硅膠柱色譜結(jié)合高速逆流色譜法分離制備白首烏根皮中的苯乙酮類成分△

李懷志，徐凌川，王曉，李佳*，楊鵬，楊炳田

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014；3.濟(jì)南三峰生物制藥有限公司，山東 濟(jì)南 250014)

硅膠柱色譜結(jié)合高速逆流色譜法分離制備白首烏根皮中的苯乙酮類成分△

李懷志1，2，徐凌川1，王曉2，李佳1*，楊鵬3，楊炳田3

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014；3.濟(jì)南三峰生物制藥有限公司，山東 濟(jì)南 250014)

目的創(chuàng)建硅膠柱色譜結(jié)合高速逆流色譜法制備分離泰山白首烏根皮中苯乙酮類成分的方法。方法白首烏根皮粗提物先經(jīng)過硅膠柱色譜進(jìn)行初步分離，得到含有苯乙酮類成分的A和B兩個(gè)組分，分別采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4.5∶5.5，V/V)和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶3∶7，V/V)的兩相溶劑體系進(jìn)行制備并分離。結(jié)果從260 mg 組分A中分離制備得到對(duì)苯二酚3.9 mg (1)、 4-羥基苯乙酮17.1 mg (2)、2，5-二羥基苯乙酮13.3 mg (3)和2，4-二羥基苯乙酮21.0 mg (4)；從300 mg 組分B中分離得到白首烏二苯酮136 mg (5)。經(jīng)高效液相色譜分析，其純度分別為97.0%、96.6%、99.2%、99.7%、99.5%。結(jié)論該法簡便、快速、高效，可用于白首烏根皮中苯乙酮類成分的快速分離制備，有較好的實(shí)用價(jià)值，為白首烏根皮的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

硅膠柱色譜；高速逆流色譜；苯乙酮類成分；白首烏根皮

泰山白首烏CynanchumbungeiDecne為蘿藦科植物戟葉牛皮消的塊根，是泰山的“四大名藥”之一，其味甘、苦，性微溫，具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、止心痛、壯筋骨和延年益壽之功效[1]。白首烏塊根中的化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有C21甾體酯苷類、磷脂類、苯乙酮類等，具有抗氧化、抗腫瘤、抗缺氧、調(diào)節(jié)免疫功能、降血脂等多種藥理活性[2-3]。據(jù)報(bào)道，其中苯乙酮類成分能夠保護(hù)肝細(xì)胞以及具有抗氧化活性[3-4]，目前對(duì)這類成分的研究還不夠深入，并且沒有對(duì)其根皮進(jìn)行分離的報(bào)道。本文對(duì)泰山白首烏根皮粗提物中的苯乙酮類成分進(jìn)行分離制備，建立了白首烏中苯乙酮類成分的高效分離制備方法，對(duì)白首烏藥材及產(chǎn)品的開發(fā)利用以及苯乙酮類成分的藥理研究都具有重要意義。

高速逆流色譜(HSCCC)是不需要固態(tài)載體的液-液分配色譜技術(shù)，相比傳統(tǒng)色譜法克服了固相載體對(duì)樣品造成的吸附損失、變性、耗時(shí)長、溶劑消耗量大、分離效率低等缺點(diǎn)，該法操作簡便、快速、高效，已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化[5-9]。本研究采用硅膠柱色譜法對(duì)白首烏根皮粗提物進(jìn)行初步純化，然后對(duì)所得組分分別采用HSCCC進(jìn)行分離制備，實(shí)現(xiàn)了對(duì)白首烏中苯乙酮類化合物的快速、有效的分離，為白首烏根皮的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

1 儀器與材料

TBE300A型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)、多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑1.6 mm，分離體積300 mL，β值為0.47～0.73)、TBP泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)、8823B-紫外檢測(cè)器(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限司)、3057-11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)；Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)[配有光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)，美國Waters公司]；Varian INOVA-600核磁共振波譜儀(Varian公司，美國)；硅膠柱直徑2.5 cm。

高效液相色譜所用乙腈為色譜純 (美國天地公司)，水為娃哈哈純凈水；硅膠柱色譜和HSCCC分離用溶劑均為分析純(濟(jì)南巨業(yè)化學(xué)試劑有限公司)，所用水為過濾蒸餾水；硅膠(200～300目) 及GF254硅膠板(青島海洋化工廠)。白首烏藥材來自泰山白首烏種植基地(泰安)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)徐凌川教授鑒定為蘿藦科泰山白首烏CynanchumbungeiDecne的根皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 白首烏根皮粗提物的制備

稱取干燥的泰山白首烏根皮100 g，粉碎并過20目篩，加入95%乙醇800 mL，加熱回流提取3次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇味。加蒸餾水稀釋至150 mL，先用等體積的石油醚脫脂3次，再用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓蒸干，得到粗提物8.7 g，用于進(jìn)一步的分離制備，其HPLC色譜圖如圖1所示。

