NGF對雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長作用的機(jī)制研究

方　琳，　李世鵬，　李佳彧，　呂曉民

?

NGF對雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長作用的機(jī)制研究

方琳1，李世鵬2，李佳彧3，呂曉民4

目的探討神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)突起生長的作用機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)采用9 d的雞胚分離背根神經(jīng)節(jié)，原代培養(yǎng)法，觀察雞胚DRG的體外生長情況。通過半定量PCR檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)，采用NO檢測試劑盒檢測NO釋放水平。結(jié)果NGF能明顯促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長，同時(shí)可見NGF抑制iNOS mRNA表達(dá)，NO檢測結(jié)果顯示，添加NGF培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)上清NO分泌水平明顯降低，與陰性對照組比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論NGF可促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長，其作用與其下調(diào)iNOS mRNA表達(dá)及抑制神經(jīng)損傷因子NO釋放有關(guān)。

神經(jīng)生長因子；神經(jīng)突起；一氧化氮

神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)生長調(diào)節(jié)因子[1]，NGF的研究對神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用。NGF對腦內(nèi)、特別是基底前腦膽堿能神經(jīng)元的發(fā)生、存活、損傷的保護(hù)與修復(fù)等方面起著主要的作用。先前的研究已經(jīng)證實(shí)NGF在促進(jìn)神經(jīng)突起生長和神經(jīng)元的分化等方面都具有重要作用[2～4]。但是NGF對雞胚背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion，DRG)神經(jīng)突起生長的作用機(jī)制尚不清楚。為了進(jìn)一步探討NGF作用機(jī)制，本研究采用9日齡的雞胚背根神經(jīng)節(jié)，體外原代培養(yǎng)法，通過進(jìn)一步分析誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)，以及DRG培養(yǎng)上清中神經(jīng)損傷因子NO釋放水平，探討NGF對DRG神經(jīng)突起生長促進(jìn)作用的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料9日齡雞胚(購自長春市種雞廠)，進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)，共用雞胚60只。DMEM培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，鼠神經(jīng)生長因子(NGF) 購自武漢海特生物制藥股份有限公司，NO測定試劑盒購自Promega公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1雞胚神經(jīng)節(jié)的制備與培養(yǎng)48孔培養(yǎng)板用1 mg/ml多聚賴氨酸，37 ℃包被2 h，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3～4次備用。取9日齡的雞胚，按本室常規(guī)方法獲取雞胚背根神經(jīng)節(jié)[5，6]。在各椎孔處分別夾起神經(jīng)節(jié)，放于預(yù)先置有0.5%小牛血清DMEM培養(yǎng)液200 μl的培養(yǎng)孔內(nèi)，陰性對照組每孔加入0.5%小牛血清DMEM培養(yǎng)液200 μl；NGF 組每孔加入終濃度4 ng/ml的NGF。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，在顯微鏡下觀察DRG神經(jīng)突起的生長狀態(tài)。

1.2.2雞胚神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起的生長判定用倒置顯微鏡觀察，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較NGF組與陰性對照組的神經(jīng)突起數(shù)量和長度，由于3 d時(shí)的DRG神經(jīng)突起生長明顯，所以我們選取3 d時(shí)對神經(jīng)突起的數(shù)量與長度進(jìn)行判定。在各實(shí)驗(yàn)組分別對每個(gè)神經(jīng)節(jié)選擇5個(gè)最長的神經(jīng)突起計(jì)算平均值，以DRG邊緣作為測量的起點(diǎn)，以神經(jīng)突起的最末端為測量的終點(diǎn)[7]。

