四神丸對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸組織Toll樣受體2、4表達的影響

朱向東　王燕　何蘭娟

摘要：目的 觀察四神丸對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）大鼠結腸組織Toll樣受體（TLR）-2、TLR-4基因及蛋白表達的影響，探討其治療脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎的作用機制。方法 采用氫化可的松注射液腹腔注射+番瀉葉灌胃+三硝基苯磺酸/乙醇灌腸法建立脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠模型。將90只Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組及四神丸高、中、低劑量組，各給藥組給予相應藥物干預。RT-qPCR檢測大鼠結腸組織TLR-2、TLR-4 mRNA表達，Western blot檢測大鼠結腸組織TLR-2、TLR-4蛋白表達，并測定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量。結果 與空白組比較，模型組大鼠血清SOD活性明顯降低、MDA含量明顯升高（P<0.01），結腸組織TLR-2、TLR-4基因及蛋白表達明顯增強（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清SOD活性明顯升高、MDA含量明顯降低（P<0.05，P<0.01），結腸組織TLR-2、TLR-4基因及蛋白表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結論 四神丸可能通過改善結腸組織氧自由基的代謝，調控腸上皮免疫系統，達到治療UC的目的。

關鍵詞：潰瘍性結腸炎；四神丸；Toll樣受體2；Toll樣受體4；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.016

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）10-0067-05

Abstract： Objective To observe the effects of Sishen Pills on gene and protein expressions of toll-like receptor 2 （TLR-2） and toll-like receptor 4 （TLR-4） of colonic tissue in spleen-kidney yang deficiency rats with ulcerative colitis （UC）； To discuss its mechanism of action for spleen-kidney yang deficiency UC. Methods Lavage of senna + intraperitoneal injection of hydrocortisone injection + enema of 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid/ethanol were used to establish the model of UC of spleen-kidney yang deficiency type. 90 Wister rats were randomly divided into blank group， model group， Salazosulfadimidine group and the Sishen Pills high-， medium- and low-group. Each medication group was intervened by relevant medicine. RT-qPCR was used to detect the expressions of TLR-2 and TLR-4， and Western blot was used to detect the protein expressions of TLR-2 and TLR-4. SOD and MDA in serum were detected. Results Compared with the blank group， SOD activity decreased and MDA content increased in the model group （P<0.01）； gene and protein expressions of TLR-2 and TLR-4 increased significantly （P<0.05）. Compared with model group， SOD increased and MDA content decreased in all the medication groups （P<0.05， P<0.01）； gene and protein expressions of TLR-2 and TLR-4 decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Sishen Pills can achieve the treatment of UC by improving the metabolism of oxygen radicals in colonic tissue and regulating the immune system of the intestinal epithelium.

Key words： ulcerative colitis； Sishen Pills； Toll-like receptor 2； Toll-like receptor 4； rats

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）作為一種炎性腸病的難治病和易發(fā)病，近年我國發(fā)病率持續(xù)上升，但其發(fā)病機制尚不明確。目前，多數學者認為免疫功能異常是該病發(fā)生的主要機理[1]。四神丸作為治療脾腎陽虛型UC經典方，臨床上廣受推崇。前期研究表明，四神丸通過下調核因子（NF）-κB p65、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的含量，進而抑制炎癥細胞的釋放，達到治療UC的目的[2-3]。Toll樣受體（toll-like receptors，TLR）是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁[4]。相關研究表明，TLR所介導的信號通路在UC的發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用[5]。本實驗旨在通過復制脾腎陽虛型UC大鼠模型，觀察四神丸對TLR-2、TLR-4基因及蛋白表達的影響，探討其治療脾腎陽虛型UC的作用機制，為該方的臨床應用提供實驗佐證。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠90只，雌雄各半，鼠齡50 d，體質量（180±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心，動物合格證號SYXK（甘）2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心SPF級實驗室。

1.2 藥物

氫化可的松注射液，天津藥業(yè)焦作有限公司，批號11080411，規(guī)格5 mg/mL；柳氮磺砒啶（SASP）腸溶片，海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號120301，規(guī)格0.25 g/片，研末后溶于蒸餾水，濃度為0.036 g/mL。番瀉葉購于蘭州惠仁堂藥店，用100 ℃蒸餾水浸泡30 min，過濾去渣，用乙醇濃縮為1 g/mL（即100%濃度），置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。四神丸（補骨脂、吳茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜、大棗，按照4∶2∶2∶1∶2∶2比例稱取，飲片購于蘭州惠仁堂藥店）。按照傳統方法熬制，然后將藥物用乙醇濃縮法濃縮后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

2，4，6-TNBS，Sigma公司，批號2508-19-2；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20150417、20150416；熒光定量PCR試劑盒，Promega Corporation公司，批號0000144569；PCR反轉錄試劑盒，Promega Corporation公司，批號0000144838；PCR引物由上海生工生物工程有限公司設計；Trizol Reagent，Invitrogen公司，批號90804；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；發(fā)光液，MILLIPORE公司，批號1431401；脫脂奶粉（批號40813059）、TRIS（批號718F081）、甘氨酸（批號119M0611），北京索萊寶科技有限公司。

