水稻DNA多態(tài)標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證

邱振楠，徐乾坤，王小琦，趙　娟，赫　磊，張　森，馬伯軍，錢　前，朱　麗,*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310006)

?

水稻DNA多態(tài)標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證

邱振楠1,2，徐乾坤1，王小琦2，趙娟2，赫磊2，張森2，馬伯軍1，錢前2，朱麗2,*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310006)

利用203對分子標(biāo)記對3個(gè)粳稻品種(日本晴、中花11、武運(yùn)粳7號)和4個(gè)秈稻品種(9311、明恢63、臺中1號及南京6號)進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選到92對在秈粳間存在差異的標(biāo)記、34對粳稻品種間存在差異的標(biāo)記及80對在秈稻品種間存在差異的標(biāo)記。對部分在多個(gè)品種中存在多態(tài)性的標(biāo)記進(jìn)行測序，結(jié)果表明：大部分微衛(wèi)星標(biāo)記在不同品種間產(chǎn)物的大小差異是由重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)的多少引起，而插入/缺失標(biāo)記在品種間的序列差異則各有不同，如部分非重復(fù)序列的一次或多次重復(fù)、長片段的插入或缺失等。這些多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的分子標(biāo)記的開發(fā)和多態(tài)性驗(yàn)證為分子標(biāo)記在種質(zhì)鑒定、進(jìn)化分析、遺傳多樣性檢測、分子標(biāo)記輔助選育等方面的廣泛使用奠定了基礎(chǔ)。

水稻；分子標(biāo)記；多態(tài)性；品種鑒定

自20世紀(jì)70年代DNA水平的多態(tài)性鑒定技術(shù)問世以來，越來越多的分子標(biāo)記被不斷開發(fā)和利用[1-6]。水稻全基因組序列的公布及重要品種重測序計(jì)劃的陸續(xù)啟動和完成，更是極大的豐富了人們對水稻序列多態(tài)性的認(rèn)識和了解，拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域及空間[7-11]。高密度的分子標(biāo)記不僅是基因定位和克隆的基礎(chǔ)，而且還可以在種質(zhì)鑒定、進(jìn)化分析、遺傳多樣性檢測、分子標(biāo)記輔助選育等方面發(fā)揮作用[12-16]，已有的研究表明，6對簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length polymorphism，SSLP)引物即可區(qū)分71個(gè)不同的品種[17]。李小湘等[18]用24對簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeats，SSR)對136份湖南地方稻進(jìn)行遺傳差異分析，結(jié)果表明，SSR標(biāo)記遺傳相似性系數(shù)可以部分代表表型性狀遺傳距離，但僅使用24對SSR標(biāo)記進(jìn)行差異性分析，標(biāo)記多態(tài)性不足，對遺傳差異的分析還不夠全面。

到目前為止，從DNA序列層面上已經(jīng)獲得了數(shù)量龐大的多態(tài)標(biāo)記，但這些標(biāo)記在不同水稻品種間的多態(tài)性驗(yàn)證并不多見，高通量測序雖然可以快速、精確地分析品種間的多態(tài)性，但對大量品種進(jìn)行高通量測序，在成本方面顯然不具操作性。用PCR的方法篩選更多穩(wěn)定可靠的分子標(biāo)記用于品種鑒定、親緣關(guān)系分析及不同群體的基因定位和克隆則更加簡便易行[19-21]。本研究利用203對分子標(biāo)記，其中184對為新開發(fā)的分子標(biāo)記，對3個(gè)粳稻品種及4個(gè)秈稻品種進(jìn)行多態(tài)性分析，并對部分在多個(gè)品種中存在多態(tài)性的標(biāo)記進(jìn)行測序分析，篩選到一批多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的分子標(biāo)記，這些標(biāo)記的開發(fā)和多態(tài)性驗(yàn)證不僅可為分子標(biāo)記輔助育種提供更多有效的標(biāo)記資源，還可廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、進(jìn)化分析、遺傳多樣性檢測等領(lǐng)域。