1.2.3半定量PCR48孔板培養(yǎng)，每孔放40個(gè)DRG，在神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)3 d時(shí)，用1 ml預(yù)冷的PBS洗1次，加入TRIZOL試劑1 ml提取DRG總RNA，紫外分光光度計(jì)測RNA含量。iNOS的正向引物是5’-ggtcaagaagaagcctttcgca-3’，反向引物是5’-gcttgcccaatagccaccttca -3’。GAPDH的正向引物5’- gtccaagtggtggccatcaa -3’，反向引物5’- gctgagggagctgagatgat -3’。二步法RT-PCR擴(kuò)增的特異cDNA片段，半定量PCR反應(yīng)總體積25 μl，cDNA 3 μl，10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP Mix 1.5 μl，Taq DNA聚合酶0.3 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，加無菌雙蒸水至總體積25 μl。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95 ℃，90 s，變性 94 ℃，30 s，退火53 ℃，30 s，延伸72 ℃，1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸72 ℃，10 min。以GAPDH作為內(nèi)參照半定量，各樣本表達(dá)強(qiáng)度=樣本灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.4NO檢測為了探討NGF促神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長作用機(jī)制是否與神經(jīng)損傷因子NO分泌有關(guān)，實(shí)驗(yàn)采用NO檢測試劑盒測定神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)上清中有關(guān)NO穩(wěn)定氧化代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO2-)水平[8]。50 μl培養(yǎng)上清加入96孔平底酶標(biāo)板中，按試劑盒操作說明加入試劑，室溫孵育10 min，540 nm檢測光吸收值(A540 nm)，采用培養(yǎng)液稀釋的亞硝酸鈉A540 nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2　結(jié)　果

2.1NGF促進(jìn)雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長試驗(yàn)采用4 ng/ml NGF培養(yǎng)雞胚背根神經(jīng)節(jié)，結(jié)果顯示，0.5% FCS-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d的陰性對照組未見明顯DRG神經(jīng)突起生長(見圖1A)，NGF 4 ng/ml組突起生長明顯(見圖1B)，突起長度126±4.3 μm，與陰性對照組比較差異顯著(見圖2、圖3)，P<0.05。上述資料提示NGF能夠促進(jìn)DRG神經(jīng)突起生長，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2]。

2.2NGF對一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)的影響通過半定量RT-PCR檢測iNOS mRNA表達(dá)，計(jì)算各樣本表達(dá)強(qiáng)度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NGF誘導(dǎo)組比陰性對照組iNOSmRNA表達(dá)量更加減少(見圖4)。這些數(shù)據(jù)提示NGF可能通過抑制iNOS mRNA表達(dá)進(jìn)而抑制神經(jīng)損傷因子NO的合成，促進(jìn)DRG神經(jīng)元神經(jīng)突起生長。

2.3NGF對雞胚神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞釋放NO的影響采用NO檢測試劑盒對培養(yǎng)雞胚神經(jīng)節(jié)上清NO分泌水平進(jìn)行測定，3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，添加NGF培養(yǎng)的雞胚神經(jīng)節(jié)NO釋放量明顯低于陰性對照組(見圖5)，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測差異顯著，P<0.05。

圖1光學(xué)顯微鏡觀察體外培養(yǎng)3 d的雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起的生長狀況

圖2　每個(gè)神經(jīng)節(jié)突起數(shù)量的比較

圖3　每個(gè)神經(jīng)節(jié)突起長度的比較(μm)

1：0.5%FCS-DMEM培養(yǎng)液陰性對照組；2：NGF 4 ng/ml組

圖4半定量PCR檢測DRG組織中iNOSmRNA表達(dá)比較

C：對照組；N：NGF 4ng/ml。與對照組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，*P<0.05

圖5雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)上清中NO的含量

3　討　論

NGF作為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其對雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起的刺激作用已有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用8 d的雞胚分離背根神經(jīng)節(jié)，原代培養(yǎng)法，進(jìn)一步證實(shí)了NGF在體外可以促進(jìn)DRG神經(jīng)元神經(jīng)突起的生長，并對突起的長度和數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。但是，NGF保護(hù)DRG神經(jīng)元的具體作用機(jī)制尚不清楚，因此我們采用半定量PCR檢測雞胚DRG的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)情況，以及培養(yǎng)雞胚神經(jīng)節(jié)上清中NO的分泌水平，從而進(jìn)一步闡明其NGF作用于DRG神經(jīng)元的作用機(jī)制。

