雞卵清蛋白基因調(diào)控序列的克隆與載體構(gòu)建

黃　菁，朱志偉，陳曉宇，于福先，潘建治

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州　310021)

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雞卵清蛋白基因調(diào)控序列的克隆與載體構(gòu)建

黃菁，朱志偉，陳曉宇，于福先，潘建治*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州310021)

卵清蛋白(ovalbumin)基因在雞基因組中只有一對(duì)等位基因，卻能每天合成分泌多達(dá)2 g的蛋白，占據(jù)卵白蛋白質(zhì)的50%以上，是外源基因載體表達(dá)調(diào)控構(gòu)件的首選。該研究從輸卵管特異性啟動(dòng)子方面著手，通過(guò)對(duì)卵清蛋白基因啟動(dòng)子的篩選優(yōu)化，找出啟動(dòng)子增強(qiáng)因子的位置以及組織特異性區(qū)域。將卵清蛋白基因上游-922～-2 073和-2 801～-3 100區(qū)域平均分成12個(gè)長(zhǎng)度約為150 bp的序列，分別插入到-921～+38序列的上游，成功構(gòu)建12個(gè)系列表達(dá)載體，為進(jìn)一步篩選短縮版優(yōu)化啟動(dòng)子提供材料；卵清蛋白基因第一內(nèi)含子區(qū)域截?cái)喑?00 bp左右的迷你內(nèi)含子序列，成功構(gòu)建8個(gè)迷你內(nèi)含子系列載體，為篩選優(yōu)化的迷你內(nèi)含子提供必要的材料；成功分離雞輸卵管上皮細(xì)胞并優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，通過(guò)熒光素酶活性檢測(cè)初步篩選出具有最強(qiáng)活性重組質(zhì)粒pGL4-UP-1412和內(nèi)含子重組質(zhì)粒pGL4-mini-intron-3，同時(shí)推斷出若干包含增強(qiáng)子序列區(qū)域。

卵清蛋白基因；調(diào)控序列；載體；熒光素酶活性

卵清蛋白(Ovalbumin)在雞基因組中只有一對(duì)等位基因，卻能每天合成分泌多達(dá)2 g的蛋白，占據(jù)卵白蛋白質(zhì)的50%以上，自然成為外源基因載體表達(dá)調(diào)控構(gòu)件的首選。至今，以家禽輸卵管定位表達(dá)為目標(biāo)的基因?qū)胙芯?，絕大部分采用了卵清蛋白基因的調(diào)控序列。 然而，即便采用了卵清蛋白的調(diào)控序列，也不能高效誘導(dǎo)出外源蛋白的大量合成和分泌。迄今，在美日韓等國(guó)制備的生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因家禽卵中，外源蛋白占卵白蛋白的極少超過(guò)1‰。Lillico等[1]的研究中采用了卵清蛋白基因上游2.8 kb的片段，實(shí)現(xiàn)了迄今最成功的輸卵管特異表達(dá)，卵白中人干擾素含量達(dá)到平均38 mg·L-1，最高的個(gè)體也僅為426 mg·L-1。相比之哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系的水平(10 g·L-1左右)仍然存在相當(dāng)差距。Kwon等[2]進(jìn)一步縮短啟動(dòng)子長(zhǎng)度至1.35 kb用于轉(zhuǎn)基因鵪鶉，雖然保持了輸卵管特異性，但在卵白中表達(dá)重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗蛋白(rhIL1RN)的含量更低，僅為88.7～233.8 μg·L-1。Zhu等[3]采用卵清蛋白基因5′端上游長(zhǎng)達(dá)7.5 kb和15 kb的調(diào)控序列制作嵌合體雞表達(dá)單克隆抗體，雖然表達(dá)量較高(750 mg·L-1)，但輸卵管特異性不強(qiáng)，也超過(guò)了病毒載體允許插入的長(zhǎng)度。

外源基因表達(dá)量的高低，除受到基因組插入位置效應(yīng)等隨機(jī)因素的影響外，主要與轉(zhuǎn)基因載體中啟動(dòng)子等元件的活性有關(guān)，單純截取卵清蛋白基因上游的調(diào)控序列片段，難以獲得根本性的改善。而利用基因敲入的方法向卵清蛋白基因座定點(diǎn)導(dǎo)入外源基因，或者將外源基因插入BAC克隆等包含卵清蛋白基因的長(zhǎng)片段中，再導(dǎo)入到基因組，雖然有可能使遠(yuǎn)距離存在的潛在調(diào)節(jié)元件發(fā)揮作用，獲得高效率特異性表達(dá)，但受到目前家禽轉(zhuǎn)基因技術(shù)的限制，尚難于在個(gè)體水平上付諸實(shí)施，無(wú)法獲得實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

