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    SgP5CS基因克隆和生物信息學(xué)分析

    2016-11-01 00:37:22金杭霞董德坤楊清華朱丹華
    關(guān)鍵詞:脯氨酸轉(zhuǎn)基因克隆

    金杭霞,董德坤,王 偉,楊清華,朱丹華,*

    (1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所,浙江 杭州 310021;2.蕭山區(qū)種子管理站,浙江 杭州 311201)

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    SgP5CS基因克隆和生物信息學(xué)分析

    金杭霞1,董德坤1,王偉2,楊清華1,朱丹華1,*

    (1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所,浙江 杭州 310021;2.蕭山區(qū)種子管理站,浙江 杭州 311201)

    利用同源克隆的方法,獲得了堿蓬P5CS基因全長(zhǎng)ORF,命名為SgP5CS。SgP5CS ORF全長(zhǎng)2 151 bp,生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)其編碼716個(gè)氨基酸組成的多肽,相對(duì)分子量為77 431.8 u,等電點(diǎn)為5.71,為穩(wěn)定的親水性蛋白,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。ClustalX多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)SgP5CS編碼的氨基酸序列與鹽角草P5CS相似性為93%,與鹽角草P5CS的親緣關(guān)系最近,其次是甜菜。脯氨酸是生物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑,而Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶則是植物合成脯氨酸的關(guān)鍵酶之一,SgP5CS的克隆將為進(jìn)一步的功能分析鑒定基礎(chǔ)。

    堿蓬;P5CS;脯氨酸

    脯氨酸在植物體內(nèi)起重要作用,不僅作為一種氨基酸構(gòu)成了蛋白結(jié)構(gòu),還能以滲透調(diào)節(jié)劑身份起到維持細(xì)胞內(nèi)水分、穩(wěn)定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等作用。在植物體中,目前已知的脯氨酸合成途徑有谷氨酸和鳥氨酸兩條途徑,而在植物遭受逆境環(huán)境時(shí),谷氨酸途徑是脯氨酸合成的主要途徑[1-2]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS,EC 2.7.2.11/ 1.2.1.41)是谷氨酸合成途徑中的限速酶,當(dāng)植物受到脅迫誘導(dǎo)時(shí),P5CS的反饋調(diào)節(jié)在控制植物脯氨酸的水平中起著重要作用[3-4]。目前已從煙草[5]、羊草[6]、桑樹[7]、苜蓿[8]、苧麻[9]、高粱[10]等多種植物中克隆到編碼該酶的基因,并且在擬南芥[11]、苜蓿[12]、小麥[13]、煙草[5]等植物中發(fā)現(xiàn),過(guò)量表達(dá)P5CS基因能提高轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)脯氨酸含量,進(jìn)而提高植物抗旱耐鹽性能。堿蓬是一種能生長(zhǎng)于海邊灘涂的鹽生植物,是研究植物耐鹽機(jī)制、挖掘耐鹽抗旱基因極好的材料。本研究利用同源克隆方法首次從堿蓬中獲得了SgP5CS基因的完整ORF序列,并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息分析,這將為后期該基因的功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ),有利于更清晰地認(rèn)識(shí)P5CS基因功能和調(diào)控機(jī)制,最終為植物基因工程提供有效耐逆基因。

    1 材料與方法

    1.1材料與處理

    堿蓬植株收集于浙江慈溪沿海灘涂,Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培至植株高為20 cm左右時(shí),采用200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)處理1 d。

    1.2方法

    1.2.1堿蓬總RNA提取

    采集200 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)處理1 d后的堿蓬嫩葉,采用Trizol(Solomon Biotechnology)法[14]提取總RNA,-70℃保存。

    1.2.2堿蓬P5CS ORF全長(zhǎng)序列的克隆

    GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)查找已發(fā)表的擬南芥等物種的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶序列,Clustalw2多序列比對(duì)后設(shè)計(jì)包含完整ORF的簡(jiǎn)并引物SgP5CS-F和SgP5CS-R(表1)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA第一條鏈。Pfu酶(TRANSGEN BIOTECH公司)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶并割膠回收,AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,回收目的片段連接到pEASY-Blunt載體(TRANSGEN BIOTECH公司)上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞,IPTG和X-gal藍(lán)白斑篩選,挑取白斑接種于5 mL LB(含 50 μg·mL-1氨芐青霉素)培養(yǎng)基中,37℃,200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆送至上海英駿公司測(cè)序。

