清金化痰湯對慢性阻塞性肺疾病氣道黏液高分泌模型大鼠表皮生長因子受體/MAPK信號通路的影響

陳英　馮淬靈　李根茂

摘要：目的 觀察清金化痰湯對慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠表皮生長因子受體（EGFR）/MAPK信號通路的影響，探討其干預COPD氣道黏液高分泌的作用機制。方法 氣管內滴注LPS聯(lián)合煙熏方法建立COPD氣道黏液高分泌模型。實驗大鼠隨機分為空白組、模型組、清金化痰湯組、克拉霉素組，每組10只?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，其余3組分別給予生理鹽水、清金化痰湯、克拉霉素片灌胃，每日1次，連續(xù)30 d。各組大鼠于實驗第31日分別處死，HE染色觀察肺組織病理形態(tài)及黏液腺體增生情況，實時熒光定量PCR檢測肺組織EGFR、MUC5AC基因表達，免疫組化檢測肺組織及氣道上皮P-EGFR、P-ERK、P-JNK、P-p38、MUC5AC蛋白表達。結果 與空白組比較，模型組大鼠氣道上皮黏液腺體增生及P-EGFR、P-ERK、P-JNK、P-p38、MUC5AC蛋白表達顯著升高（P<0.01），MUC5AC mRNA表達升高（P<0.05）；與模型組比較，清金化痰湯組大鼠氣道上皮黏液腺體增生及P-p38、P-ERK、MUC5AC蛋白表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），P-JNK蛋白表達顯著升高（P<0.01）；清金化痰湯組肺組織EGFR、MUC5AC mRNA表達顯著降低（P<0.01）。結論 清金化痰湯可能通過抑制EGFR下游ERK、p38信號通路，干預COPD氣道黏液高分泌。

關鍵詞：清金化痰湯；慢性阻塞性肺疾病；氣道黏液高分泌；表皮生長因子受體/MAPK信號通路；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.014

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）10-0056-07

Abstract： Objective To observe the effects of Qingjin Huatan Decoction on EGFR/MAPK signaling pathway of airway mucus hypersecretion rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. Methods Intratracheal instillation of LPS combined with smudging method was used to establish COPD airway mucus hypersecretion rat models. Experimental rats were randomly divided into blank group， model group， Qingjin Huatan Decoction group and clarithromycin group. The blank group was normally fed， while the other three groups were given NS， Qingjin Huatan Decoction， and clarithromycin respectively for gavage， once a day for 30 days. All rats were killed on the 31st day， and pathological changes of lung tissue and mucous glands hyperplasia were observed by HE staining method. The gene expressions of EGFR and MUC5AC in lung tissue were detected by RT-PCR method. The protein expressions of P-EGFR， P-ERK， P-JNK， P-p38 and MUC5AC in pulmonary tissue and airway epithelium were detected by immunohistochemical method. Results Compared with the blank group， mucous glands hyperplasia on airway epithelium， protein expressions of P-EGFR， P-ERK， P-JNK， P-p38 and MUC5AC on airway epithelium significantly increased in the model group （P<0.01）； gene expression of MUC5AC of lung tissue increased （P<0.05）. Compared with the model group， mucous glands hyperplasia on airway epithelium， P-p38， P-ERK and MUC5AC protein expression on airway epithelium in Qingjin Huatan Decoction group significantly decreased （P<0.05， P<0.01）； the protein expression of P-JNK increased significantly （P<0.01）. EGFR and MUC5AC mRNA in lung tissue in Qingjin Huatan Decoction group decreased significantly （P<0.01）. Conclusion Qingjin Huatan Decoction can reduce airway mucus hepersecrection of COPD by inhibiting ERK and p38 signal pathway on EGFR downstream.

Key words： Qingjin Huatan Decoction； chronic obstructive pulmonary disease； airway mucus hypersecretion； EGFR/MAPK signaling pathway； rats

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種嚴重危害人類健康，加重家庭及社會負擔的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。氣道黏液高分泌是COPD的重要病理特征，在COPD發(fā)病率和死亡率方面起著重要作用，干預氣道黏液高分泌已成為目前治療COPD的研究熱點[1-2]。研究表明，細胞表皮生長因子受體（EGFR）及其下游MAPK信號通路與氣道黏液高分泌密切相關[3-4]。前期研究表明，清金化痰湯可以顯著抑制COPD模型大鼠EGFR基因表達，抑制氣道黏液高分泌[5]。本實驗觀察清金化痰湯對COPD模型大鼠EGFR/MUC5AC信號通路的影響，探討其干預COPD氣道黏液高分泌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性清潔級Wistar大鼠40只，6～8周齡，體質量（250±20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2009-0007。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院中醫(yī)內科學教育部重點實驗室SPF級動物房。

1.2 藥物

清金化痰湯（瓜蔞皮、黃芩、連翹、漏蘆、浙貝母、清半夏、前胡、桔梗等），均為免煎顆粒劑，北京康仁堂藥業(yè)有限公司；克拉霉素片，麗珠集團制藥廠，0.25 g/片，批號120201。