一氧化氮合酶(NOS) 可以將精氨酸中的氮原子，在氧氣及其他輔助因素參與下合成NO。因此，多數(shù)實(shí)驗(yàn)通過對NOS的研究來實(shí)現(xiàn)對NO作用的研究[9]。一氧化氮合酶其同功酶有三種亞型，即在正常狀態(tài)下表達(dá)的神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及在損傷后誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)。iNOS有神經(jīng)毒性作用，介導(dǎo)興奮性神經(jīng)毒性，iNOS與氧自由基產(chǎn)生反應(yīng)，生成物為過氧化硝基、羥自由基等化合物，這些化合物可引起組織損害[10～12]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NGF顯著抑制了雞胚DRG的iNOS mRNA表達(dá)，這些結(jié)果提示NGF可能通過抑制iNOS mRNA表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)雞胚DRG神經(jīng)突起生長。

文獻(xiàn)報(bào)道NO過量產(chǎn)生、釋放可直接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性，影響神經(jīng)細(xì)胞正常代謝，細(xì)胞死亡率明顯增高[13～16]，NO的神經(jīng)毒性作用表現(xiàn)在：大量羥自由基和二氧化氮自由基引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸及脂肪膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[17]；神經(jīng)毒性的產(chǎn)生是NO通過形成NO-鐵復(fù)合物、巰基蛋白的氧化，形成超氧陰離子等方式實(shí)現(xiàn)的[18]。而NGF可以抑制神經(jīng)細(xì)胞一氧化氮的釋放，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[19～21]。在本研究中，我們通過檢測雞胚DRG培養(yǎng)上清中神經(jīng)損傷因子NO釋放情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示添加NGF的DRG上清中NO含量明顯低于培養(yǎng)液對照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著(P<0.05)，表明NGF具有抑制神經(jīng)損傷因子NO釋放作用。

綜上所述，本研究資料表明NGF可能通過調(diào)控iNOS表達(dá)進(jìn)而抑制神經(jīng)損傷因子NO的釋放，從而促進(jìn)雞胚DRG神經(jīng)元神經(jīng)突起生長，發(fā)揮其對神經(jīng)元的營養(yǎng)作用。本研究為進(jìn)一步找到神經(jīng)營養(yǎng)藥物NGF的新作用靶點(diǎn)，治療神經(jīng)損傷后神經(jīng)突起再生的治療研究提供了新的數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Thoenen H，Barde Y. Physiology of nerve growth factor[J]. Physiol Rev，1980，60(4)：1284-1335.

[2]Kashiba H，Hyon B，Senba E. Glial cell line-derived neurotrophic factor and nerve growth factor receptor mRNAs are expressed in distinct subgroups of dorsal root ganglion neurons and are differentially regulated by peripheral axotomy in the rat [J]. Neurosci Lett，1998，252(2)：107-110.

[3]Ma Q，F(xiàn)ode C，Guillemot F. Neurogenin1 and neurogenin2 control two distinct waves of neurogenesis in developing dorsal root ganglia [J]. Genes Dev，1999，13(13)：1717-1728.

[4]Rifkin JT，Todd VJ，Anderson LW. Dynamic expression of neurotrophin receptors during sensory neuron genesis and differentiation [J]. Dev Biol，2000，227(2)：465-480.

[5]方琳，柳忠輝，劉永茂，等. 激活素促進(jìn)雞胚神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長作用[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2006，41(6)：23-28.

[6]方琳，劉永茂，葛敬巖，等. 激活素結(jié)合蛋白阻斷激活素誘導(dǎo)雞胚神經(jīng)節(jié)神經(jīng)突起生長作用及其機(jī)制研究[J]. 中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2007，24(4)：395-397.

[7]Hou S，Tian W，Xu Q，et al. The enhancement of cell adherence and inducement of neurite outgrowth of dorsal root ganglia co-cultured with hyaluronic acid hydrogels modified with Nogo-66 receptor antagonist in vitro [J]. Neuroscience，2006，137(2)：519-529.

[8]Green LC，Wagner DA，Glogowski J，et al. Analysis of nitrate，nitrite，and nitrate in biological fluids [J]. Anal Biochem，1982，126(1)：131-138.

