不同品種鴨胚胎期骨骼肌成肌細胞GHR和IGF-1 mRNA表達差異分析

姬改革，陶志云，朱春紅，束婧婷，劉宏祥，徐文娟，胡　艷，李慧芳

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇 揚州 225003)

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不同品種鴨胚胎期骨骼肌成肌細胞GHR和IGF-1 mRNA表達差異分析

姬改革，陶志云，朱春紅，束婧婷，劉宏祥，徐文娟，胡艷，李慧芳*

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇省家禽遺傳育種重點實驗室，江蘇 揚州 225003)

為探討生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)和胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)在不同品種鴨胚胎期骨骼肌成肌細胞中的表達差異。選擇生長速度不同的金定鴨和高郵鴨為試驗動物，采用實時熒光定量PCR方法檢測鴨13，15，17，19，21和23胚齡時胸肌和腿肌成肌細胞GHR，IGF-1 mRNA的表達情況，并進行了品種間比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：13胚齡時，高郵鴨胸肌和腿肌成肌細胞IGF-1的表達均顯著高于金定鴨(P<0.05)；17胚齡是兩個品種鴨GHR和IGF-1共同的表達高峰期；17胚齡之后，鴨胸肌和腿肌成肌細胞GHR和IGF-1表達均顯著降低。在19，21胚齡時，高郵鴨胸肌成肌細胞2個基因的表達均顯著高于金定鴨(P<0.05)，而腿肌成肌細胞GHR和IGF-1表達在品種間無顯著差異(P>0.05)。鴨胚胸肌和腿肌成肌細胞GHR和IGF-1表達呈現(xiàn)極顯著的正線性相關(guān)(P<0.01)。提示：GHR和IGF-1的表達譜及各自在品種間的變化規(guī)律基本一致；鴨胚骨骼肌成肌細胞GHR和IGF-1 mRNA表達有組織特異性，二者之間可能存在正調(diào)控的作用機制。

鴨；胚胎；成肌細胞；GHR；IGF-1

生長激素受體(GHR)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)在動物骨骼肌發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。動物的生長受到生長軸“下丘腦—垂體—靶器官”上的激素及受體組成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控，生長激素(growth hormone，GH)與IGF-1都是生長軸上的重要因子。GH處于生長軸的中心環(huán)節(jié)，可以通過與肝臟或肝外組織細胞膜表面的GHR結(jié)合，介導(dǎo)產(chǎn)生IGF-1，IGF-1以內(nèi)分泌或旁分泌與骨骼肌上的受體結(jié)合，激活下游的信號因子，啟動基因表達，促進蛋白質(zhì)合成、細胞分裂等；或者不通過IGF-1[1]，直接作用于骨骼肌上的GHR發(fā)揮其作用。

肌肉的基本單位是肌纖維，是由成肌細胞增殖、分化與融合形成。胚胎期成肌細胞的增殖與分化能力的大小對肌肉產(chǎn)量的提高具有重要意義[2-3]。關(guān)于GH對成肌細胞的作用，目前主要集中在哺乳動物。在小鼠中，體內(nèi)和體外的實驗表明，GH可以通過介導(dǎo)IGF-1促進成肌細胞的增殖與融合[4-6]；但也有研究認為，GHR可以不通過IGF-1調(diào)控成肌細胞的增殖與分化[7]。在雞上，體內(nèi)體外的試驗表明[8-9]，IGF-1可促進成肌細胞的增殖與分化。鴨作為水禽的代表，其生長發(fā)育與哺乳動物、雞等具有不同的特點。有關(guān)GHR和IGF-1在鴨成肌細胞的表達變化規(guī)律尚未見報道。

在前期研究中我們也已經(jīng)建立一套完善的分離與培養(yǎng)體系[10]，本試驗以高郵鴨和金定鴨為研究對象，提取不同時間點鴨胚骨骼肌成肌細胞，采用實時熒光絕對定量分析技術(shù)，對GHR和IGF-1的mRNA表達量進行比較分析，初步揭示鴨胚胎期骨骼肌成肌細胞中GHR和IGF-1基因表達的品種差異和時空特點，為提高鴨的肌肉產(chǎn)量，和品種選育等提供可借鑒的遺傳學(xué)資料。

