鼠李糖乳桿菌對互隔交鏈孢的抑制作用研究

馬歡歡,呂欣然,繆璐歡,杜靜芳,白鳳翎,葛永紅,勵(lì)建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

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鼠李糖乳桿菌對互隔交鏈孢的抑制作用研究

馬歡歡,呂欣然,繆璐歡,杜靜芳,白鳳翎*,葛永紅,勵(lì)建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

目的:篩選對互隔交鏈孢具有良好拮抗作用的乳酸菌菌株。方法:采用菌餅法篩選乳酸菌優(yōu)良菌株。采用酸性實(shí)驗(yàn)和熱處理實(shí)驗(yàn)分析拮抗特性,利用氣相測定乳酸菌無細(xì)胞上清液(CFS)中有機(jī)酸的含量,掃描電鏡分析細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性。結(jié)果:從4株乳酸菌中篩選出1株對互隔交鏈孢具有較強(qiáng)抑制作用的鼠李糖乳桿菌RH-11,抑菌率為93.41%。在pH3.0～7.0時(shí)具有抑菌活性,抑菌物質(zhì)對熱不穩(wěn)定。經(jīng)氣相色譜分析RH-11 CFS中乳酸、乙酸和苯乳酸含量分別為109.225 μg/mL、7.334 μg/mL和3.712 μg/mL,對互隔交鏈孢抑制作用的貢獻(xiàn)率分別為68.90%、20.03%和11.07%。掃描電鏡結(jié)果表明RH-11 CFS處理互隔交鏈孢孢子的細(xì)胞膜完整性被破壞。結(jié)論:鼠李糖乳桿菌RH-11抑制互隔交鏈孢的物質(zhì)主要為乳酸、乙酸和苯乳酸,抑制作用是破壞了孢子的完整性。

鼠李糖乳桿菌,互隔交鏈孢,抑制作用,有機(jī)酸

互隔交鏈孢(Alternariaalternate)廣泛存在于土壤、谷物、水果和蔬菜等自然環(huán)境中,污染水果蔬菜后可產(chǎn)生互隔交鏈孢酚、細(xì)交鏈孢菌酮酸和互隔交鏈孢酚單甲醚等毒素,引起蘋果、柑橘和杏等水果的黑斑病和軟腐病[1-2]。針對互隔交鏈孢引起的采后果蔬病害,利用化學(xué)殺菌劑可有效控制這種真菌的侵染,但由于藥物殘留、產(chǎn)生抗藥性和污染環(huán)境等問題,應(yīng)用受到限制。與化學(xué)殺菌劑相比,生物防腐劑具有無殘留、無毒副作用、無損環(huán)保等優(yōu)勢。應(yīng)用生物制劑控制互隔交鏈孢引起的果蔬采后病害研究倍受青睞,Gupta等[3]利用海南蒲桃果實(shí)的醇提取物對互隔交鏈孢菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響,結(jié)果表明,當(dāng)濃度7.5 mg/mL醇提物處理時(shí),菌絲生長完全被抑制,其抑制孢子萌發(fā)的小抑菌濃度為0.039 mg/mL。

乳酸菌是公認(rèn)的GRAS級生物防腐劑,通過營養(yǎng)物和生態(tài)位競爭、產(chǎn)生各種拮抗性代謝產(chǎn)物和酸性物質(zhì)等方式抑制細(xì)菌和真菌的生長繁殖[4-6]。乳酸菌抑制植物源性真菌的大部分研究主要針對飼料和食品中的青霉和曲霉,Vijayakumar等[7]從意大利黑麥草飼料中分離植物乳桿菌(LactobacillusplantarumKCC-24),對煙曲霉、青霉、灰霉菌和尖孢鐮刀菌的抑菌率分別為73.43%、59.04%、40.23%和52.47%。Lan等[8]從發(fā)酵冬瓜中分離出85株乳酸菌,其中食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria861006)在6 d內(nèi)能夠有效抑制青霉的生長。Cortés等[9]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌(Lb.casei),鼠李糖乳桿菌(Lb.rhamnosus)和嗜酸乳桿菌(Lb.acidophilus)等乳酸菌對黃曲霉、炭疽、擴(kuò)展青霉和灰霉菌4種真菌具有顯著的抑菌效果,分析表明抑菌成分主要是3-苯乳酸。