因此，在轉(zhuǎn)基因載體的有限長(zhǎng)度內(nèi)，對(duì)表達(dá)調(diào)控元件，特別是啟動(dòng)子領(lǐng)域進(jìn)行優(yōu)化，是現(xiàn)實(shí)有效的途徑，也是國(guó)際性的研究熱點(diǎn)。本研究從輸卵管特異性啟動(dòng)子方面著手，通過(guò)對(duì)卵清蛋白基因啟動(dòng)子的篩選優(yōu)化，找出啟動(dòng)子增強(qiáng)因子的位置以及組織特異性區(qū)域，為下一步對(duì)增強(qiáng)區(qū)域和特異性區(qū)域的整合，制備出具有表達(dá)活性高、組織特異性強(qiáng)的優(yōu)化型啟動(dòng)子提供基礎(chǔ)材料。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

PCR儀(ABI 9902，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；高速冷凍離心機(jī)(HITACHI CR21GIII，日本株式會(huì)社日立制作所)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices SpectraMax M5，美國(guó))；倒置顯微鏡(Nikon ELIPSE Ti-U，日本尼康公司)；電轉(zhuǎn)染儀(BTX ECM830，美國(guó)哈佛儀器旗下BTX公司)；內(nèi)切酶(TAKARA公司)；DNA回收試劑盒[TIANGEN，天根生化科技(北京)有限公司]；熒光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)(ONE-Glo Luciferase Assay system，Promega公司)。

1.2雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列系列變異載體構(gòu)建

1.2.1雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列的克隆

參考GenBank中雞卵清蛋白基因組序列(NC_006089)，利用生物軟件Primer Premier 5和DNAMAN設(shè)計(jì)添加了酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增系列目的片段。引物名稱和序列詳見(jiàn)表1。

將轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)作為+1位置，本試驗(yàn)克隆的序列按照其長(zhǎng)度分別命名詳見(jiàn)表2。

以實(shí)驗(yàn)室已有的pGL4-921作為模板，TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuerMix II PCR Kit擴(kuò)增目的片段X—Y。用引物(F-3100，R-2981)，(F-3010，R-2891)，(F-2920，R-2801)，(F-2703，R-1916)，(F-1937，R-1776)，(F-1803，R-1636)，(F-1659，R-1522)，(F-1547，R-1387)，(F-1412，R-1251)，(F-1275，R-1122)，(F-1148，R-1023)，(F-1048，R-922)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，用DNA純化回收試劑盒(離心柱型，TIANGEN)進(jìn)行割膠回收。

1.2.2雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列變異熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建

表1引物序列及酶切位點(diǎn)

Table 1Sequences of primers and their restriction sites

引物名稱引物序列(5’—3’)Tm/℃F-3100GGGGTACCCAACTATGCAGGTATGCT-GACAA64R-2981GGGGTACCTATACTACACTCTTTC-CCAATGGAAGAF-3010GGGGTACCTGGTCTTCCATTGG-GAAAGAGT64R-2891GGGGTACCTTTCCTCTCCAAGAAG-TAGCCGF-2920GGGGTACCTAAACCACCGGCTACTTCTT-GG64R-2801GGGGTACCCCACATAGTGTCCTGATTC-CAGAF-2073GGGGTACCGACCTCCACTACCACAAC-TACCACAA67R-1916GGGGTACCACAGGCTGCTTCTCACCCT-GTGF-1937GGGGTACCCACAGGGTGAGAAGCAGC-CTGT64R-1776GGGGTACCAGCAACCATGCCATATATA-ATTAAGCATF-1803GGGGTACCATGCTTAATTATATATG-GCATGGTTGCT64R-1636GGGGTACCCTGACTTGTCAGACAGGCTC-CAGAF-1659GGGGTACCGGGGTACCTCTGGAGCCT-GTCTGACAAGTCAG66R-1522GGGGTACCAAGAGAGACCGTTTTG-GCTCTTACTAF-1547GGGGTACCTAGTAAGAGCCAAAACG-GTCTCTCTT64R-1387GGGGTACCTCTGTCATCTGGTGTCAAT-CAAACACF-1412GGGGTACCGTGTTTGATTGACAC-CAGATGACAGA64R-1251GGGGTACCAGAAAGTCTGAAAATCTT-GCCTGCTF-1275GGGGTACCAGCAG-GCAAGATTTTCAGACTTTCT64R-1122GGGGTACCTGAGGACTTAAGACAAGAT-GGTAGTGCF-1148GGGGTACCGCACTACCATCTTGTCTTA-AGTCCTCA64R-1023GGGGTACCCACTAGCTGAAGTTTAGT-CAGTGCCAF-1048GGGGTACCTGGCACTGACTAAACT-TCAGCTAG64R-922GGGGTACCACTGTTTGATTTAAAAAT-GAGGGAA