1　材料與方法

1.1實驗動物

在相同的日糧水平下，收集高郵鴨和金定鴨種蛋。種蛋孵化前，進行稱量、消毒和編號，品種內(nèi)蛋質(zhì)量變異系數(shù)在2%以內(nèi)。2個品種種蛋隨機置入同一孵化箱，在相同條件下同時孵化。種蛋入孵后的24 h設(shè)定為1胚齡，分別于6個時間點(13，15，17，19，21和23胚齡)取5～8個鴨胚，用于胸肌和腿肌成肌細胞的提取。

1.2主要試劑和儀器

DMEM和FBS購于Hyclone公司；胰蛋白酶，Ⅰ型膠原酶購自Sigma公司；青霉素-鏈霉素溶液購自碧云天生物技術(shù)研究所，Percoll細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司。TRNzol-A+總RNA提取試劑、SuperReal PreMix、Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒購自TIANGEN公司；DNA Marker DL2000為TaKaRa公司產(chǎn)品。倒置顯微鏡(日本尼康公司)；9700PCR儀和Max3000P熒光定量PCR儀(愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)上海有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 2500)；紫外分光光度計(GeneQuant Ⅱ，Pharmacia Biotech)。

1.3鴨胚胎期骨骼肌原代成肌細胞的提取

無菌分離鴨胚胸肌和腿肌，用PBS清洗，去除脂肪及筋膜后，將肌肉剪為肉糜，加入1倍體積的混合酶(膠原酶和胰蛋白酶)消化5～10 min，用FBS終止消化。被消化下來的細胞經(jīng)不同孔徑的濾膜(50目～400目)過濾后，500 g離心10 min，去上清，細胞團重懸在DMEM培養(yǎng)基中。將重懸的細胞液加入到含60%，20% Percoll的不連續(xù)密度梯度Percoll柱中，800 g，離心25 min。小心取出60%和20% Percoll兩層之間的云霧狀細胞至新的離心管。添加少量DMEM并混勻，500 g離心10 min，棄上清，用適量DMEM液懸浮，吸管吹吸，將細胞團塊吹散，計數(shù)后將所得成肌細胞調(diào)整單細胞懸液密度為106cells·mL-1。

1.4總RNA提取和cDNA合成

將所得的單細胞懸液分裝至2 mL離心管中，每管1 mL，每個時間點分裝6～8管。500 g離心5 min后，去上清。將所得的細胞沉淀加入1 mL Trizol裂解液，保存在-20℃，用于總RNA提取。成肌細胞總RNA 提取，按總RNA提取試劑盒的說明書進行。所得的RNA用DEPC水溶解后，用1.4%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測純度和含量，保證RNA樣品質(zhì)量可靠，計算樣品總RNA濃度。經(jīng)檢測合格的總RNA樣品，取1 μg按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進行cDNA 第1鏈的合成。用內(nèi)參基因β-actin檢測cDNA合成質(zhì)量以及是否有基因組DNA污染。RT產(chǎn)物保存在-20℃用于PCR檢測。

1.5引物設(shè)計、目的片段標(biāo)準(zhǔn)品的制備

根據(jù)GenBank中相關(guān)序列設(shè)計引物，由上海英駿生物工程有限公司合成(表1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠鑒定后，用DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒純化回收目的片段，與pGM-T載體相連接，然后轉(zhuǎn)化Escherichia coli TOP10感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化子于含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1振搖培養(yǎng)過夜，用PCR鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，所獲序列結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中公布的已知基因進行序列同源性比較。比對正確后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取陽性克隆的質(zhì)粒，用分光光度計測其濃度后作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。

1.6熒光實時定量PCR

所用熒光定量PCR采用SYBR Green Ⅰ法。將上述經(jīng)測序驗證后正確的含GHR,IGF-1基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，分別做10n梯度稀釋。將每個待測樣品RT產(chǎn)物取等體積混合，用混合樣(cDNA mix)和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，包括標(biāo)準(zhǔn)品稀釋梯度范圍、目的基因和內(nèi)參基因引物設(shè)計和合成、最佳退火溫度、引物濃度、模板濃度等，確定好最佳反應(yīng)條件。根據(jù)最佳反應(yīng)條件，將待測樣品進行稀釋。將稀釋后的樣品與梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品在同一個試驗中進行定量PCR，每次反應(yīng)均設(shè)陰性對照，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(標(biāo)準(zhǔn)曲線由系統(tǒng)軟件自動分析獲得)計算出待測樣品目的基因的拷貝數(shù)。