1　材料與方法

1.1材料

選用的研究材料分別為水稻品種日本晴(NIP，粳稻)，中花11(ZH11，粳稻)，武運(yùn)粳7號(WY7，粳稻)，9311(秈稻)，明恢63(MH63秈稻)，臺中1號(TN1，秈稻)，南京6號(NJ6，秈稻)，均為本實(shí)驗(yàn)室保存，全部材料的種植地均為浙江富陽。其中NIP和9311為已測序品種，用于驗(yàn)證多態(tài)性的正確性。ZH11，WY7，MH63，TN1及NJ6均為生產(chǎn)中常用的水稻品種。203對分子標(biāo)記中184對為新開發(fā)的標(biāo)記，19對為已有的RM標(biāo)記[22]，所有的標(biāo)記及對應(yīng)的測序引物合成均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2方法

1.2.1水稻基因組DNA提取

按照盧揚(yáng)江等[23]報(bào)道的方法提取水稻基因組DNA。

1.2.2引物設(shè)計(jì)及PCR檢測

根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及Gramene (http://www.gramene.org/genome browser/index.html) 上的水稻全基因組信息，Blast分析日本晴和9311間序列的差別，并近似認(rèn)為這些差別在待測的7個(gè)品種間也存在，利用這些差異借助生物軟件Primer Premier 5.0和DNAMAN設(shè)計(jì)引物，在7個(gè)品種間篩選有多態(tài)性的標(biāo)記，分析不同品種間多態(tài)性。15 μL PCR反應(yīng)體系：20 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1(NH4)2SO4，10 mmol·L-1KCl，2 mmol·L-1MgCl2，1% Triton X-100，pH 8.8，10.0 nkat Taq酶，0.17 mmol·L-1dNTPs，0.33 μmol·L-1引物，100 ng模板DNA。在Applied Biosystems 9700 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 4 min；94℃ 30s，退火(退火溫度隨引物各異)30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在4%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察。

1.2.3多態(tài)性序列分析

將篩選獲得的在多個(gè)品種間均有多態(tài)的標(biāo)記，重新設(shè)計(jì)測序引物，PCR擴(kuò)增對應(yīng)多態(tài)品種，產(chǎn)物回收后由上海桑尼生物科技有限公司完成測序。用DNASTAR中的SeqMan軟件分析序列多態(tài)性。多態(tài)標(biāo)記的設(shè)計(jì)基于NCBI中提供的秈稻和粳稻測序數(shù)據(jù)比對完成。在水稻數(shù)據(jù)庫Gramene中對標(biāo)記的旁鄰序列進(jìn)行Blast分析(http://blast.gramene.org/Multi/blastview)。

2　結(jié)果與分析

利用203對SSR標(biāo)記、插入/缺失標(biāo)記(insertion/deletion，InDels)及序列標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-tagged site，STS)標(biāo)記在7個(gè)品種間進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中184對為新開發(fā)標(biāo)記，19對為RM引物。所有標(biāo)記中有9對在7個(gè)品種中均無多態(tài)。在全部可正常擴(kuò)增而且在不同材料中有多態(tài)的194對標(biāo)記中，只在秈粳間存在差異的標(biāo)記有92對(圖1，表1為部分結(jié)果)，粳稻品種間存在差異的標(biāo)記有34對(圖2，表2為部分結(jié)果)，秈稻品種間存在差異的標(biāo)記有80對(圖3，表3為部分結(jié)果)。

部分標(biāo)記在粳稻間存在差異，可區(qū)分不同品種的粳稻，如標(biāo)記ZB1-1，ZB2-26，ZB2-11，ZB3-13等在武運(yùn)粳7號的帶型與日本晴和中花11不同；ZB2-15，ZB7-1，ZB7-2和KS9-24等可特異地區(qū)分中花11，其帶型與日本晴和武運(yùn)粳7號不同；ZB10-2，ZB10-6，ZB11-13和ZB11-15等可特異地區(qū)分日本晴，其帶型與中花11和武運(yùn)粳7號不同(圖2，表2為部分結(jié)果)。

部分標(biāo)記在秈稻間存在差異，可區(qū)分不同品種的秈稻品種，如標(biāo)記ZB2-15，ZB4-5，ZB4-6，ZB6-3，KS7-25等可特異區(qū)分9311與其他3個(gè)秈稻品種；ZJ8-7，ZB2-26，ZB2-11，ZB3-2，ZB8-4等可特異區(qū)分明恢63；ZB1-11，ZB1-7，ZB2-10，ZB9-4，ZB7-3，ZB7-4等可特異區(qū)分臺中1號；ZB2-25，ZB8-11，ZB9-8，ZJ8-3和ZB12-4等可特異區(qū)分南京6號；此外，還有一些標(biāo)記可區(qū)分兩種秈稻品種，如ZB1-2在明恢63、南京6號中的帶型與在9311和臺中1號的帶型不同；ZB2-24在9311和南京6號中的帶型與在明恢63和臺中1號的帶型不同(圖3，表3為部分結(jié)果)。