注：下劃線表示確切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。表3同。

表2序列名稱及序列位置

Table 2Name and position of sequences

序列名稱序列位置序列名稱序列位置UP-3100-3100—-2981UP-1659-1659—-1522UP-3010-3010—-2891UP-1547-1547—-1387UP-2920-2920—-2801UP-1412-1412—-1251UP-2703-2703—-1916UP-1257-1275—-1122UP-1937-1937—-1776UP-1148-1148—-1023UP-1803-1803—-1636UP-1048-1048—-922

將回收得到的上游DNA片段進(jìn)行Kpn Ⅰ酶切，酶切后產(chǎn)物用DNA純化回收試劑盒(離心柱型，TIANGEN)進(jìn)行純化回收。將酶切后回收得到的UPs目的片段與pGL4-921雙酶切產(chǎn)物按照比例進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。采用菌液PCR法篩選出陽(yáng)性菌落。挑選正向連接檢測(cè)為陽(yáng)性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3迷你內(nèi)含子系列熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建

1.3.1卵清蛋白基因第一內(nèi)含子全序列及系列分割序列克隆

參考GenBank中雞卵清蛋白基因組序列(NC_006089)，利用生物軟件Primer Premier 5和DNAMAN設(shè)計(jì)8對(duì)添加了酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增系列包含或不包含內(nèi)含子的目的片段。具體引物序列詳見(jiàn)表3。方法同上。

1.3.2迷你內(nèi)含子系列載體構(gòu)建

以純化回收得到的OV基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增目的片段OV+38/OV+1640/OV-合成，膠回收法純化回收PCR產(chǎn)物。方法同上。

將OV+38/OV+1640/OV-合成的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Kpn Ⅰ，Xho Ⅰ雙酶切，同時(shí)將質(zhì)粒pGL4.10 Vector進(jìn)行Kpn Ⅰ，Xho Ⅰ雙酶切。37℃酶切2 h后，將每個(gè)酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性克隆子測(cè)序鑒定。

1.4載體的表達(dá)活性檢測(cè)

1.4.1雞輸卵管上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

輸卵管上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)步驟如下：

(1)放血處死試驗(yàn)雞，盡量將血放干凈，體內(nèi)如果瘀血太多，輸卵管上也會(huì)存在大量血絲，分離上皮細(xì)胞時(shí)會(huì)有較多的紅細(xì)胞摻雜進(jìn)來(lái)。

(2)將處死的雞置于托盤中，腹部朝上，去除腹部及雞右側(cè)腿部羽毛(去除之前可噴灑醫(yī)用乙醇，避免雞毛散飛)，用滅菌剪刀剪開(kāi)腹部及雞右側(cè)皮膚，換剪刀鑷子，小心剪開(kāi)腹部肌肉，去除脂肪，取出輸卵管膨大部，置于超凈臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備好的PBS中。

(3)選擇較好的膨大部3～5 cm，用小剪刀、小鑷子小心去除膨大部外層的膜和血管。輸卵管內(nèi)層為褶皺狀，去除外層系膜有利于褶皺部展開(kāi)，消化時(shí)與胰酶充分接觸。此外，毛細(xì)血管一般分布在系膜與組織之間，去除系膜有利于去除血管，減少血細(xì)胞的污染。

表3PCR引物序列及酶切位點(diǎn)