1.4 儀器

臺式高速冷凍離心機（海天美生化儀器設備工程有限公司），ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），超低溫保存箱（青島海爾），雪花制冰機（寧波新芝生物科技股份有限公司），微量紫外分光光度計（美國Quawell公司），HH-S2數顯恒溫水浴鍋（江蘇正基儀器有限公司），可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），DYCZ-40D電泳儀、DYCZ-24DN電泳儀、DYY-7C電泳儀電源、搖床（北京六一生物科學技術有限公司），凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

將90只大鼠按隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、陽性藥組和四神丸高、中、低劑量組，每組15只，采用病-證結合方法造模[6-7]。除空白組外，其余各組每日給予100%濃度番瀉葉10 mL/kg灌胃、15 mg/kg氫化可的松注射液腹腔注射，空白組給予等量蒸餾水灌胃及生理鹽水腹腔注射，連續(xù)21 d。21 d后，禁食24 h，乙醚麻醉，取12 cm聚丙烯管（直徑2 mm），由肛門插入8 cm左右達結腸部位，快速注入TNBS/乙醇溶液（100 mg/kg），再注入約0.4 mL空氣，捏緊肛門，提取大鼠尾巴保持倒立1 min，防止注入液倒流，并使藥液與結腸充分接觸，待麻醉清醒后正常喂養(yǎng)。

2.2 給藥

造模結束后，各治療組分別給藥，給藥劑量按人與大鼠體表面積折算。四神丸高、中、低劑量組每日分別按原藥材52、26、13 g/kg灌胃，陽性藥組每日予SASP混懸液0.36 g/kg灌胃，模型組、空白組予等量蒸餾水灌胃。給藥體積均為10 mL/kg，連續(xù)21 d。

2.3 標本采集及處理

大鼠禁食24 h后乙醚麻醉。將大鼠固定后采用股動脈采血法取血，室溫靜置15～20 min，3000 r/min離心10～15 min，取上層血清，用于檢測MDA、SOD。之后大鼠脫頸處死，剖取病變最嚴重處結腸5～8 cm，生理鹽水清洗干凈，肉眼觀察結腸黏膜損傷情況并評分；再將清洗好的結腸放入凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于檢測TLR-2、TLR-4基因及蛋白的表達。

2.4 結腸黏膜損傷評分

參照文獻[8]肉眼評分。0分：無潰瘍、充血；1分：局部充血，無潰瘍；2分：1處潰瘍不伴充血或腸壁增厚；3分：1處潰瘍伴炎癥；4分：>2處潰瘍伴炎癥；5分：>2處潰瘍和/或炎癥>1 cm；6～8分：潰瘍和/或炎癥>2 cm，病變范圍每增加1 cm則計分增加1分。

2.5 血清超氧化物歧化酶、丙二醛測定

采用黃嘌呤氧化法測定大鼠血清SOD活性，采用硫代巴比妥酸比色法測定大鼠血清MDA含量。嚴格按照試劑說明進行操作。

2.6 RT-qPCR檢測Toll樣受體2、4 mRNA表達

RNA提取采用傳統Trizol法，采用微量紫外分光光度計對RNA含量進行測定，確保其濃度和純度（OD260/OD280值在1.8～2.0）；按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，合成cDNA；用熒光定量PCR儀及其分析軟件ABI7500進行PCR擴增及定量分析。β-actin引物序列：上游5'-GGACCTGACTGACTACC TACTGAA-3'，下游5'-CTTAATGTCACGCACGATT TCC-3'，產物長度150 bp；TLR-2引物序列：上游5'-TGACCTCTCTCAACGAACTTG-3'，下游5'-CAG CAGGAAAGCAGACTCG-3'，產物長度125 bp；TLR-4引物序列：上游5'-TGGCATCATCTTCATTG TCC-3'，下游5'-CAGAGCATTGTCCTCCCACT-3'，產物長度115 bp。反應體系為cDNA 2 μL，GoTap qPCR Master MIX 10 μL，C×R100×0.2 μL，加無酶水至20 μL。PCR擴增程序：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，共40個循環(huán)。融解曲線溫度60～95 ℃。每次擴增均設內參基因組和目的基因組，每一樣本均設3個重復。

2.7 Western blot檢測Toll樣受體2、4蛋白表達

①組織勻漿，提取總蛋白。BCA法檢測蛋白含量并將蛋白濃度統一為4 μg/mL后變性待用。②凝膠。根據分子量大小確定分離膠的濃度，待其凝固后再加入濃縮膠，待膠凝固后加樣。③跑膠。濃縮膠為80 mA恒壓電泳35 min，分離膠為180 mA電泳55 min。④轉膜。蛋白凝膠在180 mA條件下轉膜100 min，將膠上蛋白轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液常溫下封閉2 h。⑤一抗孵育。按一抗稀釋比例稀釋搖床混勻，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜8 min×3次。⑥二抗孵育。搖床60 min，TBST溶液洗膜8 min×3次。⑦加入發(fā)光液后曝光顯影。⑧用Image J軟件分析目的條帶和β-actin的積分光密度值，并計算二者的比值作為目的蛋白的相對表達量。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，根據方差齊性檢驗結果，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 結腸黏膜損傷狀況及評分結果