圖1　部分只在秈粳稻間存在差異的標(biāo)記Fig.1　Several markers showed polymorphism among indica and japonica rice

為了進(jìn)一步明確標(biāo)記在不同品種中序列的差異，對部分標(biāo)記進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果顯示,大部分微衛(wèi)星標(biāo)記在不同品種間產(chǎn)物的大小差異由重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)的多少引起，而插入/缺失標(biāo)記品種間序列差異則各有不同，如部分非重復(fù)序列的一次或多次重復(fù)、長片段的插入或缺失等(圖4)。對203對標(biāo)記多態(tài)位點(diǎn)的旁鄰序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，91.7%的標(biāo)記多態(tài)性發(fā)生在基因的非編碼區(qū)或尚未被預(yù)測功能的區(qū)段內(nèi)，其中發(fā)生在尚未被預(yù)測功能的區(qū)段的有52.9%，基因內(nèi)含子、5’UTR、ATG前面的外顯子及TAG(TAA，TGA)后面的外顯子的有38.9%，只有8.3%的多態(tài)位點(diǎn)發(fā)生在基因編碼區(qū)(表4)。

圖2　部分粳稻間多態(tài)標(biāo)記的PCR檢測結(jié)果Fig.2　PCR results of several markers polymorphism among japonica rice

表1部分在秈粳間存在差異的標(biāo)記序列

Table 1Sequences of several markers polymorphism among indica and japonica rice

標(biāo)記名稱水稻品種NIPZH11WY79311MH63TN1NJ6序列信息5'-3'RM編號ZB1-10aaabbbbCTACCCCTAAGAGCCGCATCCGGCGCCTCCATCATCAGCAGGTZB1-9aaabbbbTAGCTCCAACAGGATCGACCGTACGTAAACGCGGAAGGTGRM493ZB1-3aaabbbbGGGTCATATTTCTATTAATTCAAGGAAAATCCACCACTAATCZB2-1aaabbbbATATGCAAGGATGAAATCAATCTCCACCTCGGCAGGTATAZB2-3aaabbbbAGGAGCGTGCTGCGTGCGG-GATCCGCCACCACGCCCGACCTTTTZB2-4aaabbbbTTGTGTTGTAATCTATCTT-GTTTTTGGATTTGGTGAAAACTTAACACZB2-14aaabbbbGTTGATAGATTGCATTGCCAACAAAGCTAGAAGTGTTAACCT-GTAAZB2-17aaabbbbCCTCCACTTCCAAAATAAATGTTTGAATGTTCAAAATTAGCAACZB2-19aaabbbbCGGATTGGCGAGGGGATAGGGGACGGAAAAGGGAGCGAAAAZB3-9aaabbbbTCCAGTCCACTAAAAGTTTTCATTATGCTATAGGCTTTGAGCZB3-12aaabbbbTACTCCTATCCTGCCATGGCTGTAGTAGACGAGAGGCCGGRM3513ZB3-7aaabbbbGGTGATGCAGGTGCTAGAAG-GCGATCAGATGCGCGTTCCTGGCCATZB3-8aaabbbbGAGTTACCTCCATCCTGTTGCAGAGTCTTGATCTCGTGCTTCZB4-15aaabbbbATGGCCAGCGTGATCTCCCCACCGAATCGAATAACCACRM6089