Table 3Sequence of primers and their restriction sites

引物名稱產(chǎn)物名稱引物序列(5’—3’)Tm/℃OVFOVROV1GACTGACATGCATTTCATAGGTAGACTGTCTTTTGCACCCAGGT55OVR+38OVF-1338(1)OVR+1640intron-lessintron-containCCGCTCGAGCTTGAGTGCTAAAGGCAATACAGGGGGTACCGACTGACATGCATTTCATAGGTAGACCGCTCGAGGTTGTCTAGAGCAAACAGCAGA60OVF-1338(2)OVR-Sintron-deletionGGGGTACCGACTGACATGCATTTCATAGGTAGAGATA-ACATTTACTGGGAAGCACCCGCTCGAGGTTGTCTAGAGCAGAGCTCCTAGCTAGCAGTTGCTTAC-CTTTTGAGCTTGAGTGCT60OVF+57OVR+387miniintron-1CTAGCTAGCCTCTGGAATTACCTTCTCTCTATTAGCCGAGCTCACTGAACACCATGATTTTGCTC60OVF+368OVR+697miniintron-2CTAGCTAGCGCAAAATCATGGTGTTCAGTGACGAGCTCTTTATATAATCTGTGAAAGTCAGAAGTCCT60OVF+678OVR+1007miniintron-3CTAGCTAGCACTTTCACAGATTATATAAATCTCAGGAAAGCCGAGCTCGCACTTTCAGGTATGGTTTGC60OVF+987OVR+1317miniintron-4CTAGCTAGCAAACCATACCTGAAAGTGCAATAGAGCCGAGCTCGTACCTCTGATTAAAACACAATCTGATAGGC60OVF+1297OVR+1627miniintron-5CTAGCTAGCCAGATTGTGTTTTAATCAGAGGTACTGACGAGCTCAACAGCAGAACAGTGAAAATGTAAGG60

圖1　第一內(nèi)含子分區(qū)示意圖Fig.1　The partition schematic of the first intron

(4)將血管、系膜去除干凈的輸卵管部分翻折，內(nèi)層朝外。利用小剪刀的把手進(jìn)行刮除附著的黏液成分，在PBS中進(jìn)行徹底的清洗。(去除膜以后的輸卵管組織特別薄，不能用尖銳利器進(jìn)行刮除)。

(5)將清洗干凈的組織整塊至于適量0.2%膠原酶中，水浴鍋中預(yù)熱5 min，然后于37℃搖床85 r·min-1消化5～8 min，250 g離心4 min，去除上清，PBS清洗2遍，離心去上清。

(6)加入3倍體積的胰酶37℃搖床85 r·min-1消化10～15 min，超凈臺(tái)內(nèi)吹打數(shù)次，取少量消化液顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量。若細(xì)胞數(shù)較少，可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，若能夠觀察到大量密布細(xì)胞時(shí)即可終止消化。

(7)將吹打數(shù)次的消化液于200目篩過(guò)濾，將濾液收集入新的50 mL離心管中，加入適量血清終止胰酶的消化，250 g離心4 min，去除上清。PBS清洗2次，離心去上清。

(8)加入適量PBS進(jìn)行洗滌，250 g離心4 min后去除上清，加入適量含10%胎牛血清、1% 雙抗的DMEM重懸，混勻后置于10 cm培養(yǎng)板中，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照l(shuí)ipofecatmine 2000(Thermo Fisher)試劑使用說(shuō)明書(shū)。

1.4.2熒光素酶活性測(cè)定

利用ONE-Glo Luciferase Assay system(Promega)對(duì)不同重組表達(dá)載體在細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)步驟如下：

(1)提前將光柵式多功能酶標(biāo)儀開(kāi)啟，設(shè)定化學(xué)發(fā)光測(cè)定程序。

(2)準(zhǔn)備進(jìn)行熒光素酶活性測(cè)定的細(xì)胞去除培養(yǎng)液，PBS清洗2～3遍。

(3)向每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL PBS+150 μL ONE-Glo反應(yīng)液，避光，室溫條件下輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板將細(xì)胞充分裂解(至少3 min)。

(4)將24孔板中的細(xì)胞裂解液吹打數(shù)次，每孔取200 μL裂解液吸取至白色96孔酶標(biāo)板。

(5)將加入裂解液的96孔酶標(biāo)板放入多功能酶標(biāo)儀，測(cè)定熒光素酶活性。

2　結(jié)果與分析

2.1雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列系列變異載體構(gòu)建成功

2.1.1pGL4-UPS表達(dá)載體菌液PCR陽(yáng)性結(jié)果

上游調(diào)控序列各片段PCR產(chǎn)物回收之后，12個(gè)片段均介于120～200 bp之間，符合預(yù)期大小。所有重組質(zhì)粒的菌液PCR檢測(cè)以pGL4.10載體上的pGL3+(TAGCAAAATAGGCTGTCCC)為上游引物，OVsR為下游引物，12個(gè)重組載體中的目的片段大小存在一定差異，所以經(jīng)PCR擴(kuò)增后，正確的連接將會(huì)分別擴(kuò)增出介于200～300 bp之間，約為220 bp左右的片段。圖2顯示為其中一個(gè)表達(dá)載體PGL4-UP-2073菌液PCR呈陽(yáng)性，所有測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明該載體構(gòu)建成功。