目前尚無乳酸菌對互隔交鏈孢抑制作用的研究報(bào)道。本文以植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、瑞士乳桿菌和米酒乳桿菌為供試菌,以自霉變香瓜分離的互隔交鏈孢為目標(biāo)菌,采用菌餅法篩選出抑菌效果好的乳酸菌菌株,并分析其主要抑菌活性物質(zhì)及生理特性和對霉菌孢子的影響。探究應(yīng)用乳酸菌控制互隔交鏈孢引起水果黑斑病和軟腐病的可能性,為研發(fā)高效無毒、無殘留、無損的拮抗果蔬腐敗性真菌的乳酸菌生物防腐劑奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

乳酸菌菌株植物乳桿菌(Lb.plantarumC10)、鼠李糖乳桿菌(Lb.rhamnosusRH-11)、瑞士乳桿菌(Lb.helveticusLH-9)、米酒乳桿菌(Lb.sakeDL-11)由本實(shí)驗(yàn)室保藏;互隔交鏈孢(AlternariaalternateBd-12)自腐爛的香瓜果實(shí)分離。

MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;脫脂乳碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司;胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶華藍(lán)化學(xué)有限公司;戊二醛、苯乳酸、乳酸、乙酸、丙酸等標(biāo)品sigma公司。

MJ-250霉菌培養(yǎng)箱上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;DL-CJ-2N超級潔凈工作臺北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;SPX-250智能生化培養(yǎng)箱寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠;5804R冷凍高速離心機(jī)德國Eppendorf公司;GI54DS高壓滅菌鍋致微儀器有限公司;ZD-85氣浴恒溫振蕩器金壇市科析儀器有限公司;IKA Vortex GENIUS3振蕩器德國IKA公司;安捷倫6890N氣相色譜儀安捷倫公司;島津GC2010氣相色譜儀日本島津公司;E-1045鍍金儀、S-4800掃描電鏡日本日立公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌無細(xì)胞上清液(cell-free supernatant,CFS)的制備將保藏于-80 ℃的乳酸菌菌株分別接種10%脫脂乳37 ℃活化后,在MRS 平板上連續(xù)培養(yǎng)3代至正常代謝水平。挑取活化后乳酸菌單菌落接種MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,菌懸液經(jīng)6000×g 4 ℃離心10 min,上清液經(jīng)0.45 μm膜過濾獲得乳酸菌CFS,4 ℃冰箱保存。

1.2.3乳酸菌對互隔交鏈孢的抑制作用將乳酸菌CFS和45 ℃的PDA培養(yǎng)基按1∶9比例混勻后倒入滅菌平皿。待冷卻后,用Φ7 mm打孔器取培養(yǎng)7 d的互隔交鏈孢菌落邊緣制成的菌餅,在PDA培養(yǎng)基中央點(diǎn)種。以MRS液體培養(yǎng)基作對照,28 ℃避光培養(yǎng)7 d。每天觀察菌絲生長,當(dāng)對照組平板中菌絲長滿平板表面時(shí),應(yīng)用游標(biāo)卡尺交叉測量實(shí)驗(yàn)組菌落生長直徑(mm),并按下式計(jì)算乳酸菌CFS對互隔交鏈孢的抑制率。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-原菌餅直徑)×100

1.2.4影響乳酸菌CFS抑制互隔交鏈孢因素pH實(shí)驗(yàn):用1.0 mol/L NaOH和1.0 mol/L HCl將乳酸菌CFS分別調(diào)至pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0,同時(shí)以CFS作為對照,按1.2.3方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

熱處理實(shí)驗(yàn):取乳酸菌CFS分別經(jīng)50 ℃處理30 min,100 ℃處理30 min,121 ℃處理15 min,同時(shí)以乳酸菌CFS作為對照,按1.2.3方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5有機(jī)酸的測定乙酸、乳酸和丙酸:參照Yuan等[11]方法并稍作修改,應(yīng)用安捷倫6890N氣相色譜儀,色譜條件:色譜柱為CNW CD-ACIDWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×25 μm);升溫程序:初溫110 ℃,以10 ℃/min升至150 ℃,保持5 min,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持15 min;進(jìn)樣口溫度為280 ℃;FID檢測器溫度為;H2流速30 mL/min;N2流速30 mL/min;空氣流速300 mL/min;分流比為15∶1;進(jìn)樣量為1 μL。采用直接進(jìn)樣方式,在線性范圍內(nèi),用外標(biāo)法峰面積進(jìn)行定量。