    表1堿蓬P5CS克隆所用引物序列

    Table 1Primer sequences used in gene cloning of Suaeda glauca P5CS gene

    引物名稱引物序列(5'→3')作用SgP5CS-FATGGACGCKWCTAGAGYYTTCGTcDNA全長(zhǎng)克隆SgP5CS-RAGGCAGCGGGAGAGAGGACAAGAAcDNA全長(zhǎng)克隆

    1.2.3堿蓬P5CS的生物信息學(xué)分析

    利用NCBI的ORF Finder在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找 P5CS的開放式閱讀框,并翻譯成氨基酸。在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTp同源性分析;用ClustalX2 進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)分析,用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。Expasy軟件包中的 ProtParam 工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì);TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域;CFSSP(http://cho-fas.sourceforge.net/index.php#)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);SWISS-MODEL工具(http://swissmodel.expasy.org/)同源建模蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1堿蓬P5CS完整ORF的擴(kuò)增

    簡(jiǎn)并引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示(圖1) ,在大約2 100 bp 位置有一條清晰的條帶,與預(yù)計(jì)目的條帶大小相符,經(jīng)測(cè)序獲得2 151 bp的核苷酸序列,BLAST對(duì)比其他植物P5CS基因序列相似度較高,ORF Finder軟件確定其為完整ORF。堿基序列翻譯后與鹽角草、甜菜、雷蒙德氏棉等P5CS蛋白的氨基酸相似性達(dá)到80%以上,且氨基酸數(shù)量相同,確定克隆到的為堿蓬P5CS基因的完整ORF。

    1:DNA Marker; 2:SgP5CS 基因cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 SgP5CS PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification products of SgP5CS

    2.2堿蓬P5CS基因編碼產(chǎn)物的相似性和進(jìn)化樹分析

    將堿蓬P5CS和鹽角草、甜菜、葡萄和可可樹氨基酸相似性達(dá)到79%以上的植物的P5CS蛋白進(jìn)行相似性比對(duì)(圖2),結(jié)果表明:在氨基酸水平上堿蓬P5CS與藜科植物鹽角草高度相似,相似性達(dá)到93%,與其他植物的相似性也很高(79%~82%)。

    用MEGA 5軟件構(gòu)建氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹,從中可以發(fā)現(xiàn),在氨基酸水平上,堿蓬P5CS與鹽角草P5CS的親緣關(guān)系最近,其次是甜菜,而與水稻、棉花等關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3),這與植物分類學(xué)上的親緣關(guān)系一致,堿蓬與鹽角草、甜菜同屬藜科植物。

    2.3堿蓬P5CS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)

    NCBI的ORF Finder分析堿蓬P5CS基因的ORF序列發(fā)現(xiàn)其編碼716個(gè)氨基酸,ProtParam軟件預(yù)測(cè)其分子式為 C3407H5561N959O1046S23,原子總數(shù)為10 996,相對(duì)分子量為77 431.8 u,等電點(diǎn)為5.71,不穩(wěn)定系數(shù)為35.36。因此,該蛋白分類為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)104.61,親水性評(píng)估為-0.044,依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)的規(guī)律,該蛋白應(yīng)為親水性蛋白。

    圖2 堿蓬P5CS氨基酸序列與其他物種氨基酸序列的多重序列比對(duì)Fig.2 Multialignment of amino acid sequences of SgP5CS and other P5CSs

    圖3 堿蓬SgP5CS蛋白的進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the SgP5CS of Suaeda glauca

    堿蓬SgP5CS三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示。TMHMM軟件檢索發(fā)現(xiàn)SgP5CS蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域,意味著SgP5CS不是跨膜蛋白。通過(guò)CFSSP在線工具預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示,SgP5CS編碼的氨基酸殘基有 80.3%構(gòu)成α-螺旋,33.8%構(gòu)成β-折疊 ,12.8%構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲。

    圖4 堿蓬P5CS的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Three-dimensional constitution of the P5CS of Suaeda glauca