表1基因引物序列

Table 1The primer sequences of the target genes

目的基因PCR產(chǎn)物/bp引物序列PCR條件GHR170F:5'-TGGAAATTTGTATA-ACCTCACTGCT-3'R:5'-TGGCAAGCTTAACA-CAGTATGGT-3'55℃,30sIGF-I182F:5'-CTGGTTGATGCTCT-TCAGTTCGTAT-3'R:5'-GCAGACTTAGGTG-GCTTTATTGGA-3'60℃,20s

1.7統(tǒng)計分析

運用SPSS 20.0軟件中One-way ANOVA，t 檢驗，Univarinate，Bivariate Correlation進行差異顯著性檢驗和相關(guān)性分析。所有數(shù)據(jù)以Mean ± SE表示，P<0.05，表示差異顯著；P<0.01，表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1鴨胚胸肌成肌細胞GHR，IGF-1表達

鴨胚胸肌成肌細胞GHR表達情況如圖1-A所示，GHR mRNA表達在2個品種的變化規(guī)律基本一致，都是13胚齡表達較高，15胚齡時表達下降，17胚齡時表達上升到最高，顯著高于其他胚齡(P<0.05)，隨后表達開始下降，至23胚齡時，表達量又有所上升。不同的是，高郵鴨19，21胚齡時的基因表達量與23胚齡無顯著差異，金定鴨的則是顯著低于23胚齡(P<0.05)。品種間比較，17胚齡時，金定鴨基因表達量極顯著高于高郵鴨(P<0.01)，而19～21胚齡時，則是高郵鴨的顯著高于金定鴨(P=0.009，P=0.002)。胸肌成肌細胞GHR mRNA 表達存在極顯著的日齡(P<0.01)、日齡與品種的交互效應(yīng)(P=0.002)，品種效應(yīng)不顯著(P=0.689)。

鴨胚胸肌成肌細胞IGF-1的表達如圖1-B所示，2個品種的IGF-1 mRNA變化趨勢基本一致，都是在13，15胚齡時表達較高，17胚齡的表達量顯著高于其他胚齡(P<0.05)，19胚齡時，表達顯著下調(diào)，之后至21～23胚齡時，又逐漸回升；但高郵鴨13胚齡時的表達量與17胚齡無顯著差異(P=0.769)，金定鴨的則是13胚齡表達顯著低于17胚齡(P<0.05)。品種間比較，13，19，21胚齡時，高郵鴨IGF-1基因表達顯著高于金定鴨(P<0.01)，與之相反，17胚齡時金定鴨的顯著高于高郵鴨(P<0.01)。胸肌成肌細胞IGF-1 mRNA 表達存在極顯著的日齡(P<0.01)、日齡與品種的交互效應(yīng)(P<0.01)，品種效應(yīng)不顯著(P=0.662)。

A:GHR表達量變化；B:IGF-1表達量變化。*表示同胚齡品種間差異顯著(P<0.05)；**表示同胚齡的種間差異極顯著(P<0.01)。柱形圖上字母不同者表示同一品種不同胚齡之間差異顯著(P<0.05)。圖2同。圖1　鴨胚胸肌成肌細胞GHR，IGF-1 mRNA表達量變化Fig.1　The profiles of GHR and IGF-I mRNA expression in breast myoblast of different duck breeds

2.2鴨胚腿肌成肌細胞GHR，IGF-1表達

鴨胚腿肌成肌細胞GHR表達情況如圖2-A所示，GHR mRNA表達在2個品種的變化規(guī)律基本一致，17胚齡是表達的高峰期，顯著高于其他胚齡(P<0.05)；其他胚齡的表達趨于平緩，相互之間無顯著差異(P>0.05)。品種間比較，17胚齡時，金定鴨基因表達量顯著高于高郵鴨(P<0.01)。GHR mRNA表達存在顯著的日齡(P<0.01)、品種效應(yīng)(P<0.05)及日齡與品種的交互效應(yīng)(P<0.01)。

圖2　鴨胚腿肌成肌細胞GHR，IGF-1 mRNA表達量變化Fig.2　The profiles of GHR and IGF-I mRNA expression in leg myoblast of different duck breeds

鴨胚腿肌成肌細胞IGF-1的表達如圖2-B所示，2個品種的IGF-1 mRNA表達變化規(guī)律基本一致，都是13，15胚齡時表達較高，至17胚齡時，上升至最高(P<0.05)，19胚齡時則顯著下調(diào)，并持續(xù)至23胚齡；但高郵鴨13胚齡的基因表達量與17胚齡無顯著差異(P=0.506)。品種間比較，13胚齡時，高郵鴨的表達量高于金定鴨的2倍之多(P<0.05)，17胚齡則相反(P<0.01)。IGF-1 mRNA 表達存在極顯著的日齡效應(yīng)(P<0.01)、日齡與品種的交互效應(yīng)(P<0.01)，品種效應(yīng)不顯著(P=0.356)。