肉眼觀察結顯示，空白組腸道無增厚粘連，腸黏膜光滑，腸皺襞紋理清晰，未見充血、水腫、糜爛、潰瘍等情況；模型組可見腸管增粗增厚，腸黏膜充血、水腫，可見糜爛和潰瘍面，部分可見粘連；陽性藥組可見輕度充血、水腫；四神丸低劑量組可見輕度充血、水腫，部分可見潰瘍面；四神丸中劑量組腸管不厚，未見明顯糜爛和潰瘍面，可見愈合瘢痕；四神丸高劑量組僅有輕度的充血、水腫，其余損傷基本恢復正常，較四神丸中劑量組稍有差異。與空白組比較，模型組肉眼觀察評分明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組肉眼觀察評分明顯降低（P<0.01）。

4.2 四神丸對模型大鼠血清超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清SOD活性明顯降低、MDA含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清SOD活性明顯升高、MDA含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）。

4.3 四神丸對模型大鼠結腸組織Toll樣受體2、4 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織TLR-2、TLR-4 mRNA表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織TLR-2、TLR-4 mRNA表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。

4.4 四神丸對模型大鼠結腸組織Toll樣受體2、4蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠結腸組織TLR-2、TLR-4蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組TLR-2、TLR-4蛋白表達明顯降低（P<0.01）。

5 討論

UC具有病程長、易反復的特點，病變多發(fā)生于結腸和直腸。根據其發(fā)病特點，中醫(yī)學將其歸屬于“痢疾”“泄瀉”等病證范疇。有學者統計，脾腎陽虛型UC的中醫(yī)證候分布中居首位，高達17.68%[9]。而脾腎陽虛型UC的主要臨床表現是畏寒肢涼、腰膝酸軟、神疲乏力、食少腹脹、大便溏薄等。這些均與四神丸的主治方向不謀而合。四神丸由補骨脂、肉豆蔻、吳茱萸、五味子加姜、棗組成。方中補骨脂辛苦而溫、善補命火、散寒邪，為君藥；肉豆蔻溫暖脾胃、澀腸止瀉，吳茱萸溫中散寒，共為臣藥；五味子收斂固澀以助止瀉，為佐藥；生姜溫腎散寒，大棗補脾益胃，共為使藥。諸藥相配，共奏溫腎暖脾、澀腸止瀉之功。通過查閱相關文獻，我們發(fā)現，用四神丸或四神丸加減治療脾腎陽虛型UC具有良好的臨床療效[10]。

氧自由基與UC腸黏膜損傷及炎癥發(fā)生密切相關，氧自由基可通過脂質過氧化作用破壞生物膜的結構和功能，使細胞內酶失活及蛋白變性而致細胞損傷[11-13]。SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基O2-，起到保護細胞免受傷害的作用。SOD活性的高低間接反映機體清除氧自由基的能力。MDA作為脂質過氧化物的主要產物，不僅能把活性氧轉化成活性化學劑，即非自由基性的脂類分解產物，而且通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用，從而引起細胞代謝或功能障礙，甚至死亡。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解引起細胞損傷。因此，MDA含量可以反映機體內脂質過氧化程度，間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。

TLR在天然免疫中具有識別作用，是機體抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR-2主要表達于單核細胞、巨噬細胞、Th1、Th2及部分消化道上皮細胞等，主要識別革蘭陽性菌體成分[14]，而TLR-4主要識別革蘭陰性菌脂多糖，通過激活TLR-2和TLR-4共同介導的跨膜信號傳導通路，介導炎癥反應，啟動機體的免疫防御系統，產生大量的炎癥因子[15]。另外，Toll樣受體對獲得性免疫應答也具有調控作用。TLR-2和TLR-4能激活樹突狀細胞（DC）后產生不同的細胞因子和化學激活因子，而TLR4-DC免疫耐受失調被認為是UC免疫失控的重要機制之一。TLR-4主要產生白細胞介素（IL）-12 p70，干擾素-γ介導蛋白（IP-10）及轉錄干擾素-β；TLR-2刺激則優(yōu)先表達IL-8和IL-23，這些可溶性細胞因子誘導T輔助細胞向有利于殺滅病原的方向分化產生細胞免疫應答或體液免疫應答。尤其是IL-12和IP-10能夠刺激T細胞產生干擾素，促使Th細胞分化為Th1細胞，如果缺乏IL-12則分化為Th2細胞?？梢?，Toll信號通路在UC的發(fā)病中起到至關重要的作用。本研究結果顯示，四神丸能升高SOD的活性，降低MDA的含量及結腸組織TLR-2、TLR-4基因及蛋白表達的水平，其治療UC的機制可能是通過調控TLR信號通道，抑制炎癥釋放，恢復免疫平衡，達到治療UC的目的。

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（收稿日期：2015-11-22）

（修回日期：2015-12-17；編輯：華強）