注：“a”“b”用于區(qū)分不同的帶型。

表2部分粳稻間多態(tài)性標(biāo)記序列

Table 2Sequences of several markers polymorphism among japonica rice

標(biāo)記名稱水稻品種NIPZH11WY7染色體序列信息5'-3'RM編號ZB10-2abb10TCCATCAAGTTTGAAGGTAACTGTACTAGTGAATGTTGCATGZB10-6abb10CTCTCAAAGAACTAGGACTCGAGAAGGTATGATAACCAATRM4455ZB11-13abc11AATAAGGGAGAGCCAATCTGTAGTAGATGGCCGTTCTCTCRM2191ZB11-15abb11ATGTTTGAGAAAATGCAGACCACTAAGCTCGTTTTCAAAGRM2136ZJ8-7abb3CCGCTTCGAGACGACGCTGAGAGCCCGAATCCCCAAAACCCTZB2-15aba2TTGCCTTCTTTACTAGCATATCCCATACTACTGAGAATGGGTTGZB7-1aba7TTTACAACCAACGGTTCGATGAAACTTAGATTTGCCCTTCAAZB7-2aba7GCCGGGCAGGATCTCGAAGCGTAAACGGGCTGGACGGACTGKS9-24aba1CCATTTATTGTGATAATTTGCTACTTGCGTTCATCTGGACZB1-1aab1GATTTGGAAATCAACCATTACCACCCACATTGTTTGTTAGATZB1-6aab1ATGAAAAGGTAAATGATGACGCAATGCATACTGCTTTATTTCZB2-16aab2TGAGATTTACTTCTGAGACCAC-CACGACGCAGCCGCCACAAAACCCT

續(xù)表2

注：“a”“b”“c”分別表示不同的帶型。下表同。

表3部分秈稻間多態(tài)性標(biāo)記序列

Table 3Sequences of several markers polymorphism among indica rice

標(biāo)記名稱水稻品種9311MH63TN1NJ6染色體序列信息5'-3'RM編號ZB2-15abbb2TTGCCTTCTTTACTAGCATATCCCATACTACTGAGAATGGGTTGZB4-5abcc4GGTGATGATCAGGTGATCCATTACTGCATACGACTTACGAGCZB4-6abbb4CAGTGTTGACCTTTTGAACTAATCAAATATCAAGCCACTCCTTTZB6-3abbb6CACGACTCCACCAACCCCAGCGACGTCGTCGAGATGCGTTGCKS7-25abbb2TATAGTCCGTGAATAATGGTGATATTACAGACAGATAAAGGA-GAZJ8-7abaa3CCGCTTCGAGACGACGCTGAGAGCCCGAATCCCCAAAACCCTZB2-26abaa2CACTCAAGACCAGACCTGTACGCGGCACGTCATTGTAGTGACRM5472ZB2-11abaa2CCCCACAGTGCTGACGCCTCTCGTTGCGCTAGCTCGGATTCGZB3-2abaa3TGTTGTTTTGGAGATTTGAAGGGAGGCGAAAAGTCACGTAAGCZB8-4abaa8TAGCGGGCTGACTTCTAGTTGACTGCACTATAAATCTTCAGT-TCC

續(xù)表3

3　結(jié)論與討論

水稻經(jīng)過長期的自然演化和人工選擇產(chǎn)生了豐富多樣并各具特色的種質(zhì)資源，為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等新品種培育提供了重要的遺傳基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的表型分析受自然環(huán)境、栽培方式等條件的影響，無法穩(wěn)定、準(zhǔn)確地判斷種質(zhì)遺傳背景。分子標(biāo)記以DNA為模板，不受外界環(huán)境影響，判斷的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性可大幅提高[15-17]。但是少量的多態(tài)標(biāo)記很難細(xì)致區(qū)分不同品種間高度同源的序列，因此發(fā)掘更多的分子標(biāo)記，盡可能多地體現(xiàn)不同品種間的多態(tài)性，有著非常重要的意義，表型分析與多個(gè)分子標(biāo)記輔助鑒定相結(jié)合，將會使不同稻種資源遺傳相似性鑒定更為準(zhǔn)確、細(xì)致[18-21]。雖然水稻全基因組測序工作已經(jīng)完成，但對于非測序品種來說也只能提供序列參考，與重測序技術(shù)高昂的成本相比，用現(xiàn)有序列提供的信息，通過PCR技術(shù)發(fā)掘并驗(yàn)證更多的多態(tài)性分子標(biāo)記則更為簡便易行。本研究通過發(fā)掘和驗(yàn)證新的分子標(biāo)記在3個(gè)粳稻品種和4個(gè)秈稻品種間的多態(tài)性，篩選到92對在秈粳間存在差異的標(biāo)記，34對粳稻品種間存在差異的標(biāo)記及80對在秈稻品種間存在差異的標(biāo)記。除了本研究中選用的7個(gè)水稻材料，通過篩選更多的品種，可使這些新開發(fā)的標(biāo)記廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、進(jìn)化分析、遺傳多樣性檢測、分子標(biāo)記輔助選育等領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊。