2.3鴨不同品種成肌細胞GHR與IGF-1表達的相關(guān)性

表2表明，2個品種的胸肌成肌細胞GHR與IGF-1 mRNA的表達呈極顯著的正線性相關(guān)(r=0.899，P<0.01；r=0.862，P<0.01)；金定鴨腿肌成肌細胞GHR與IGF-1 mRNA表達的相關(guān)性(r=0.951，P<0.01)略高于高郵鴨(r=0.784，P<0.01)。

表2成肌細胞GHR，IGF-1 mRNA表達量的相關(guān)性分析

Table 2Correlation analysis between GHR and IGF-1 mRNA expression in myoblast

組織品種相關(guān)系數(shù)P值胸肌金定鴨0.899<0.01高郵鴨0.862<0.01腿肌金定鴨0.951<0.01高郵鴨0.784<0.01

3　討論

GH要與骨骼肌上GHR結(jié)合，才能發(fā)揮生物學(xué)作用。因此，動物的生長速度及各器官發(fā)育的優(yōu)先順序，很大程度上要受骨骼肌上的GHR及與之相關(guān)的基因表達的時空特異性影響。為了揭示成肌細胞GHR和IGF-1 mRNA的變化規(guī)律，選擇生長發(fā)育存在明顯表型差異的金定鴨和高郵鴨為試驗動物，檢測了鴨胚骨骼肌成肌細胞GHR和IGF-1 mRNA的表達，并進行了品種間比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成肌細胞GHR和IGF-1 mRNA各自的發(fā)育性表達變化特征在品種間基本一致，與之前肌肉中的研究結(jié)果相似[11-12]。17胚齡是GHR和IGF-1 mRNA共同的表達高峰期，基因的表達升高[7，13]，會促進成肌細胞向分化的方向轉(zhuǎn)變[7，13]，這個時期可能是成肌細胞分化的高峰期，也是肌纖維數(shù)量形成的高峰期。17胚齡之后，高郵鴨胸肌成肌細胞GHR mRNA的表達趨于平穩(wěn)，且在19，21胚齡時，顯著高于金定鴨；IGF-1的表達與之類似，推測在17胚齡之后，高郵鴨胸肌成肌細胞增殖與分化活性高于金定鴨，最終導(dǎo)致在25胚齡時，高郵鴨的胸肌質(zhì)量顯著高于金定鴨[14]。腿肌成肌細胞GHR，IGF-1 mRNA表達則在各胚齡間無顯著差異，與胚胎發(fā)育后期，腿肌重[14]、肌纖維直徑、面積等[15]在品種間無顯著差異相對應(yīng)。

Mavalli等[5]在小鼠上研究認為，GH主要是通過與靶器官上的GHR結(jié)合，介導(dǎo)成肌細胞產(chǎn)生IGF-1，促進成肌細胞分化為肌管。也有報道指出，GH促進成肌細胞的分化，不是通過介導(dǎo)IGF-1來實現(xiàn)的[7]。本試驗結(jié)果顯示，胸肌和腿肌成肌細胞GHR表達與各自的IGF-1表達規(guī)律基本一致，呈正相關(guān)，提示GHR的表達可能發(fā)揮著正調(diào)控作用，通過調(diào)節(jié)IGF-1的表達來調(diào)節(jié)成肌細胞向增殖或分化的方向轉(zhuǎn)變。GHR表達量低時，IGF-1的表達量維持在低水平，大量成肌細胞更多地進入到G2/M期，使該時期所占時相增加，向增殖方向轉(zhuǎn)變；GHR表達升高，介導(dǎo)IGF-1表達升高，促進成肌細胞向分化轉(zhuǎn)變，基因表達量的變化，對應(yīng)于成肌細胞增殖與分化轉(zhuǎn)變[15]。因此，17胚齡之后，隨著基因的表達顯著下調(diào)，成肌細胞更多地向增殖方向轉(zhuǎn)變，相應(yīng)的肌纖維密度下降[16]。

