海參精多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗腫瘤活性

王　婷,劉京熙,張　健,3,劉　昕,趙云蘋,井月欣,王共明,王茂劍,3,4,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 200000;2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院,山東煙臺(tái) 264006;3.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東煙臺(tái) 264006;4.山東省淡水漁業(yè)研究院,山東濟(jì)南 250013)

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海參精多糖提取工藝優(yōu)化及其體外抗腫瘤活性

王婷1,2,劉京熙2,張健2,3,劉昕2,趙云蘋2,井月欣2,王共明2,王茂劍2,3,4,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 200000;2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院,山東煙臺(tái) 264006;3.山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東煙臺(tái) 264006;4.山東省淡水漁業(yè)研究院,山東濟(jì)南 250013)

為確定海參精多糖(SCSP)提取的最佳條件,并評(píng)價(jià)其體外抗腫瘤活性,在酶篩選和單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以多糖得率為指標(biāo),選擇加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間為影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),并通過(guò)MTT法檢測(cè)海參精粗多糖(SCSCP)及其純化組分(SCSP A1、SCSP A2)對(duì)人子宮頸癌Hela細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果表明,SCSCP的最佳提取條件為:木瓜蛋白酶、加酶量3%、酶解溫度49 ℃、酶解時(shí)間6 h,在此條件下其得率可達(dá)10.643‰。MTT法體外評(píng)價(jià)顯示,SCSCP及其純化組分對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間的Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出不同的抑制效果,其中SCSP A2對(duì)兩種細(xì)胞的抑制率最高。當(dāng)SCSP A2濃度為10 mg/mL時(shí),對(duì)培養(yǎng)72 h的Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的抑制率分別為80.28%和83.11%,表明SCSP具有顯著的體外抗腫瘤活性。

海參精,多糖,酶解,響應(yīng)面法,抗腫瘤

海參為棘皮動(dòng)物門海參綱動(dòng)物,分布于熱帶區(qū)和溫帶區(qū),其生存歷史悠久[1],具有較高的食用和藥用價(jià)值,自古就是一種重要的滋補(bǔ)保健品,被列于“海八珍”之首[2]。隨著人們認(rèn)識(shí)和科學(xué)技術(shù)水平的提高,海參中越來(lái)越多的活性物質(zhì)受到廣泛關(guān)注,其中海參多糖作為重要的活性物質(zhì)之一,對(duì)其研究正在逐漸系統(tǒng)和深入。有研究表明,海參多糖具有抗血栓[3]、抗凝血[4]、抗氧化[5]等活性作用[3-5]。

通常,海參多糖以與蛋白非共價(jià)結(jié)合的方式存在于海參體壁、內(nèi)腔以及其生殖腺中,其中生殖腺包括海參卵和海參精。海參多糖的獲得需要采用適當(dāng)?shù)奶崛》椒▽⒑⒍嗵菑牡鞍锥嗵侵嗅尫臶6]。目前海參多糖提取方法多采用酶解法和化學(xué)水解法[7],兩種方法都是以破壞蛋白和多糖的結(jié)合為前提,化學(xué)水解法通過(guò)稀NaOH 或KOH破壞蛋白質(zhì)分子,再進(jìn)一步利用海參多糖的水溶性和醇不溶性獲得多糖,但通過(guò)化學(xué)水解法提取多糖可能會(huì)引起海參多糖的降解,破壞其結(jié)構(gòu)。相比而言,酶解法是提取海參多糖的有效方法,其作用條件溫和且酶解效果理想[8]。

目前關(guān)于海參多糖提取工藝和活性評(píng)價(jià)的研究多集中在海參體壁[9]、海參腸道[10],對(duì)海參生殖腺多糖鮮有報(bào)道,且未見關(guān)于海參精多糖的研究報(bào)道。因此,本研究以海參精為研究對(duì)象,對(duì)酶解法提取海參精多糖工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),通過(guò)體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)分析海參精多糖的抗腫瘤活性,進(jìn)一步提高海參副產(chǎn)物利用率,旨在為海參精的開發(fā)和綜合利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