表4多態(tài)位點(diǎn)位于基因編碼區(qū)的標(biāo)記及對應(yīng)基因

Table 4Markers polymorphism in the coding region and the corresponding genes

編號多態(tài)位置基因功能注釋ZB9-9LOC_Os09g24480.1:exon_1TCP家族轉(zhuǎn)錄因子10-5LOC_Os10g31864.1:exon_50表達(dá)蛋白A10-7LOC_Os10g41670.1:exon_3表達(dá)蛋白11-4LOC_Os11g14380.1:exon_2抗性蛋白LR10ZB11-10LOC_Os11g41430.1:exon_3逆轉(zhuǎn)座子蛋白ZB12-6LOC_Os12g36310.1:exon_5表達(dá)蛋白A12-7LOC_Os12g39020.1:exon_2BED鋅指結(jié)構(gòu)蛋白KS7-8LOC_Os02g01470.1:exon_1逆轉(zhuǎn)座子蛋白KS7-16LOC_Os02g06060.1:exon_1假設(shè)蛋白KS9-10LOC_Os01g70890.1:exon_1組蛋白類似轉(zhuǎn)錄因子KS9-13LOC_Os01g72210.1:exon_9脫水早期反應(yīng)蛋白KS9-15LOC_Os01g72650.1:exon_4RNA識別基序蛋白KS9-18LOC_Os10g37540.1:exon_1OsFBDUF48-F盒DUF結(jié)構(gòu)域蛋白KS9-25LOC_Os10g34440.1:exon_2表達(dá)蛋白KS9-26LOC_Os10g35040.1:exon_2受體激酶蛋白KS9-27LOC_Os10g35120.1:exon_1表達(dá)蛋白KS9-28LOC_Os10g35330.1:exon_1表達(dá)蛋白

圖4　部分品種間多態(tài)性標(biāo)記的測序結(jié)果Fig.4　Sequencing validations of several markers polymorphism among several rice cultivars

在全部可正常擴(kuò)增而且在不同材料中有多態(tài)的194對標(biāo)記中，在秈粳間、粳稻品種間及秈稻品種間存在差異的標(biāo)記有206對，超過了194對的標(biāo)記總數(shù)，這是由于部分標(biāo)記在秈稻和粳稻中各自存在差異，為了便于分類使用，在統(tǒng)計(jì)過程中重復(fù)統(tǒng)計(jì)所致，如圖5中的ZB9-4，ZB9-8，ZB6-5等，在粳稻間、秈稻間各自存在差異。為了驗(yàn)證多態(tài)的正確性，對一些標(biāo)記進(jìn)行測序，結(jié)果表明，部分在電泳圖中表現(xiàn)出的微弱差別，可能是由于電泳條件的影響，如KS7-4在電泳圖中NIP比MH63產(chǎn)物略大，而測序結(jié)果卻表明二者在序列上沒有差異；同樣8-8在電泳圖中各個(gè)品種的產(chǎn)物大小順序?yàn)閃Y7>NIP=9311>ZH11=MH63，測序結(jié)果卻表明，WY7與NIP的產(chǎn)物大小一樣，均比9311多了6個(gè)堿基，相鄰的泳道更容易區(qū)分產(chǎn)物的大小差異(圖4)。一些標(biāo)記在不同品種間的差異非常大，如3-5在9311和NIP之間有16個(gè)堿基的差異，但在NIP和WY7之間有266個(gè)堿基的差異，這種類型的標(biāo)記在NCBI比對同源序列的過程中通常會被自動打斷，因此在設(shè)計(jì)分子標(biāo)記時(shí)考慮兩段比對序列接頭處的多態(tài)，往往也能獲得多態(tài)性非常好的標(biāo)記。通過測序還發(fā)現(xiàn)，部分序列在非常鄰近的序列有多個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，如ZB5-2在9311和NIP之間，多態(tài)位點(diǎn)附近600 bp的序列中有2個(gè)穩(wěn)定的序列插入和缺失差異；ZB6-3多態(tài)位點(diǎn)附近的序列在NIP，9311和NJ6之間出現(xiàn)了多處插入缺失變異及SNP變異(圖4)，這些序列可能是水稻進(jìn)化過程中變異頻率比較高的位置，可用于區(qū)分多個(gè)品種間的差異。