苯乳酸:Zhang等[12]方法并稍作修改,移取標(biāo)樣及待測樣品至具塞玻璃管中,加入吡啶搖動使其溶解后,加入BSTFA硅烷化試劑,在100 ℃靜置30 min,待測GC;采用島津GC2010氣相色譜儀。色譜條件:色譜柱:Rtx-5石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×25 μm);升溫程序:初溫180 ℃,保持20 min,以20 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;進(jìn)樣口溫度為280 ℃;FID檢測器溫度為300 ℃;H2流速30 mL/min;N2流速30 mL/min;空氣流速300 mL/min;分流比為20∶1;進(jìn)樣量1 μL。在線性范圍內(nèi),用外標(biāo)法峰面積進(jìn)行定量。

表1　乳酸菌CFS對互隔交鏈孢的抑菌率

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;a、b、c和d表示不同菌株間在0.05水平存在顯著性差異。

1.2.6有機(jī)酸抑菌活性分析根據(jù)1.2.5測定的結(jié)果,應(yīng)用與乳酸菌CFS中相同濃度的丙酸、乳酸、乙酸、苯乳酸和四種混合酸分別按1.2.3方法進(jìn)行抑制作用實(shí)驗(yàn),測定抑制率。同時(shí),以乳酸菌CFS作為對照。

1.2.7掃描電鏡觀察乳酸菌CFS對互隔交鏈孢孢子作用參照Akocak方法[13]并修改,取1.0 mL 1.0×105孢子/mL互隔交鏈孢的孢子懸液加入1.5 mL EP管中,4 ℃ 12000×g離心10 min后,去上清液。在EP管中加入1.0 mL的乳酸菌CFS,對照組添加1.0 mL無菌水,置于25 ℃培養(yǎng)7 d。4 ℃ 12000×g離心10 min,收集孢子,孢子用0.1 mol/L PBS(pH7.2)洗滌3次,后加入1.0 mL 2.5%戊二醛4 ℃固定13 h。再用pH5.6的PBS沖洗2次,每次5 min。洗滌后孢子用0.5 mL無菌去離子水懸浮,用膠頭滴管吸取1滴于潔凈蓋玻片上,置于空氣中干燥,真空噴金并鏡檢。

1.2.8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測定3次,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 18.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性分析,采用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2　結(jié)果與討論

2.1乳酸菌對互隔交鏈孢的拮抗作用

表1是4株乳酸菌CFS對互隔交鏈孢抑菌結(jié)果,從中可以看出,菌株RH-11抑菌率為93.41%,作用最強(qiáng);LH-9次之,抑菌率為88.35%;菌株C10和DL-11相對較弱,抑菌率分別為77.65%和60. 27%。圖1是菌株RH-11 CFS對互隔交鏈孢的拮抗效果,圖中實(shí)驗(yàn)組互隔交鏈孢生長在很小的范圍內(nèi),而對照組互隔交鏈孢鋪滿平板,表明菌株RH-11的CFS對互隔交鏈孢生長有較強(qiáng)的拮抗作用。因此,選取抑菌活性較好的菌株RH-11進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

圖1　鼠李糖乳桿菌RH-11對互隔交鏈孢的拮抗效果Fig.1　Antagonistic effects of Lb. rhamnosus RH-11 against A. alternate

2.2乳酸菌CFS抑制互隔交鏈孢作用的影響因素

2.2.1pH實(shí)驗(yàn)pH是影響乳酸菌CFS抑菌活性的主要因素之一,一般乳酸菌在酸性條件下,對真菌的抑制作用較強(qiáng),隨著pH的上升,當(dāng)達(dá)到弱堿性時(shí),其抑菌作用逐漸喪失[14]。圖2是菌株RH-11 CFS在不同pH條件下對互隔交鏈孢抑制結(jié)果,從中可以看出,在pH 3.0時(shí),菌株RH-11 CFS 的抑菌率最大為96.12%,隨著pH的升高,抑菌率逐漸降低,pH 7.0時(shí),抑菌率為25.64%。結(jié)果表明,乳酸菌的抑菌活性成分在酸性條件對互隔交鏈孢具有較強(qiáng)的抑制作用。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌(Lb.caseiAST18)抑菌活性物質(zhì)在低于pH4.0時(shí)對青霉具有較強(qiáng)的抑菌作用,隨著pH逐漸升高,抑菌活性呈下降的趨勢,當(dāng)pH7.0時(shí),抑菌率為11.87%,本文與文獻(xiàn)[15]的研究結(jié)果相似。