海參精購(gòu)自煙臺(tái)山水海產(chǎn)有限公司,取自仿刺參;木瓜蛋白酶(100萬(wàn) U/g)南寧龐博生物工程有限公司;復(fù)合蛋白酶(1.5 AU/g)丹麥諾維信公司;人子宮頸癌Hela細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);DEAE-纖維素、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、小牛血清美國(guó)Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基美國(guó)Gibco公司;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板Costar公司;苯酚、硫酸、氯化鈉、無(wú)水乙醇國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DS-1高速組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠;TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)湖南湘儀儀器有限公司;TU-1810SPC紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司;Hel-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó)Heidolph公司;FD-2A真空冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;切向流超濾系統(tǒng)Pall Minimate美國(guó)Pall公司;GalaxyB CO2培養(yǎng)箱英國(guó)RS Biotech公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SCSCP提取工藝流程海參精→勻漿→酶解→離心(取上清液)→抽濾→超濾(取大于10 ku)→濾液濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))→TCA除蛋白[11]→醇沉多糖→烘干→海參精粗多糖SCSCP。

1.2.2酶的篩選取10 g海參精勻漿液,選用木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的不同混合比例,在加酶量3%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間7 h條件下,測(cè)定酶解液中SCSCP的含量,比較兩種酶不同混合比例對(duì)SCSCP提取效率的影響,選擇最佳用酶。

1.2.3SCSCP含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[12]測(cè)定酶解液中多糖濃度,并計(jì)算SCSCP得率。

多糖得率(%)=酶解液多糖濃度×稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量×酶解液體積×1000

1.2.4SCSCP提取工藝優(yōu)化

1.2.4.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)取10 g海參精勻漿液,選取加酶量(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%)、酶解溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)、酶解時(shí)間(3、4、5、6、7、8 h)三個(gè)因素分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察各個(gè)因素對(duì)酶解法提取SCSCP的影響,測(cè)定多糖含量并計(jì)算得率。

1.2.4.2響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理為基礎(chǔ)進(jìn)行三因素三水平的17組(每組三個(gè)平行)實(shí)驗(yàn),以SCSCP得率為響應(yīng)值研究加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間三個(gè)因素對(duì)SCSCP得率的影響,預(yù)測(cè)SCSCP提取的最佳條件,優(yōu)化SCSCP的提取工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1　響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平

1.2.5SCSCP的純化將SCSCP用蒸餾水復(fù)溶,進(jìn)一步進(jìn)行DEAE-離子交換層析分離。DEAE-纖維素凝膠裝柱平衡后,稱取200 mg SCSCP溶于6 mL去離子水中上樣,分別用水和不同濃度的NaCl溶液(0.25、0.5、0.75、1 mol/L)依次洗脫,每個(gè)梯度洗脫液用自動(dòng)部分收集器分開收集于試管中,用苯酚-硫酸法檢測(cè)各管在490 nm處的吸光值,將每個(gè)梯度較高吸光值對(duì)應(yīng)的流出液合并收集,透析、濃縮,真空冷凍干燥后獲得多糖組分[13-14]。

1.2.6體外抗腫瘤活性的測(cè)定

1.2.6.1細(xì)胞培養(yǎng)從液氮中取出細(xì)胞凍存管,立即放于37 ℃水浴中不停搖晃使其迅速融化,將凍存管消毒后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌超凈臺(tái)中,將凍存管中的細(xì)胞加入含有培養(yǎng)基的離心管中離心后收集細(xì)胞,加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶底80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.6.2抗腫瘤活性測(cè)定MTT比色法體外檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的存活率[15]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人子宮頸癌細(xì)胞Hela和人肝癌細(xì)胞HepG2,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后,用DMEM完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為 0.8～1.0×105個(gè)/mL,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),每孔100 μL,96孔板四周加相同體積的滅菌的PBS,于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)12 h,之后棄去原培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置樣品組、陰性對(duì)照組、空白組、陽(yáng)性對(duì)照組,向陰性對(duì)照組中加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)液100 μL,樣品組依次加入多糖濃度為10、5、2.5、1.25、0.626、0.3125 mg/mL的DMEM培養(yǎng)液100 μL,空白組無(wú)細(xì)胞只有DMEM完全培養(yǎng)液,陽(yáng)性對(duì)照組為20 μg/mL的5-氟尿嘧啶100 μL[16],每組6個(gè)平行孔,分別培養(yǎng)24、48、72 h。

培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)試劑,于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后吸去上清液,每孔加入100 μL DMSO,振蕩搖勻后避光反應(yīng)20 min,用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值(OD570)。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-樣品組OD值-空白組OD值/陰性對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003、OriginPro 8.6 和Design-Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。整理后的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、多重比較,顯著性水平為α=0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1酶的篩選