不同水稻品種間農(nóng)藝性狀的差異，本質(zhì)上是由基因變異所致，因此利用DNA分子標(biāo)記鑒定不同品種的基因型，可為指導(dǎo)雜交親本選配、開展秈粳稻亞種間雜種優(yōu)勢的利用、優(yōu)質(zhì)抗病等定向遺傳改良等方面提供參考。此外，分子標(biāo)記輔助育種將基因型鑒定和表型鑒定相結(jié)合，提高了水稻育種的目的性和中間材料的篩選效率，在生產(chǎn)上具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。近年來的研究結(jié)果表明，現(xiàn)有的分子標(biāo)記在秈粳稻亞種間多態(tài)性較好，但在亞種內(nèi)多態(tài)性較低[18，24-25]。王林友等[24]用19對InDel標(biāo)記對48個(gè)秈稻、粳稻及中間型材料進(jìn)行秈粳屬性分析后發(fā)現(xiàn)，由于亞種內(nèi)品種遺傳相似性較高，僅用19對標(biāo)記進(jìn)行分析會造成不同品種的誤判概率升高，需要開發(fā)更多更準(zhǔn)確的標(biāo)記才能精確區(qū)分亞種內(nèi)的差別。本研究新開發(fā)的標(biāo)記中有34對標(biāo)記可用于區(qū)分粳稻亞種間的差別，80對標(biāo)記可用于區(qū)分秈稻亞種間的區(qū)別，用這些標(biāo)記對更多亞種進(jìn)行多態(tài)性分析，可大幅提高亞種內(nèi)品種的辨識率，為分子標(biāo)記的在新品種選育方面的廣泛使用提供參考。

圖5　不同品種間部分多態(tài)標(biāo)記的PCR檢測結(jié)果Fig.5　PCR results of several polymorphism markers in different cultivars

[1]AKAGI H，YOKOZEKI Y，INAGAKI A，et al.Microsatellite DNA markers for rice chromosomes [J].Theoretical and Applied Genetics，1996，93(7):1071-1077.

[2]WU J，MAEHARA T，SHIMOKAWA T，et al.A comprehensive rice transcript map containing 6591 expressed sequence tag sites [J].The Plant Cell Online，2002，14(3):525-535.

[3]ZHANG N，XU Y，AKASH M，et al.Identification of candidate markers associated with agronomic traits in rice using discriminant analysis [J].Theoretical and Applied Genetics，2005，110(4):721-729.

[4]趙中秋，鄭海雷，張春光.分子標(biāo)記的發(fā)展及其在植物研究中的應(yīng)用 [J].生命科學(xué)研究，2000，4(2):68-72.

[5]閆華超，高嵐，李桂蘭.分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用[J].生物學(xué)通報(bào)，2006，41(2):17-19.

[6]嚴(yán)松，黃福燈，李春壽，等.產(chǎn)量相關(guān)性狀分子標(biāo)記遺傳距離與秈稻雜種優(yōu)勢的相關(guān)性[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22(5):545-551.

[7]PROJECT I R G S.The map-based sequence of the rice genome [J].Nature，2005，436(7052):793-800.

[8]HUANG X，KURATA N，WEI X，et al.A map of rice genome variation reveals the origin of cultivated rice [J].Nature，2012，490(7421):497-501.

[9]GAO Z Y，ZHAO S C，HE W M，et al.Dissecting yield-associated loci in super hybrid rice by resequencing recombinant inbred lines and improving parental genome sequences [J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110(35):14492-14497.

[10]SAKAI H，KANAMORI H，ARAI-KICHISE Y，et al.Construction of pseudomolecule sequences of the aus rice cultivar kasalath for comparative genomics of Asian cultivated rice [J].DNA Research，2014，21(4):1131-1142.

[11]劉艷，王逸超，樊繼偉，等.分子標(biāo)記輔助選擇Xa23基因在選育抗白葉枯病水稻新品系中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23(2):248-251.

[12]曾正明，況浩池，羅俊濤，等.利用分子標(biāo)記輔助篩選改良‘瀘恢602’稻瘟病抗性的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24(1):66-70.