2.1.2pGL4-UPS表達(dá)載體構(gòu)建的酶切鑒定成功

菌液鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，選取測(cè)序無(wú)突變克隆子提取質(zhì)粒，Kpn Ⅰ，EcoRⅤ雙酶切鑒定。所有質(zhì)?？傞L(zhǎng)度均為5 000 bp左右，經(jīng)Kpn I，EcoRⅤ雙酶切后，將質(zhì)粒切成長(zhǎng)度分別為4 020，921和120～160 bp的3部分。由圖3可見(jiàn)，所有質(zhì)粒的酶切檢測(cè)均獲得預(yù)期片段，質(zhì)粒構(gòu)建成功。泳道1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31，34為構(gòu)建的12個(gè)重組質(zhì)粒。每個(gè)質(zhì)粒后的2個(gè)泳道分別為相應(yīng)質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ的單酶切和Kpn Ⅰ，EcoRⅤ雙酶切電泳圖。

圖2　pGL4-UP-2073正連接菌液PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2　PCR result of the positive ligation of pGL4-UP-2073 plasmid

泳道1，4，7，10，13，16，19，22，25，28，31，34為構(gòu)建的12個(gè)重組質(zhì)粒；泳道2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，35為各質(zhì)粒經(jīng)由EcoR Ⅴ的單酶切；泳道3，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36為各質(zhì)粒經(jīng)由Kpn Ⅰ，EcoR Ⅴ雙酶切。圖3　pGL4-UPs質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.3　Results of restriction enzyme digestion for pGL4-UPs plasmids

2.2迷你內(nèi)含子系列載體成功構(gòu)建

2.2.1卵清蛋白基因第一內(nèi)含子序列成功克隆

利用PCR方法克隆雞卵清蛋白基因第一內(nèi)含子-1 338～+1 798位置的目的片段，純化回收后電泳圖。由圖4可見(jiàn)，目的基因長(zhǎng)度為3 136 bp，目的條帶的位置符合預(yù)期，克隆成功。

2.2.2基礎(chǔ)載體及迷你內(nèi)含子系列載體成功構(gòu)建

經(jīng)過(guò)菌液PCR陽(yáng)性篩選和測(cè)序驗(yàn)證之后，將無(wú)序列突變質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，如圖5所示，所有質(zhì)粒的酶切檢測(cè)均獲得預(yù)期片段，質(zhì)粒構(gòu)建成功。泳道1，4，7，10，13，16為構(gòu)建成功的質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒后的2個(gè)泳道分別為相應(yīng)質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ單酶切和Kpn Ⅰ，EcoRⅤ雙酶切電泳圖。

2.3載體的表達(dá)活性效果驗(yàn)證

2.3.1雞輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)良好

由圖6可見(jiàn)，本試驗(yàn)成功地從產(chǎn)蛋母雞的輸卵管分離到上皮細(xì)胞，呈現(xiàn)出良好的上皮細(xì)胞形態(tài)，成纖維細(xì)胞較少。

圖4　第一內(nèi)含子序列克隆回收后凝膠電泳圖Fig.4　Gel electrophoresis of the first-intron sequence after cloning and purification

泳道1，4，7，10，13，16為構(gòu)建成功的質(zhì)粒；泳道2，5，8，11，14，17為各質(zhì)粒經(jīng)由EcoRV單酶切；泳道3，6，9，12，15，18為個(gè)質(zhì)粒經(jīng)由KpnI，EcoRV雙酶切。圖5　pGL4-mini-introns質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.5　Results of restriction enzyme digestion for pGL4-mini-introns plasmids