木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶是水產(chǎn)食品酶解實(shí)驗(yàn)最常用的兩種酶,其最適pH接近于海參生殖腺組織的初始pH,因此選取這兩種酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖1可知,木瓜蛋白酶的比重越大SCSCP得率越高,當(dāng)木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的混合比例為1∶0時(shí),SCSCP得率最高,因此選用木瓜蛋白酶單酶進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

圖1　不同混合比例多糖得率比較Fig.1　Polysaccharide yield comparation of different blending ratio

2.2酶解法提取SCSCP的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1加酶量對(duì)SCSCP得率的影響由圖2可知,隨著加酶量(0.5%～3%)的增多,SCSCP得率逐漸提高,因?yàn)楫?dāng)加酶量增加時(shí)酶與底物充分接觸,促進(jìn)了酶解反應(yīng)進(jìn)行。當(dāng)加酶量達(dá)到3%時(shí),多糖得率達(dá)到最高值,隨后當(dāng)加酶量大于3%后,多糖得率沒有顯著變化(p>0.05)。這主要是因?yàn)槊概c底物達(dá)到飽和,以至于提高加酶量并沒有提高得率。綜合考慮,選擇加酶量2%～4%作為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的因素值。

圖2　加酶量對(duì)SCSCP得率的影響Fig.2　Effect of enzyme dosage on the yield of SCSCP

2.2.2酶解溫度對(duì)SCSCP得率的影響由圖3可知,在酶解溫度20～50 ℃時(shí),多糖得率隨酶解溫度的升高而提高,多糖得率在50 ℃時(shí)達(dá)到最高值;當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),多糖得率呈下降趨勢(shì),這可能是因?yàn)闇囟仍诟哂?0 ℃時(shí),木瓜蛋白酶的活性受到影響而下降,這與陳濤等[17]研究得到的溫度對(duì)木瓜蛋白酶提取海參腸道多糖的影響規(guī)律一致。因此將提取溫度設(shè)定在40～60 ℃范圍作為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的因素值。

圖3　酶解溫度對(duì)SCSCP得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on the yield of SCSCP

2.2.3酶解時(shí)間對(duì)SCSCP得率的影響由圖4可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),酶與底物逐漸充分反應(yīng),SCSCP得率隨之增加,酶解時(shí)間為6 h時(shí)多糖得率最高;隨后增加酶解時(shí)間,多糖得率稍有下降,但通過(guò)單因素方差分析得知,在6 h后差異不顯著(p>0.05),因此選擇酶解時(shí)間為5～7 h作為響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的因素值。

圖4　酶解時(shí)間對(duì)SCSCP得率的影響Fig.4　Effect of extraction time on the yield of SCSCP

2.3酶解法提取SCSCP的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以加酶量(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)三個(gè)因素為自變量,SCSCP得率為響應(yīng)值尋找最佳測(cè)試條件,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合得到回歸模型方程為:

多糖得率=10.64-0.011A-0.12B+0.058C-0.29AB-0.27AC+0.38BC-1.28A2-0.53B2-1.00C2

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3　回歸方程方差分析表

注:**p<0.01,差異極顯著;*p<0.05,差異顯著。

2.3.2響應(yīng)曲面分析響應(yīng)面圖可直觀的反映因素之間的交互作用,響應(yīng)面有明顯的傾斜度表明因素對(duì)響應(yīng)值影響大。由圖5的三個(gè)響應(yīng)面圖可知,溫度的變化曲面比時(shí)間和加酶量的曲面更陡峭,加酶量的變化曲面相對(duì)來(lái)說(shuō)最平緩,這與方差分析結(jié)果相符合，且三個(gè)等高線為橢圓，表示三個(gè)因素兩兩交互作用顯著也與方差分析結(jié)果符合。

圖5　各因素交互作用對(duì)多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5　Response surface and contour plots showing the interactive effects of independent variables on polysaccharide yield

2.3.3最佳酶解工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)得到的最佳工藝條件為加酶量3.01%、酶解溫度48.86 ℃、酶解時(shí)間6.01 h,結(jié)合實(shí)際中的可操作性將酶解條件修改為加酶量3%、酶解溫度49 ℃、酶解時(shí)間6 h,通過(guò)三次平行實(shí)驗(yàn)得到多糖得率為10.643‰,和模型預(yù)測(cè)值10.649‰接近,說(shuō)明該模型具有指導(dǎo)意義。