    3 討論

    脯氨酸是植物對(duì)抗逆境時(shí)有效的滲透調(diào)節(jié)劑,因此P5CS酶作為脯氨酸合成的關(guān)鍵酶之一,其編碼基因被認(rèn)為是植物重要的抗逆基因。在植物基因組內(nèi)插入外源P5CS基因能提高植物非生物逆境下的抗性。徐博[14]從朝鮮堿茅(Puccinellia chinampoensis)中分離到PuP5CS基因,將其轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn),在受到高鹽和低溫脅迫時(shí),能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量,以及葉綠素含量和可溶性糖含量。李鴻雁等[15]在羽衣甘藍(lán)中過(guò)表達(dá)擬南芥AtP5CS1基因,明顯改善了轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性。張霞等[16]在煙草中過(guò)表達(dá)OsP5CS基因,顯著增加了轉(zhuǎn)基因煙草脯氨酸含量及其非生物脅迫抗性。Zheng等[5]將AtP5CS和NtP5CS基因在大腸埃希菌中過(guò)來(lái)表達(dá),均能提高大腸埃希菌對(duì)高鹽、堿性、干旱、高溫與冷害環(huán)境下的抗性。Chen等[17]將菜豆PvP5CS1和PvP5CS2基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥中,在鹽脅迫下,轉(zhuǎn)基因植株比野生型積累更多的脯氨酸,并表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性。Verdoy等[12]將豇豆的P5CS基因轉(zhuǎn)入苜?;蚪M中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株組織中脯氨酸含量明顯,轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性顯著優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因植株。目前已發(fā)表的文獻(xiàn)表明,已克隆的P5CS基因在多種植物中都能發(fā)揮其增強(qiáng)植物非生物抗性的作用。這些研究結(jié)果將為轉(zhuǎn)P5CS基因的抗旱耐鹽植物真正運(yùn)用于大田生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

    本試驗(yàn)克隆了堿蓬P5CS酶的編碼基因ORF片段,并獲得了SgP5CS基因的重要的生物學(xué)信息。在今后的研究工作中,將通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行耐鹽抗旱的生理生化分析,為進(jìn)一步研究SgP5CS基因功能和作用機(jī)制,以及能否應(yīng)用于改良高等植物的耐鹽性方面提供理論依據(jù)。

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    (責(zé)任編輯張韻)

    Molecular cloning and bioinformatics analysis ofSgP5CS gene in Suaeda glauca

    JIN Hang-xia1,DONG De-kun1,WANG Wei2,YANG Qing-hua1,ZHU Dan-hua1,*

    (1.Institute of Crops and Nuclear Technology Utilization,Zhejiang Academy of Agricultural Science,Hangzhou 310021,China;2.Seed Management Station of Xiaoshan District,Hangzhou 311201,China)

    A new gene,named asSgP5CS,was cloned by homologous cloning method from Suaeda glauca.Bioinformatics analysis showed that the open reading frame ofSgP5CS gene was 2 151 bp,encoding 716 amino acids.The isoelectric point and the relative molecular weight of coded protein were 5.71 and 77 431.8 u,respectively.Hydrophobic analysis indicated thatSgP5CS was a hydrophilic protein and had no transmembrane domain.Nucleotide sequence Blast by ClustalX indicated that the coded protein ofSgP5CS shared an identity of 93% with P5CS of Salicornia europaea.Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) is a key enzyme in the synthesis of proline which is one of the important osmotic regulators in plants.Our research laid a foundation to further study the P5CS function in Suaeda glauca.

    Suaeda glauca;P5CS;proline

    浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis,2016,28(3):395-399http://www.zjnyxb.cn

    金杭霞,董德坤,王偉,等.SgP5CS基因克隆和生物信息學(xué)分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,28(3): 395-399.

    10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.06

    2015-06-29

    中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目 (2014M551772);國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng) (2014ZX0800403B)

    金杭霞(1983—),女,浙江杭州人,博士研究生,助理研究員,從事基因功能研究。E-mail:jinhangxia@126.com

    ,朱丹華,E-mail:dhzhu@mail.zaas.ac.cn

    Q943.2

    A

    1004-1524(2016)03-0395-05

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