圖6　雞輸卵管上皮細(xì)胞形態(tài)Fig.6　Cell morphology of chicken oviduct epithelial cell

2.3.2確定最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)，將電轉(zhuǎn)染電壓初步設(shè)定為250 V，利用293T細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)染時(shí)間的優(yōu)化，將電擊時(shí)間設(shè)1，3，5，7，9，11 ms等6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果顯示在同等電壓下，7 ms以上細(xì)胞死亡率達(dá)30%以上，1 ms時(shí)，轉(zhuǎn)染效率很低，在保證細(xì)胞成活率的前提下，選擇5 ms作為最佳電擊時(shí)間。根據(jù)此結(jié)果，在輸卵管上皮細(xì)胞上進(jìn)行電轉(zhuǎn)染條件的進(jìn)一步優(yōu)化。以250 V，5 ms為基礎(chǔ)，固定電擊時(shí)間，設(shè)150，200，250，300，350 V等5個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：300 V，5 ms條件時(shí)，相較于低電壓電轉(zhuǎn)條件，死亡細(xì)胞數(shù)稍多，懸浮于培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染效率高，可達(dá)20%左右，如圖7所示，而電壓為350 V時(shí)細(xì)胞死亡數(shù)過(guò)多，不利于后續(xù)試驗(yàn)，因此確定最佳電轉(zhuǎn)染條件為300 V，5 ms。

圖7　雞輸卵管上皮細(xì)胞電轉(zhuǎn)染效果Fig.7　Electric transfection efficiency of chicken oviduct epithelial cell

2.3.3卵清蛋白基因上游調(diào)控序列表達(dá)活性

熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pGL4-UP-1412表達(dá)活性最強(qiáng)(圖8)，表明在雞卵清蛋白基因上游-1 412～-1 251 bp序列部分可能存在有效調(diào)控元件。

2.3.4迷你內(nèi)含子系列載體表達(dá)活性

熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，內(nèi)含子重組質(zhì)粒pGL4-mini-intron-3表達(dá)活性最強(qiáng)(圖9)，說(shuō)明在內(nèi)含子+678～+1 008位置存在對(duì)轉(zhuǎn)錄活性有增強(qiáng)作用的區(qū)域。整體比較pGL4-mini-intron-1，pGL4-mini-intron-2，pGL4-mini-intron-3，pGL4-mini-intron-4和pGL4-mini-intron-5，結(jié)果顯示，表達(dá)活性呈先降后升的趨勢(shì)，表明在+1 298～+1 628區(qū)域可能存在表達(dá)抑制性因子。同時(shí)推斷出若干包含增強(qiáng)子序列區(qū)域。

圖8　pGL4-Ups質(zhì)粒熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果Fig.8　Luciferase activity of pGL4-UPs plasmids

圖9　pGL4-mini intron質(zhì)粒熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果Fig.9　Luciferase activity of pGL4-mini intron plasmids

3　結(jié)論與討論

與哺乳動(dòng)物相比，禽蛋作為表達(dá)重組蛋白的載體，具有多方面顯著優(yōu)勢(shì)：家禽繁殖周期短，能在較短周期內(nèi)建群；家禽飼養(yǎng)成本低、產(chǎn)蛋量高，一段濕質(zhì)量50 g的產(chǎn)卵期輸卵管膨大部每天能產(chǎn)生4 g蛋白，蛋白合成分泌的效率驚人；卵白中的蛋白不會(huì)漏入血液循環(huán)，危害動(dòng)物本身的健康；禽蛋蛋白成分簡(jiǎn)單，具有天然無(wú)菌環(huán)境，穩(wěn)定性好，便于提取純化；輸卵管細(xì)胞能表達(dá)糖蛋白和磷蛋白等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)較牛羊乳腺更接近于人[4]；SPF飼養(yǎng)技術(shù)成熟，產(chǎn)品安全性高等。以上特點(diǎn)使家禽被視為生產(chǎn)重組蛋白的理想生物反應(yīng)器體系，其生產(chǎn)成本有可能降至細(xì)胞培養(yǎng)法的1%以下，也大大低于轉(zhuǎn)基因牛羊。蛋白中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定，藥物蛋白在雞蛋中有比較長(zhǎng)的半衰期，因此禽類輸卵管生物反應(yīng)器以其卓越的優(yōu)勢(shì)必將成為生物科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，必將成為研究和投資的重點(diǎn)，成為醫(yī)療性蛋白生產(chǎn)的理想途徑。

商業(yè)化的載體所容納外源基因具有一定的長(zhǎng)度限制，因此，在表達(dá)載體的有限長(zhǎng)度內(nèi)，對(duì)表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行優(yōu)化，是一種現(xiàn)實(shí)有效的途徑，也是國(guó)際性的研究熱點(diǎn)。此外，外源基因的表達(dá)量高低，除受到基因組插入位置效應(yīng)的影響外，主要與轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)啟動(dòng)子等元件的活性有關(guān)，單純截取卵清蛋白基因上游的調(diào)控序列片段，難以獲得根本性的改善。在本試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，制備出具有表達(dá)活性高、組織特異性強(qiáng)的優(yōu)化型啟動(dòng)子，調(diào)控蛋白基因的高效表達(dá)，從而解決載體容納量低和外源基因在體內(nèi)表達(dá)量低的問(wèn)題。