2.4DEAE-離子交換層析結(jié)果

用去離子水和不同濃度NaCl溶液洗脫后的流出液用苯酚-硫酸法檢測(cè)得到兩個(gè)多糖組分,SCSP A1和SCSP A2,結(jié)果如圖6所示。

圖6　DEAE-離子交換層析分離結(jié)果Fig.6　Separation results of DEAE-cellulose chromatography

SCSP A1為0.25 mol/L NaCl溶液洗脫得到,其中多糖含量為40.03%,SCSP A2為0.5 mol/L NaCl溶液洗脫得到,其中多糖含量為45.27%。SCSP A1和SCSP A2都集中在鹽相中,表明得到的組分為酸性多糖[19]。有研究表明,海參體壁中的多糖是由-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-巖藻糖構(gòu)成的分支雜多糖或直接由L-巖藻糖所構(gòu)成的直鏈多糖,而且糖鏈上的部分羥基被硫酸酯化[20-21],說(shuō)明海參精多糖糖鏈構(gòu)成單位和化學(xué)修飾基團(tuán)可能與海參體壁中多糖相似。通過(guò)獲得SCSP A1和SCSP A2的洗脫液濃度對(duì)比可知,SCSP A1組分在離子交換柱中的綜合吸附效果低于SCSP A2組分,這也間接說(shuō)明SCSP A2中羧酸基團(tuán)和硫酸根的含量總和要高于SCSP A1。

2.5SCSP體外抗腫瘤活性分析

2.5.1SCSCP對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞增殖的影響由圖7可知,SCSCP對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均具有一定的增殖抑制效果,且呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。對(duì)同一培養(yǎng)時(shí)間,抑制率隨SCSCP濃度的提高而逐漸增加,其對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的抑制分別在5 mg/mL和2.5 mg/mL前比其后的增幅大;相同添加濃度下,抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,說(shuō)明多糖濃度越高和培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng),其抑制率越高,在多糖濃度為10 mg/mL,培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí),對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的抑制率可以達(dá)到63.36%和67.02%。由上可知,SCSCP可有效抑制Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖7　SCSCP對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞抑制率的影響Fig.7　Effect of SCSCP on the inhibition rates of Hela cells and HepG2 cells

2.5.2SCSP A1和SCSP A2對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞增殖的影響圖8、圖9為不同濃度SCSP A1和SCSP A2對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞抑制率的影響圖,由圖8可知,隨著SCSP A1濃度的升高,其對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的抑制率均上升,存在明顯的量效關(guān)系。在同一添加濃度下,不同的培養(yǎng)時(shí)間得到的結(jié)果有所不同,總體上隨著時(shí)間的延長(zhǎng),其抑制作用越來(lái)越強(qiáng)。在圖9中,SCSP A2與SCSP A1得到的趨勢(shì)圖類似,表明SCSP A1和SCSP A2均具有良好的體外抗腫瘤作用。當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí),SCSP A1對(duì)培養(yǎng)72 h的Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞抑制率分別達(dá)到75.97%和80.62%,SCSP A2對(duì)培養(yǎng)72 h的Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞抑制率分別達(dá)到80.28%和83.11%,陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)培養(yǎng)72 h的Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞抑制率分別為75.64%和79.75%。

圖8　SCSP A1對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞存活率的影響 Fig.8　Effect of SCSP A1 on the inhibition rates of Hela cells and HepG2 cells

圖9　SCSP A2對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.9　Effect of SCSP A2 on the inhibition rates of Hela cells and HepG2 cells

綜上所述,SCSCP及其純化組分對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均有不同程度的抑制作用,但SCSP A1、SCSP A2對(duì)細(xì)胞的抑制作用高于SCSCP。SCSP A2的腫瘤抑制效果比SCSP A1更好,這可能是由于SCSP A2中陰離子含量高于SCSP A1,相關(guān)研究也有類似結(jié)果表明不同多糖組分的硫酸基含量、單糖組成、具體結(jié)構(gòu)等不同影響其抗腫瘤活性[22]。海參精多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用比對(duì)Hela細(xì)胞略強(qiáng),表明HepG2細(xì)胞對(duì)其敏感性更高。有研究表明不同來(lái)源的多糖對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞抑制機(jī)理可能是通過(guò)腫瘤凋亡因子基因的調(diào)節(jié)和線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23-27],推測(cè)可能SCSP對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞抑制機(jī)理有所區(qū)別。