[13]鄧其明 王世全 鄭愛萍，等.利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)選育高抗白葉枯病恢復(fù)系[J].中國水稻科學(xué)，2006，20(2):153-158.

[14]袁力行.利用RFLP，SSR，AFLP和RAPD標(biāo)記分析玉米自效系遺傳多樣性的比較研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2000，27(8):725-733.

[15]劉艷華，牟建民，王志德，等.分子標(biāo)記技術(shù)在煙草遺傳育種中的應(yīng)用[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2007，8(1):118-122.

[16]王黎明，焦少杰，姜艷喜.利用分子標(biāo)記分析高粱的遺傳多樣性及其在種質(zhì)創(chuàng)新中的應(yīng)用[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2015，16(2):288-293.

[17]OLUFOWOTE J O，XU Y，CHEN X，et al.Comparative evaluation of within-cultivar variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers [J].Genome，1997，40(3):370-378.

[18]李小湘，肖軍治，段永紅，等.湖南同名地方稻資源SSR標(biāo)記及表現(xiàn)型的比較分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2014，15(2):248-254.

[19]賈繼增.分子標(biāo)記種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記育種[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，29(4):1-10

[20]高寧，景蕊蓮，陳耀鋒，等.作物抗旱相關(guān)分子標(biāo)記及其輔助選擇的研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2003，4(3):274-278.

[21]徐云碧，申宗坦，朱立煌，等.水稻形態(tài)性狀與分子標(biāo)記的相互關(guān)聯(lián)及其檢測[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1994，6(1):1-6.

[22]SHEN Y J，JIANG H，JIN J P，et al.Development of genome-wide DNA polymorphism database for map-based cloning of rice genes [J].Plant Physiology，2004，135(3):1198-1205.

[23]盧揚(yáng)江，鄭康樂.提取水稻 DNA的一種簡易方法[J].中國水稻科學(xué)，1992，6(1):47-48.

[24]王林友，張禮霞，勾曉霞，等.利用InDel標(biāo)記鑒定水稻育種材料的秈粳屬性[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27(7):913-921.

[25]馮芳君，羅利軍，李熒，等.水稻 InDel和SSR標(biāo)記多態(tài)性的比較分析[J].分子植物育種，2006，3(5):725-730.

(責(zé)任編輯侯春曉)

The development and verification of nucleotide polymorphism markers in rice

QIU Zhen-nan1，2，XU Qian-kun1，WANG Xiao-qi2，ZHAO Juan2，HE Lei2，ZHANG Sen2，MA Bo-jun1，QIAN Qian2，ZHU Li2,*

(1.College of Chemistry and Life Sciences，Zhejiang Normal University，Jinhua 321004，China;2.State Key Laboratory of Rice Biology，China National Rice Research Institute，Hangzhou 310006，China)

In this work，polymorphic analysis among 3 japonica cultivars (NIP，ZH11 and WY7) and 4 indica cultivars (9311，MH63，TN1 and NJ6) were conducted with 203 molecular markers，92 polymorphism markers between japonica cultivars and indica cultivars，34 polymorphism markers in japonica cultivars and 80 polymorphism markers in indica cultivars had been screened.Sequencing analysis results showed that the polymorphism of microsatellite markers among different varieties was mainly caused by the different repetitions of repetitive sequence.However，the polymorphism of insertion/deletion marks was determined by the repetition times of non-simple repetitive sequence and insertion or deletion of long fragment.Besides the development of new markers，several RM markers also had been verified whether possessed polymorphism in different varieties.Taken together，these new polymorphism markers were bound to be of great service to use in germplasm identification，evolution，genetic diversity detection and molecular marker-assisted selection.

rice;molecular markers;polymorphism;cultivar identification

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):361-370http://www.zjnyxb.cn

邱振楠，徐乾坤，王小琦，等.水稻DNA多態(tài)標(biāo)記的開發(fā)與驗(yàn)證[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(3):361-370.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.01

2015-08-10

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31171532)；浙江省“轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物新品種培育”科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2011R50021)；中央級公益性科研院所專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015RG001-2)

邱振楠(1989—)，男，山東德州人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗具z傳育種。E-mail:zhnanqiu@126.com

，朱麗，E-mail:zhuli05@caas.cn

S511

A

1004-1524(2016)03-0361-10