13胚齡時，胸肌成肌細胞GHR表達在品種間無顯著差異，但IGF-1表達是高郵鴨顯著高于金定鴨，且與17胚齡時的高郵鴨IGF-1表達無顯著差異。同樣的情況也出現(xiàn)在腿肌成肌細胞IGF-1的表達上，說明高郵鴨骨骼肌成肌細胞比金定鴨多了一個13胚齡IGF-1的表達高峰期。由于IGF-1可以促進成肌細胞的分化，可能高郵鴨比金定鴨多了一個成肌細胞分化的高峰期。盡管高郵鴨胸肌和腿肌成肌細胞都存在13胚齡的表達高峰期，但13胚齡時僅有胸肌質(zhì)量表現(xiàn)出品種差異[14]，這可能與胸肌和腿肌成肌細胞表面分布的IGF-1受體數(shù)量不同有關(guān)[17]。

在雞上的研究認為，禽類胚胎期血液中IGF-1主要來源于肝外其他組織[18-19]。在鴨上，13胚齡時，已檢測到肝臟中IGF-1 mRNA表達，并且呈現(xiàn)極顯著的品種差異[20]，與13胚齡時，成肌細胞IGF-1 mRNA表達出現(xiàn)品種差異相一致。IGF-1作為一種內(nèi)分泌和旁分泌激素，鴨胚胎期骨骼肌成肌細胞IGF-1的分泌，可能受到肝源性IGF-1的影響，可能是使骨骼肌發(fā)育表現(xiàn)出品種差異的因素之一。Ge等[21]在牛成肌細胞上的研究認為，GH對成肌細胞的影響具有物種依賴性。在鴨上，GH是否通過介導(dǎo)IGF-1調(diào)節(jié)成肌細胞的增殖與分化，是課題組下一步的研究重點。

本研究通過檢測鴨胚成肌細胞GHR和IGF-1 mRNA表達，初步證實二者表達品種效應(yīng)不顯著，在胸肌和腿肌成肌細胞存在不同的表達模式；GHR可能通過正調(diào)控IGF-1的表達來調(diào)節(jié)成肌細胞向增殖或分化的方向轉(zhuǎn)變。

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(責(zé)任編輯盧福莊)

The expression analysis of GHR and IGF-1 mRNA in embryonic skeletal muscle myoblasts of different duck breeds

JI Gai-ge，TAO Zhi-yun，ZHU Chun-hong，SHU Jing-ting，LIU Hong-xiang，XU Wen-juan，HU Yan，LI Hui-fang*

(Jiangsu Provincial Key Laboratory of Poultry Heredity &Breeding，Jiangsu Institute of Poultry Science，Yangzhou 225003，China)

To investigate the expression patterns of growth hormone receptor (GHR) and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in duck skeletal muscle myoblasts，fluorescent real-time quantitative PCR was used to detect the distribution profile of GHR and IGF-I mRNA in skeletal muscle myoblasts of Jinding and Gaoyou ducks at the embryonic day 13，15，17，19，21 and 23.The results showed that the expressions of IGF-1 of Gaoyou ducks in breast and leg muscle myoblasts were significantly higher than that of Jinding ducks at embryonic day 13 (P<0.05);the embryonic day 17 was the common expression peak of GHR and IGF-1 both in Gaoyou ducks and Jinding ducks;and then，significantly decreased.But at the embryonic day 19 and 21，the expressions of GHR and IGF-1 in Gaoyou ducks breast muscle myoblasts were significantly higher than those of Jinding ducks (P<0.05)，while there was no significant difference between varieties in the leg muscle myoblasts (P>0.05).The expression of GHR had a significantly linear positive correlation with the expression of IGF-1 in breast and leg muscle myoblasts(P<0.01).The results showed that the expression pattern of GHR was consistent with the expression of IGF-1 between breeds;the expressions of GHR and IGF-1 mRNA in the skeletal muscle myoblasts of duck embryo showed tissue specificity，and there might be a positive regulation mechanism between them.

duck;embryo;myoblasts;GHR;IGF-1

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):406-411http://www.zjnyxb.cn

姬改革，陶志云，朱春紅，等.不同品種鴨胚胎期骨骼肌成肌細胞GHR和IGF-1 mRNA表達差異分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(3):406-411.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.08

2015-08-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(31172194)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2014362)；揚州市農(nóng)業(yè)前瞻性研究資助項目(YZ2014142)

姬改革(1985—)，女，河南洛陽人，碩士，助理研究員，從事家禽遺傳育種與資源保護研究。E-mail：jigaige@126.com

，李慧芳，E-mail∶lhfxf_002@aliyun.com

S834+.8

A

1004-1524(2016)03-0406-06