3　結(jié)論

具有抗腫瘤活性的多糖廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中,是目前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn),相比于細(xì)胞毒類等傳統(tǒng)的腫瘤臨床治療藥物，其具有對(duì)人體的毒副作用相對(duì)較小的特點(diǎn),是治療腫瘤的潛在藥物[28]。研究表明,海參體內(nèi)含有多種抗腫瘤活性多糖,王寶磊[29]研究發(fā)現(xiàn),刺參酸性粘多糖對(duì)人干癌細(xì)胞HepG2的抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間和劑量的依賴關(guān)系,Dong等[30]從海參體壁中提取的多糖組分及其降解片段對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞均具有良好的體外抗腫瘤活性。

本研究利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立數(shù)學(xué)模型,優(yōu)化出酶解法提取SCSCP的最優(yōu)組合:木瓜蛋白酶、加酶量3%、酶解溫度49 ℃、酶解時(shí)間6 h,此條件下其得率為10.643‰,接近模型預(yù)測(cè)值。選擇不同梯度的NaCl洗脫液對(duì)SCSCP進(jìn)行DEAE-離子交換層析得到兩種多糖組分SCSP A1、SCSP A2,體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)Hela細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均具有一定的抑制作用,且存在明顯的量效關(guān)系,表明海參精多糖對(duì)新型抗腫瘤藥物的開發(fā)具有潛在的重要意義。因此,應(yīng)進(jìn)一步研究海參精多糖的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成及其構(gòu)效關(guān)系,以期促進(jìn)海參精的深度開發(fā)和利用。

[1]廖玉麟. 我國(guó)的海參[J]. 生物學(xué)通報(bào),2001,36(9):1-3.

[2]Kiew P L,Don M M. Jewel of the seabed:sea cucumbers as nutritional and drug candidates[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition,2012,63(5):616-636.

[3]Chen S G,Li G Y,Wu N,et al. Sulfation pattern of the fucose branch is important for the anticoagulant and antithrombotic activities of fucosylated chondroitin sulfates[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2013,1830(4):3054-3066.

[4]Wu M Y,Huang R,Wen D D,et al. Structure and effect of sulfated fucose branches on anticoagulant activity of the fucosylated chondroitin sulfate from sea cucumber Thelenata ananas[J]. Carbohydrate Polymers,2012,87(1):862-868.

[5]Zou S M,Pan R J,Dong X D,et al. Physicochemical properties and antioxidant activities of two fucosylated chondroitin sulfate from sea cucumber Acaudina molpadioidea andHolothurianobilis[J]. Process Biochemistry,2015.

[6]盛文靜. 不同海參多糖提取分離及化學(xué)組成分析比較[D].青島:中國(guó)海洋大學(xué),2007.

[7]Dong X D,Pan R J,Deng X Y. Separation,purification,anticoagulant activity and preliminary structural characterization of two sulfated polysaccharides from sea cucumberAcaudinamolpadioideaandHolothurianobilis[J]. Process Biochemistry,2014,49(8):1352-1361.

[8]張軍瑞,陳健. 木瓜蛋白酶酶解白底輻肛參提取多糖的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技,2009,05:542-545.

[9]Chang Y G,Hu Y F,Yu L,et al. Primary structure and chain conformation of fucoidan extracted from sea cucumber Holothuria tubulosa[J]. Carbohydrate Polymers,2016,136:1091-1097.

[10]林威威,張健,王茂劍,等. 仿刺參腸道多糖的純化及理化分析[J]. 食品科學(xué),2011,17:118-122.

[11]Kale V,Freysdottir J,Paulsen B S,et al. Sulphated polysaccharide from the sea cucumber Cucumaria frondosa affect maturation of human dendritic cells and their activation of allogeneic CD4(+)T cellsinvitro[J]. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre,2013,2(2):108-117.

[12]李亞輝,馬艷弘,黃開紅,等. 蘆薈多糖的超聲波輔助纖維素酶提取及抗腫瘤活性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015,15(11):91-97.

[13]Lou Y J,Huang G,Zhao Y L,et al. Protective role of the polysaccharides from sea cucumber,acaudina molpadioidea,in cecal ligation and puncture-induced sepsis[J]. Current Topics in Nutraceutical Research,2013,11(1/2):29-344.

[14]陳志剛,朱泉,王芬. 百合多糖純化及分子質(zhì)量測(cè)定[J]. 食品科學(xué),2013,34(17):1-4.

[15]張莘莘. 黑靈芝多糖的抗腫瘤活性及其分子機(jī)制初探[D]. 南昌:南昌大學(xué),2014.