生物反應(yīng)器可以生產(chǎn)種類繁多的有用蛋白，包括單克隆抗體、疫苗、激素、生長(zhǎng)因子、酶、血清蛋白等，這些大多難于從自然界原料中分離提取，或者自然界根本不存在。微生物(大腸埃希菌和酵母)發(fā)酵表達(dá)系統(tǒng)是目前最為常見(jiàn)的基因工程蛋白生產(chǎn)手段，但對(duì)于眾多具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白而言，難于從微生物獲得正確表達(dá)，立體構(gòu)造和翻譯后修飾狀態(tài)的不同，影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，需要借助高等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或動(dòng)物個(gè)體來(lái)進(jìn)行重組蛋白生產(chǎn)。

本研究成功獲得pGL4-UP-2703，pGL4-UP-1937，pGL4-UP-1803，pGL4-UP-1659，pGL4-UP-1547，pGL4-UP-1412，pGL4-UP-1257，pGL4-UP-1148，pGL4-UP-1048，pGL4-UP-3100，pGL4-UP-3010，pGL4-UP-2920等12種雞卵清蛋白上游調(diào)控序列重組報(bào)告基因載體；及pGL4-intron-contain，pGL4-intron-less，pGL4-intron-delation，pGL4-mini-intron-57，pGL4- mini-intron-368，pGL4- mini-intron-678，pGL4- mini-intron-988，pGL4- mini-intron-198等8種雞卵清蛋白第一內(nèi)含子迷你化重組報(bào)告基因載體；成功分離培養(yǎng)了雞輸卵管原代上皮細(xì)胞，并優(yōu)化電轉(zhuǎn)染條件，為后期實(shí)驗(yàn)研究提供了有用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；所構(gòu)建的載體均具有調(diào)控?zé)晒馑孛富虮磉_(dá)的活性。通過(guò)比較UPs等20種序列的啟動(dòng)子活性，為找出存在于雞卵清蛋白基因上游調(diào)控序列中及第一內(nèi)含子中的增強(qiáng)子、抑制子等功能性區(qū)域提供了新的數(shù)據(jù)，但要制作出高活性、高特異性的啟動(dòng)子還須進(jìn)一步探索研究。

[1]LILLICO S G，SHERMAN A，MCGREW M J，et al.Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104(6):1771-1776.

[2]KWON S C，CHOI J W，JANG H J，et al.Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white [J].Biology of Reproduction，2010，82(6):1057-1064.

[3]ZHU L，VAN DE LAVOIR M C，ALBANESE J，et al.Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens [J].Nature Biotechnology，2005，23(9):1159-1169.

[4]PALEYANDA R K，VELANDER W H，LEE T K，et al.Transgenic pigs produce functional human factor Ⅷ in milk [J].Nature Biotechnology，1997，15(10):971-975.

(責(zé)任編輯盧福莊)

本刊目前僅刊載黑白圖，請(qǐng)勿使用彩圖，圖片的分辨率不能低于600 dpi。圖中縱橫軸標(biāo)值要求圓整化且成等差，標(biāo)值線一律朝內(nèi)。柱狀圖先用不同灰度加以區(qū)別；線圖圖例優(yōu)先使用○●△▲◇◆。半欄圖的寬度宜控制在6.0～7.5 cm，且圖寬度和高度比以3∶2為宜；通欄圖的寬度宜控制在15.0 cm以內(nèi)。相近內(nèi)容的圖最好組合在一起作為一圖出現(xiàn)，各小圖可分別用大寫(xiě)英文字母A，B，C等標(biāo)識(shí)。

4.10參考文獻(xiàn)

參考文獻(xiàn)應(yīng)只列出與本研究切實(shí)相關(guān)，在文稿中實(shí)際引用的文獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)采用順序編碼制，即按在文中引用的先后順序編輯和著錄。請(qǐng)盡量選用新近發(fā)表在權(quán)威學(xué)術(shù)期刊上的文獻(xiàn)。所有參考文獻(xiàn)均須按本刊格式譯成英文(中文文獻(xiàn)須英漢對(duì)照)。無(wú)論中英文署名，一律姓先名后，對(duì)于外文作者，姓全部大寫(xiě)，名用縮寫(xiě)、大寫(xiě)，但不加縮寫(xiě)點(diǎn)。其他參考文獻(xiàn)格式要求同GB/T 7714—2015《信息與文獻(xiàn) 參考文獻(xiàn)著錄規(guī)則》。

例：

[1]CHANEY R L,MALIK M,YIN M L,et al.Phytoremediation of soil metals[J].Current Opinion in Biotechnology,1997,8(3):279-284.

