說明GA3處理華重樓種子的IAA含量的峰值早于和高于對照處理.之后，IAA含量下降，隨后GA3處理組種子和對照組種子的IAA含量又分別于第45 d和第60 d上升，GA3處理種子的IAA含量于第90 d檢測點達(dá)到最大值74.18 ng/g，而對照處理種子的第90 d檢測點的IAA含量低于其初始水平(第0 d)，說明GA3處理能夠更有效的促進(jìn)華重樓種子IAA的合成.顯著性分析結(jié)果表明，GA3處理種子與對照處理種子間在第30 d和第45 d差異極顯著(p<0.01).這些結(jié)果預(yù)示高的IAA含量與GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)的具有一定的關(guān)聯(lián).

2.8GA3處理對種子萌發(fā)過程中ABA含量的影響

脫落酸(ABA)能誘導(dǎo)種子休眠，具有抑制萌發(fā)和胚芽鞘伸長的生理效應(yīng)，與赤霉素之間存在拮抗作用[12].由圖8可知，處理組的ABA含量呈下降的趨勢，于第90 d達(dá)到最低值5.92 ng/g；而對照組的ABA含量整體呈下降趨勢，但在第30 d檢測點后開始上升至第45 d(9.09 ng/g，低于初始水平)，并于第90 d達(dá)到最低值7.23 ng/g.在90 d的檢測范圍內(nèi)，處理組ABA含量下降幅度更大，而且ABA含量的最低值小于對照組，表明GA3處理可以顯著降低華重樓種子內(nèi)ABA含量.顯著性分析結(jié)果表明，GA3處理種子與對照組種子在第15、90 d存在差異極顯著(p<0.01)，在第30、45、60 d存在差異顯著(p<0.05).可見低的ABA含量是GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)相關(guān)的一個生理生化因子.

圖8　華重樓種子萌發(fā)過程中ABA含量變化Fig.8　The content of ABA in the germination process of P. polyphylla var. chinensis seeds

3　結(jié)語

種子萌發(fā)過程中伴隨著一系列復(fù)雜而有序的生理變化，包括儲藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與利用、呼吸代謝作用、質(zhì)膜的抗氧化等，檢測參與這些生理活動的酶類的變化規(guī)律有助于揭示種子萌發(fā)的生理生化機制.本研究發(fā)現(xiàn)GA3處理華重樓種子萌發(fā)過程中SOD、CAT、G6PDH酶活性增加，POD酶活性降低.預(yù)示GA3促進(jìn)華重樓種子萌發(fā)可能與高的SOD、CAT、G6PDH酶活性以及低的POD酶活性有關(guān).

內(nèi)源激素含量的變化與種子萌發(fā)存在緊密聯(lián)系，各種激素能夠誘導(dǎo)儲藏物質(zhì)的分解與合成并最終導(dǎo)致種子的萌發(fā)[13].本研究表明外源GA3有可能通過

更有效的促進(jìn)華重樓種子大量合成ZT、內(nèi)源GA3和IAA，同時降低ABA含量，從而促進(jìn)華重樓種子萌發(fā).

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Effect of Exogenous Gibberellic Acid on the Physiological and Biochemical Factors in the Germination Process ofParispolyphyllavar.chinensisseeds

SongFajun,LuoZhong,HuangZhen,MengYanyan,ZhangPeng

(National Committee Key Laboratory for Biotechnology / Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China, College of Life Sciences,South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

In order to reveal the influence of exogenous Gibberellic acid (GA3) on the physiological and biochemical factors in the germination process ofP.polyphyllaseeds, the activity of SOD, POD, CAT, G6PDH and the content of ZT, endogenous GA3, IAA, ABA were detected in the germination process ofP.polyphyllaseeds treated with 500 mg/L endogenous GA3and mocked-treated with H2O as control.Results: In the 90 days range, the appearance time of the highest SOD activity in GA3-treated seeds (day 30) was earlier than the control (day 60), the highest CAT activity in GA3-treated seeds was higher than the control, and the activity of G6PDH and CAT in GA3-treated seeds was higher than the control except in the day 0 samples. The highest content and its appearance time of ZT, endogenous GA3, IAA in GA3-treated seeds were higher and earlier than the results of the control. However, the POD activity in GA3-treated seeds was lower than that of the control, and the decreasing extent and the minimum content of ABA in GA3-treated seeds was more significant and lower than the results of the control. Conclusions: Treatment with 500 mg/L exogenous GA3led to increase the activity of SOD, CAT, G6PDH and the content of ZT, endogenous GA3, IAA, in the meanwhile, and decrease the POD activity and the ABA content in GA3-treatedP.polyphyllaseeds.

Parispolyphyllavar.chinensis; seed germination; gibberellic acid; physiological and biochemical factors

2016-04-14*通訊作者張鵬，研究方向：藥用植物及其內(nèi)生菌, E-mail: zhangpenghust@126.com

宋發(fā)軍(1967-)，男，教授，研究方向：應(yīng)用生物化學(xué)，E-mail：songfajun@scuec.edu.com

國家自然科學(xué)基金資助項目(31370118)；中南民族大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(CZW15019)；校企合作項目(HZY14024)；中南民族大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)資助項目(GCX15006; SCX15004);湖北省生物技術(shù)專業(yè)綜合改革試點項目(GJZ15006)

Q945.4

A

1672-4321(2016)03-0030-05