圖2　pH對鼠李糖乳桿菌RH-11 CFS抑菌活性的影響Fig.2　Effect of pH on the antifungal activity of CFS of Lb. rhamnosus RH-11

2.2.2熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)溫度也是影響菌株RH-11 CFS對互隔交鏈孢抑菌率的因素。圖3是菌株RH-11 CFS經(jīng)熱處理后對互隔交鏈孢抑菌率變化結(jié)果,從中可以看出,隨溫度的升高,抑菌率呈下降趨勢,對照組CFS抑菌率最高為93.41%,在50 ℃時(shí),抑菌率較大為76.24%低于對照組,到121 ℃時(shí)抑菌率降低至38.47%。結(jié)果表明,乳酸菌的抑菌活性物質(zhì)不具有良好的熱穩(wěn)定性。Li等[15]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌(Lb.caseiAST18)CFS中抑制青霉的活性物質(zhì)對熱敏感,經(jīng)高效液相色譜分析得出,抑菌物質(zhì)主要為乳酸、乙酸和環(huán)肽,與本文結(jié)果相似。

圖3　熱處理鼠李糖乳桿菌RH-11CFS抑菌活性的影響Fig.3　Effect of heat treatment on the antifungal activity of CFS of Lb. rhamnosus RH-11

2.3有機(jī)酸測定

表2是RH-11 CFS中乙酸、乳酸、丙酸和苯乳酸含量及其對互隔交鏈孢的抑菌結(jié)果。從中可以看出,菌株RH-11 CFS中乳酸含量最高為109.225 μg/mL,其次是乙酸折菌率為7.334 μg/mL,苯乳酸含量較低為3.712 μg/mL,丙酸未檢出。三種有機(jī)酸對互隔交鏈孢均具有抑制作用,乳酸抑菌率較高為71.38%,貢獻(xiàn)率為68.90%;其次是乙酸為20.79%,貢獻(xiàn)率20.03%;苯乳酸折菌率為11.65%,貢獻(xiàn)率為11.07%。不同有機(jī)酸在RH-11 CFS中含量不同,因此抑菌率和貢獻(xiàn)率也不同。按照RH-11 CFS中有機(jī)酸含量不同進(jìn)行復(fù)配的酸對互隔交鏈孢抑菌率高于對照組為100%,由于混合酸的pH 1.88明顯低于菌株RH-11 CFS pH 3.87,可能是有機(jī)酸在CFS中與其它物質(zhì)存在拮抗作用降低了抑菌活性[15]。通過以上實(shí)驗(yàn)表明,乳酸菌RH-11對互隔交鏈孢具有抑制作用的主要是酸性物質(zhì)。

表2　鼠李糖乳桿菌RH-11CFS有機(jī)酸及抑菌率分析結(jié)果

Corsetti等[16]研究表明,舊金山乳桿菌(Lb.sanfranciscoCB1)對鐮刀菌、青霉和念珠菌具有較強(qiáng)的抑制作用,其抑菌活性物質(zhì)主要為己酸、丙酸、丁酸和戊酸以協(xié)同的方式抑制霉菌的生長。Prema等[17]從青貯牧草中分離一株具有廣譜性的植物乳桿菌(Lb.plantarum),通過核磁共振等方法對抑菌物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析得出,抑菌物質(zhì)為3-苯乳酸。Gerez等[18]篩選出4株對曲霉,鐮刀菌和青霉具有較強(qiáng)抑制作用的菌株植物乳桿菌(Lb.plantarumCRL 778)、羅伊氏乳桿菌(Lb.reuteriCRL 1100)、短乳桿菌(Lb.brevisCRL 772)和Lb.brevisCRL 796,分析表明抑菌物質(zhì)主要為乙酸和苯乳酸。