[9]Faraci FM，Brian JE. Nitric oxide and the cerebral circulation [J]. Stroke，1994，25(3)：692-703.

[10]Fujiwara Y，F(xiàn)uruta A，Kikuchi H，et al. Discovery of a novel type of autophagy targeting RNA [J]. Autophagy，2013，9(3)：403-409.

[11]Jin J，Suzuki H，Hirai S，et al. JNK phosphorylates Ser332 of doublecortin and regulates its function in neurite extension and neuronal migration [J]. Dev Neurobiol，2010，70(14)：929-942.

[12]Pattingre S，Bauvy C，Carpentier S，et al. Role of JNK1-dependent Bcl-2 phosphorylation in ceramide-induced macroautophagy [J]. J Biol Chem，2009，284(5)：2719-2728.

[13]Dawson VL，Dawson TM，Bartley DA，et al. Mechanisms of nitric oxide mediated neurotoxicity in primary brain cultures[J]. Neurosci，1993，13(6)：2651-2661.

[14]Nowicki JP，Duval D，Poignet H，et al. Nitric oxide mediates neuronal death after cerebral ischemia in the mouse [J]. Eur J Pharmacol，1991，204(3)：339-340.

[15]Stamler JS. Redox signalling：nitrosylation and related target interaction of nitric oxide [J]. Cell，1994，78(6)：931-936.

[16]Zhang J，Dawson VL，Dawson TM，et al. Nitric oxide activation of poly(ADP-ribose) synthase in neurotoxicity [J]. Science，1994，263(5147)：687-689.

[17]商秀麗，趙久晗，薛一雪. 腦缺血再灌注大鼠模型 eNOS 和 nNOS 的變化[J]. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19(1)：49-52.

[18]陳俊拋，鄭文權(quán)，田時(shí)雨，等. 大鼠腦缺血時(shí)腦組織中 NOS1 陽性神經(jīng)元變化的連續(xù)觀察[J]. 臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，1998，11(6)：323-325.

[19]Tang C，Cao X，Wang D. Effects of nerve growth factor on neuronal nitric oxide production after spinal cord injury in rats[J]. Chin J Traumatol，2002，5(3)：165-168.

[20]Wu J，Zhang J. Effects of nerve growth factor on nitric oxide-mediated neurotoxicity in primary cortical cultures [J]. Chin Med J (Engl)，1999，112(5)：448-451.

[21]Thippeswamy T，Morris R. Nerve growth factor inhibitors the expression of nitric oxide synthase in neurones in dissociated cultures of rat dorsal root ganglia[J]. Neurosci Lett，1997，230(1)：9-12.

The effect mechanism of NGF in neurite outgrowth of embryonic dorsal root ganglia of the chicken

FANGLin，LIShipeng，LIJiayu，etal.

(ChangchunMedicalCollege，Changchun130021，China)

ObjectiveTo investigate the effect mechanism of NGF in neurite outgrowth of embryonic dorsal root ganglia (DRG) of the chiken. MethodsIn this study，we observed that NGF induced neurite outgrowth of DRG by the primary cultured DRGs from embryonic day 9 (E9) chicken. iNOS mRNA expressions were analyzed by RT-PCR，and the secretion of nitric oxide (NO) was examined by NO kit. ResultsNGF significantly induced neurite outgrowth of DRG and down-regulated the iNOS mRNA expressions of the in DRG. In addition，NO detection indicated that NO secretion level in the supernatant of cultured DRG decreased significantly in NGF group，compared to the control group (P<0.05). ConclusionNGF might stimulate DRG neurite outgrowth via inhibiting iNOS expression and NO secretion.

NGF；Neurite outgrowth；NO

1003-2754(2016)09-0829-04

2016-07-20；

2016-09-06

吉林省科技廳課題(No. 20140520012JH)；吉林省衛(wèi)生青年科研課題(No. 2013Q007)；吉林省教育廳科研項(xiàng)目

(1.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春 130031；2.吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 長春 130033；4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春 130021)

呂曉民，E-mail：fanglin1978@163.com

R742

A