[16]彭勤,彭惠,駱云鵬,等. 順鉑、5-氟尿嘧啶對(duì)人宮頸腫瘤細(xì)胞(Hela細(xì)胞)的相互作用[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2001,28(1):45-47.

[17]陳濤,張健,王茂劍. 木瓜蛋白酶提取仿刺參消化道多糖[J]. 食品科學(xué),2010,20:226-229.

[18]王占一,鄭丹丹,王京龍,等. 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取石榴皮中三萜類化合物工藝及動(dòng)力學(xué)分析[J]. 食品科學(xué),2015,36(22):11-17.

[19]蔣長(zhǎng)興. 青蛤多糖分離鑒定、硫酸酯化及其生物活性研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[20]Sheng X H,Li M,Song S L,et al. Sulfated polysaccharide isolated from the sea cucumber stichopus japonicus promotes neurosphere migration and differentiation via up-regulation of n-cadherin[J]. Cellular and Molecular Neurobiology,2012,32(3):435-442.

[21]Matsuhiro B,Osorio-Roman I O,Torres R. Vibrational spectroscopy characterization and anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide from sea cucumber Athyonidium chilensis[J]. Carbohydrate Polymers,2012,88(3):959-965.

[22]吳春華,陳藝勤,邱恬,等. 多糖微觀構(gòu)象與抗腫瘤活性關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2011,26(4):123-128.

[23]何洪. 百合多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究[D]. 吉林:延邊大學(xué),2013.

[24]彭玲. 刺參粘多糖對(duì)Hela細(xì)胞增殖分化的影響及其機(jī)制的探討[D]. 青島:青島大學(xué),2008.

[25]余磊. 五味子多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制研究[D]. 吉林:吉林大學(xué),2012.

[26]陳玲. 刺參粘多糖誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞株凋亡及其作用機(jī)制[D]. 青島:青島大學(xué),2009.

[27]牛娟娟,宋揚(yáng). 海洋刺參多糖對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2010,05:386-388.

[28]林俊,李萍,陳靠山. 近5年多糖抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中藥雜志,2013,38(8):1116-1125.

[29]王寶磊. 刺參酸性粘多糖體外誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 青島:青島大學(xué),2009.

[30]Dong X D,Pan R J,Zou S M,et al. Oxidative degradation of the sulfated polysaccharide isolated from sea cucumberHolothurianobilis[J]. Process Biochemistry,2015,50(2):294-301.

Optimization of extraction of sea cucumber sperm polysaccharide and its antitumor activityinvitro

WANG Ting1,2,LIU Jing-xi2,ZHANG Jian2,3,LIU Xin2,ZHAO Yun-ping2, JING Yue-xin2,WANG Gong-ming2,WANG Mao-jian2,3,4,*

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 200000,China; 2.Shandong Marine Resource and Environment Research Institute,Yantai 264006,China; 3.Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology,Yantai 264006,China; 4.Shandong Freshwater Fisheries Research Institute,Ji’nan 250013,China)

This study was aimed to optimize the extraction process of sea cucumber sperm polysaccharide(SCSP),and evaluate its antitumor activityinvitro. After enzyme screen and single factor experiments,factors such as enzyme dosage,extraction temperature and extraction time were taken into account to perform response surface experiment optimization according to polysaccharide yield. Theinvitrogrowth inhibition effects of sea cucumber sperm crude polysaccharide(SCSCP)and its purified components(SCSP A1,SCSP A2)on human cervical cancer Hela cells and human liver cancer HepG2 cells were measured with MTT assay. The results showed that the optimum extraction conditions of SCSCP were as follows:papain,enzyme dosage of 3%,extraction temperature of 49 ℃,extraction time 6 h. Under these conditions the yield of SCSCP was 10.643‰. The MTT results indicated that SCSCP and its purified components inhibited the survival rates of Hela cells and HepG2 cells. SCSP A2exhibited a higher inhibition rate than SCSP A1. At the concentration of 10 mg/mL,inhibition rates of SCSP A2on Hela and HepG2 at 72 h were 80.28% and 83.11%,respectively,implying that SCSP had a remarkableinvitroantitumor activity.

sea cucumber sperm;polysaccharide;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;antitumor activity

2016-03-01

王婷 (1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail:twinstingying@163.com。

王茂劍(1964-)，男，本科，研究員，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail:wangmaojian@126.com。

山東省自然科學(xué)基金培養(yǎng)基金(ZR2014CP030)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系刺參產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(SDAIT-08)；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目；煙臺(tái)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014ZH081)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)17-0068-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.005