2.2 硅膠柱色譜初步分離

白首烏粗提物中的各成分含量差別較大，尤其是化合物5的含量較多，直接以白首烏粗提物進(jìn)行HSCCC分離時(shí)，化合物5會(huì)干擾其他組分的純度，所以本實(shí)驗(yàn)考慮通過硅膠柱色譜將目標(biāo)成分進(jìn)行初步純化，再分別進(jìn)行HSCCC分離制備。

取2.5 g粗提物經(jīng)硅膠柱色譜初步分離。先用500 mL石油醚-乙酸乙酯(95∶5)沖洗，再用石油醚-乙酸乙酯(75∶25)洗脫，并收集該部分的洗脫液，減壓蒸干得組分A 320 mg。當(dāng)洗脫液接近無色時(shí)，換用100%乙酸乙酯沖洗，所收集的洗脫液減壓蒸干得組分B 660 mg，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。組分A和B的HPLC色譜圖如圖1所示。

2.3 HSCCC溶劑體系的選擇

在高速逆流色譜中，合適的溶劑體系是獲得理想分離的關(guān)鍵。一般而言，對(duì)HSCCC最合適的分配系數(shù)KD值的范圍是0.5～2。若KD小于0.5，則出峰時(shí)間太快，組分峰之間的分離較差。若KD大于2.0，則出峰時(shí)間較長，峰形變寬[10]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)所分離化合物的理化性質(zhì)，考察了石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水兩相溶劑體系，調(diào)整溶劑體積比并測(cè)定各目標(biāo)化合物的KD值，結(jié)果見表1。發(fā)現(xiàn)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4.5∶5.5)體系比較適合分離，以白首烏粗提物作為樣品進(jìn)行HSCCC分離，所得的各成分經(jīng)HPLC分析，純度不高，且主要受化合物5影響。故運(yùn)用硅膠柱進(jìn)行初步分離，將粗提物分成組分A、B兩部分，適度調(diào)整HSCCC溶劑體系，最終確定組分A的溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4.5∶5.5,V/V)，組分B的溶劑體系為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶3∶7,V/V)。

注：A.粗提物；B.組分A；C.組分B；D.化合物1；E.化合物2；F.化合物3；G.化合物4；H.化合物5。圖1 白首烏根皮粗提物及提取的化合物HPLC圖

表1 5個(gè)化合物在不同配比體系中的分配系數(shù)

2.4 HSCCC分離制備

在分液漏斗中配制石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶4.5∶5.5,V/V)兩相溶劑體系，約2000 mL，充分振搖后靜置分層，將上相和下相分離后，超聲脫氣15 min，備用。準(zhǔn)確稱取組分A 260 mg，用上下相各5 mL振蕩溶解，以備HSCCC分離。

在分液漏斗中配制石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(4∶6∶3∶7,V/V)兩相溶劑體系，約1800 mL，并劇烈振蕩，靜置分層，將上相和下相分離后，超聲脫氣15 min，備用。準(zhǔn)確稱取組分B 300 mg，用上下相各6 mL振蕩溶解，以備HSCCC分離。

首先將脫氣的上相(固定相)以15 mL·min-1的速度泵入HSCCC分離管，待固定相充滿整個(gè)分離管后，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速至850 r·min-1，同時(shí)以2.0 mL·min-1的速度泵入下相(流動(dòng)相)，待有流動(dòng)相從分離柱出口流出時(shí)，表明兩相溶劑在分離管中已達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)，由進(jìn)樣閥注入樣品溶液，并打開檢測(cè)器和記錄儀，檢測(cè)波長調(diào)為254 nm，根據(jù)色譜圖手動(dòng)接收目標(biāo)成分,分離結(jié)果如圖2所示。從260 mg組分A中分離制備得到對(duì)苯二酚3.9 mg (1)、4-羥基苯乙酮17.1 mg (2)、2，5-二羥基苯乙酮13.3 mg (3)和2，4-二羥基苯乙酮21.0 mg (4)；從300 mg組分B分離得到白首烏二苯酮136 mg (5)。

注：A.組分A;B.組分B;1.對(duì)二苯酚；2.4-羥基苯乙酮；3.2，5-二羥基苯乙酮；4.2，4-二羥基苯乙酮；5.白首烏二苯酮。圖2 組分A和組分B的高速逆流色譜圖

2.5 HPLC檢測(cè)分析

HPLC條件：Warters Symmetry RP18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，線性梯度洗脫程序：0～20 min，30～100% A；20～30 min，100% A。流速：1.0 mL·min-1，DAD檢測(cè)波長范圍：200～400 nm。

采用上述的色譜條件，對(duì)分得的各成分進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖1所示。用峰面積歸一化法測(cè)得化合物1～5的純度分別為97.0%、96.6%、99.2%、99.7%和99.5%。