(外文期刊)

[2]蔣明金，馬均，孫永健，等.播種量和氮肥運(yùn)籌對(duì)直播雜交稻光合生產(chǎn)力及氮素利用的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版),2015,41(5):516-526.DOI:10.3875/j.issn.1008-9209.2015.07.101.(in Chinese with English abstract)

JIANG M J,MA J,SUN Y J,et al.Effects of seeding rates and nitrogen fertilizer managements on photosynthetic productivity and nitrogen utilization in direct-seeded rice[J].Journal of Zhejiang University (Agric.&Life Sci.),2015,41(5):516-526.DOI:10.3875/j.issn.1008-9209.2015.07.101.(in Chinese with English abstract)

(帶英文摘要的中文期刊)

[3]朱月清.有機(jī)肥施用量對(duì)瓠瓜浙蒲6號(hào)生長(zhǎng)的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015 (10):1561-1562.

ZHU Y Q.Effects of organic fertilizer on growth of bottle gourd cv.Zhepu No.6[J].Journal of Zhejiang Agricultural Sciences,2015 (10):1561-1562.(in Chinese)

(中文期刊)

[4]畢艷蘭.油脂化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:70,78.

BI Y L.Oil chemistry[M].Beijing:Chemical Industry Press,2005:70,78.(in Chinese)

(中文圖書(shū))

[5]田生科.超積累東南景天(Sedum alfredii Hance)對(duì)重金屬(Zn/Cd/Pb)的解毒機(jī)制[D].杭州:浙江大學(xué),2010.

TIAN S K.Mechanisms behind detoxification of heavy metals (Zn/Cd/Pb) in the hyperaccumulator Sedum alfredii Hance[D].Hangzhou:Zhejiang University,2010.(in Chinese with English abstract)

(學(xué)位論文)

4.11謝辭

如有需要致謝的內(nèi)容，可在正文與參考文獻(xiàn)之間另起一段，不要寫(xiě)在首頁(yè)的題注中。謝辭要簡(jiǎn)明扼要，僅對(duì)研究工作或論文撰寫(xiě)有實(shí)際幫助(資助)者致謝。

Cloning and vector construction of chicken ovalbumin gene regulatory sequences

HUANG Jing，ZHU Zhi-wei，CHEN Xiao-yu，YU Fu-xian，PAN Jian-zhi*

(Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China)

There was only one allele of ovalbumin gene in the chicken genome，but it could synthesize and secrete 2 g protein per day，which were accounting for more than 50% of the albumin protein and became the preferred choice in the regulation of exogenous gene expression.This study aimed to identify promoter enhancer and tissue-specific regional location factor by screening the optimization of ovalbumin gene promoter.The upstream -922～-2 073 and -2 801～-3 100 of ovalbumin promoter were divided into 12 regional which average sequence length were about 150 bp，and inserted into the upper reaches of -921～+38 sequences，those 12 series successfully constructed expression vectors provided materials for further optimization promoter with a shortened version.The first intron region of ovalbumin promoter was truncated around 300 bp of mini intron sequences，and successfully constructed 8 mini intron series of vectors.We also successfully separated chicken oviduct epithelial cells and optimized the electricity transfection conditions.In this study，the promoter region with strongest activity pGL4-UP-1412 and pGL4-mini-intron-3 were screened through detected luciferase activity of the initial screening recombinant plasmid and intron recombinant，while inferred several regions containing enhancer sequence.

ovalbumin gene;regulation sequences;vector;luciferase activity

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):412-419http://www.zjnyxb.cn

黃菁，朱志偉，陳曉宇，等.雞卵清蛋白基因調(diào)控序列的克隆與載體構(gòu)建[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，28(3):412-419.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.09

2015-09-15

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ12C17002)

黃菁(1983—)，女，浙江舟山人，博士，助理研究員，從事動(dòng)物生物工程研究。E-mail：xiaojingyu1102@gmail.com

，潘建治，E-mail:jzpan9@126.com

S831，Q785

A

1004-1524(2016)03-0412-08

2016-01-08)