2.4掃描電鏡觀察乳酸菌CFS對互隔交鏈孢孢子的影響

圖4是互隔交鏈孢的孢子經(jīng)菌株RH-11 CFS處理7 d后用掃描電鏡觀察的結(jié)果,從中可以看出,經(jīng)菌株RH-11 CFS處理的孢子結(jié)構(gòu)完整性被破壞,表面褶皺模糊不清,四周泛有白光,且孢子一端破裂有內(nèi)容物流出,可能是CFS中有機(jī)酸H+與孢子細(xì)胞膜上脂肪酸存在化學(xué)間相互作用導(dǎo)致磷脂膜發(fā)生改變,降低膜的流動性,從而導(dǎo)致磷脂雙分子層損壞細(xì)胞崩塌,進(jìn)一步使細(xì)胞內(nèi)部混合物泄露[19-20],對照組互隔交鏈孢孢子形態(tài)完整,一端呈桿狀且表面光滑無白光,另一端則為不規(guī)則的多態(tài)形,表面有許多明顯褶皺。結(jié)果表明,菌株RH-11 CFS對互隔交鏈孢孢子具有損壞作用。Da等[19]應(yīng)用2.5 mmol/L的水楊酸處理擴(kuò)展青霉孢子5 min,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組60%的孢子出現(xiàn)熒光性,部分細(xì)胞膜被損壞出現(xiàn)蛋白質(zhì)泄露,對照組不具有熒光性,孢子細(xì)胞膜完整無損無泄露,與本文結(jié)果相似。

圖4　鼠李糖乳桿菌RH-11對互隔交鏈孢孢子的影響Fig.4　Effect of Lb. rhamnosus RH-11 CFS on the spores of A. alternate

3　結(jié)論

本文從4株乳酸菌中篩選到1株對互隔交鏈孢具有較強(qiáng)抑菌作用的鼠李糖乳桿菌RH-11,其抑菌率到達(dá)93.41%。菌株RH-11 CFS在pH3.0時(shí)抑菌率最大,為96.12%。在pH3.0～7.0均具有抑菌活性,經(jīng)121 ℃處理15 min后抑菌率降低至38.47%,表明抑菌活性物質(zhì)不具有良好的熱穩(wěn)定性。有機(jī)酸分析表明菌株RH-11 CFS中乳酸含量最高,其次是乙酸和苯乳酸。乳酸抑菌率較高為71.38%,貢獻(xiàn)率占68.90%,其次乙酸和苯乳酸也具有一定的抑制作用。按照菌株RH-11 CFS中測得有機(jī)酸的含量進(jìn)行復(fù)配的混合酸對互隔交鏈孢抑菌率高于對照組,為100%,表明乳酸菌RH-11對互隔交鏈孢具有抑菌作用的主要是酸性物質(zhì)。掃描電鏡結(jié)果表明菌株RH-11 CFS可破壞互隔交鏈孢孢子細(xì)胞的完整性,使其內(nèi)容物泄漏,從而抑制其生長和繁殖。通過實(shí)驗(yàn)研究表明乳酸菌對互隔交鏈孢具有抑制作用,抑菌物質(zhì)主要為酸性代謝產(chǎn)物,因此,乳酸菌可作為控制水果中互隔交鏈孢導(dǎo)致的黑斑病和軟腐病的生物防腐劑的重要資源。

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Effects of the inhibitory activity ofLactobacillusrhamnosusagainstAlternariaalternate

MA Huan-huan,LV Xin-ran,MIAO Lu-huan,DU Jing-fang,BAI Feng-ling*,GE Yong-hong,LI Jian-rong

(College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province; National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products;Jinzhou 121013,China)

Objective:To isolate lactic acid bacteria(LAB)with outstanding inhibitory activity againstAlternariaalternate. Methods:LAB with inhibitory activity againstA.alternatewas screened using the bacteria-cake method. The antibacterial substance was analyzed by acid test,heat-treated test,the contents of organic acids were analyzed by the gas chromatography. The integrity of cellular structure was observed by scanning electron microscope. Results:The inhibitory rate ofLactobacillusrhamnosusRH-11 toA.alternatewas 93.41%. The inhibitory substance was instability after thermal treatment and effective within pH 3.0～7.0. The contents of lactic acid,acetic acid and phenyl lactic acid in CFS of strain RH-11 were 109.225 μg/mL,7.334 μg/mL and 3.712 μg/mL using gas chromatography analysis,and the contribution rate of antagonistic activity toA.alternatewere 68.90%,20.03% and 11.07%,respectively. The scanning electron microscope images revealed that the cell membrane of the spores ofA.alternatewas damaged by CFS treatment. Conclusion:Lactic acid,acetic acid and phenyl lactic acid were the main inhibitory substances,which can damage the integrity of cell.

Lactobacillusrhamnosus;Alternariaalternate;inhibition;organic acids

2016-03-18

馬歡歡(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制,E-mail：mahuanhuan14@163.com。

白鳳翎(1964-)男，博士，教授，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制和食品微生物學(xué),E-mail：baifling@163.com。

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃課題(2015BAD17B05)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)17-0180-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.027