2.6 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色結(jié)晶(CH3OH)；1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ：6.63(2H，s)；13C-NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ：149.7，115.6。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定該化合物為對(duì)苯二酚。

化合物2：無色針晶(CH3OH)；1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ：2.54 (3H，s)，6.8 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3，5)，7.91 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2，6)；13C-NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ：26.3 (COCH3)，115.7 (C-3，5)，128.0 (C-1)，131.1 (C-2，6)，162.6 (C-4)，198.9 (C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]的數(shù)據(jù)基本一致，所以確定化合物2為4-羥基苯乙酮。

化合物3：黃色針晶(CH3OH)；1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ：6.79 (1H，d，J=8.9 Hz，H-3)，7.03 (1H，dd，J=8.8 Hz，2.8 Hz，H-4)，7.23 (1H，d，J=2.7 Hz，H-6)，2.60 (3H，s)；13C-NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ：26.2 (COCH3)，115.7 (C-3)，121.7 (C-4)，126.1 (C-1)，151.0 (C-5)，152.5 (C-2)，199.9 (C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物3為2，5-二羥基苯乙酮。

化合物4：淡黃色針晶(CH3OH)；1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ：2.53 (3H，s)，7.72 (1H，d，J=8.6 Hz，H-6)，6.26 (1H，d，J=2.3 Hz，H-3)，6.39 (1H，dd，J=8.7 Hz，2.，H-5)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ：26.6(COCH3)，105.0(C-3)，108.9(C-5)，112.0 (C-1)，132.1(C-6)，164.3(C-4)，166.0(C-2)，202.0(C=O)。該化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]的數(shù)據(jù)基本一致，所以確定化合物4為2，4-二羥基苯乙酮。

化合物5：淡黃色針晶(CH3OH)；1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ：2.20 (3H，s)，2.57 (3H，s，COCH3)，6.50 (1H，d，J=8.9 Hz)，6.81 (1H，d，J=8.7 Hz)，6.94 (1H，d，J=8.7 Hz)，7.78 (1H，d，J=8.9 Hz)；13C-NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ：26.3 (C-5)，30.9 (C-10)，107.8 (C-5)，111.6 (C-1)，112.7 (C-1)，117.8 (C-1′)，116.1 (C-3′)，118.4 (C-4′)，130.2 (C-6′)，132.4 (C-4)，147.3 (C-2′)，148.3 (C-5′)，162.1 (C-6)，162.6 (C-2)，203.3 (C-8)，203.1 (C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]的白首烏二苯酮數(shù)據(jù)基本一致，確定化合物5為白首烏二苯酮。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用硅膠柱聯(lián)合HSCCC的方法從白首烏根皮中分離制備得到5個(gè)化合物，其純度均在95%以上。結(jié)果表明，這兩種技術(shù)的結(jié)合能有效地分離制備苯乙酮類化合物，為苯乙酮類物質(zhì)的進(jìn)一步研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本方法簡便、高效、快速，為其他天然產(chǎn)物的分離制備提供了參考。

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SeparationandPurificationofAcetophenonesfromCynanchumbengeiDecneRootBarkbyCombinationofSilicaGelandHigh-speedCounter-currentChromatography

LIHuaizhi1，2，XULingchuan1，WANGXiao2，LIJia1*，YANGPeng3，YANGBingtian3

( 1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355,China；2.ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014,China；3.SanfengBiologicalEngineeringTechnologyCo.Ltd.，Jinan250014，China)

Objective：To develop a method for separation and purification of acetophenones fromCynanchumbengeiDecne root bark by combination of silica gel and high-speed counter-current chromatography (HSCCC).MethodsThe crude extract ofC.bengeiwas separated by silica gel chromatography and part A and B were obtained.Then，part A and B were separated by HSCCC with a two-phase solvent system composed of petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (4∶6∶4.5∶5.5，V/V) and (4∶6∶3∶7，V/V)，respectively.ResultsFrom 260 mg of part A，four compounds with p-dihydroxybenzene 3.9 mg (1)，4-hydroxyacetophenone 17.1 mg (2)，2，5-di-hydroxyacetophenone 13.3 mg (3) and 2，4-dihydroxyaceto-phenone 21.0 mg (4) were obtained.And from 300 mg of part B，baishouwubenzoph-enone 136 mg (5) were obtained.The compounds purity determined by HPLC were 97.0%，96.6%，99.2%，99.7%，99.5%，respectively.ConclusionThe established method is simple and efficient.It can be used for separation of acetophenones fromC.bengei.The results provide a reference basis forC.bengeiroot bark development and utilization.

Silica gel chromatography；high-speed counter-current chromatography (HSCCC)；acetophenones；CynanchumbungeiDecne root bark

2015-08-31)

國家自然科學(xué)基金(81373941)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2012HM047)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014G2X219003)；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201407002)

*

李佳，教授，研究方向：中藥質(zhì)量控制與資源研究；E-mail：ljytl7172@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.003