1.3 主要試劑與儀器

LPS，美國Sigma公司；Trizol RNA提取試劑，Invitrogen公司；M-MLV反轉錄酶，Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒，BIO-RAD公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；實時熒光定量PCR儀，BIO-RAD公司；一抗：P-EGFR（CST，#2235，鼠源多克隆抗體），P-ERK（Santa，Sc-9476，羊源多克隆抗體），P-JNK（CST，#4668，兔源單克隆抗體），P-p38（Abcam，ab7952，兔源多克隆抗體）；二抗：DAKO二抗或HRP標記兔抗山羊二抗（1∶100），修復液：檸檬酸pH 6.0，10%山羊血清或10%兔血清；阻斷劑：3%H2O2，二甲苯，梯度乙醇（無水、95%、75%）、TBS緩沖液、DAB顯色劑溶液（Vector labs）。大前門牌香煙（上海卷煙廠），自制煙熏箱（60 cm×60 cm×70 cm透明有機玻璃箱），氣管插管針（16號改良靜脈套管針）。

1.4 分組、造模與給藥

實驗大鼠隨機分為空白組、模型組、清金化痰湯組、克拉霉素組，每組10只。空白組正常飼養(yǎng)，其余3組分別給予生理鹽水、清金化痰湯14 g/kg、克拉霉素藥液83.3 mg/kg灌胃。每日1次，連續(xù)30 d。采用氣道內滴注LPS聯(lián)合煙熏的方式，復制COPD氣道黏液高分泌模型[6]。3.5%水合氯醛腹腔麻醉，于實驗第1、14日氣管內滴注濃度為1 mg/mL的LPS溶液。將大鼠仰臥位固定在鼠板上，頭高尾低呈45°角放置，暴露聲門，在光源下將套管針迅速插入大鼠氣管內，拔出套管針鋼芯，以棉絲放在塑料套管外口判斷是否成功，插管成功后，先抽取空氣0.3 mL后抽取LPS溶液，通過套管針快速注入氣管，然后將大鼠固定板直立旋轉，左右搖晃30次，使LPS液均勻分布于兩肺。插管日不煙熏，實驗第2～13日、15～30日將大鼠置于自制煙熏箱內予煙熏，每次6只，用8支香煙，每日煙熏30 min。

1.5 標本制備

實驗第31日取材。腹主動脈放血處死動物，取右肺中葉，4%多聚甲醛溶液固定。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋及切片（厚度6 μm）。實驗過程中各組均有死亡，每組隨機選取6只備檢。

1.6 指標檢測

1.6.1 HE染色 將肺組織切片經二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸餾水、蘇木精染液、鹽酸乙醇溶液、清水、清水、氨水溶液、伊紅染液、蒸餾水、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通風櫥封片。利用顯微測微標尺，最小刻度單位為0.01 mm，光學顯微鏡下計算Reid指數(shù)（黏膜層厚度/支氣管壁厚度）來表示支氣管黏液腺體增生程度。其中黏膜層厚度為軟骨至上皮的距離，支氣管管壁厚度為上皮細胞基底膜至軟骨膜內面的距離[7]。

1.6.2 RT-PCR檢測 先行總RNA提取，后RT-PCR擴增。采用引物1 μL。引物序列：MUC5AC上游5'-CTGTGTCCATCTCAACCTTA-3'，下游5'-GCTGC CATCTATCCAATCA-3'，產物長度101 bp；EGFR上游5'-CATAGCAATGCGGTGAG-3'，下游5'-GAAG TCCTGCTGGTAGTCA-3'，產物長度144 bp；用β-actin基因作為內參，β-actin上游5'-CCCATCTATGAG GGTTACGC-3'，下游5'-TTTAATGTCACGCACGAT TTC-3'，產物長度150 bp。反應條件：94 ℃、10 min，94 ℃、10 s，72 ℃、10 s，共45個循環(huán)。PCR反應及數(shù)據采集在CFX-96系統(tǒng)上進行記錄。

1.6.3 免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟至水，二甲苯（三缸8 min、8 min、8 min），梯度乙醇（無水、95%、75%）每缸5 min，自來水沖洗干凈后，再用蒸餾水沖洗1次。pH 6.0檸檬酸高溫高壓修復2 min，冷卻至室溫，TBS沖洗3次×5 min。3%H2O2室溫20 min，TBS沖洗3次×5 min。EGFR、JNK和p38用10%山羊血清、ERK用10%兔血清孵育20 min。滴加一抗（P-EGFR一抗?jié)舛葹?∶200，P-ERK一抗?jié)舛葹?∶50，P-JNK一抗?jié)舛葹?∶75，P-p38一抗?jié)舛葹?∶50），4 ℃過夜。第2日4 ℃冰箱取出，復溫15 min，TBS沖洗3次×5 min。EGFR、JNK和p38每張切片滴加50 μLDAKO二抗，室溫孵育25 min，ERK每張切片滴加50 μL HRP標記兔抗山羊二抗（濃度為1∶100），室溫孵育1 h，TBS沖洗3次×5 min。甩去TBS，每張切片滴加50 μL新鮮配制的DAB，鏡下觀察。自來水沖洗，蘇木素復染2 min自來水沖洗。鹽酸乙醇分化1～2 s，自來水沖洗，溫水返藍。切片放置梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用Image-ProPlus6.0軟件讀取每個視野下陽性物質表達區(qū)域的平均光密度值。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，滿足方差齊性時組間比較采用LSD法，不滿足方差齊性時采用Tamhane's T2法進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 清金化痰湯對大鼠肺組織病理形態(tài)的影響

空白組大鼠氣道黏膜上皮完整，纖毛無粘連、倒伏及脫落，上皮細胞無空泡變性及壞死脫落，極少有杯狀細胞，黏膜下腺體無增生、肥大。支氣管管壁無充血、水腫，無淋巴細胞及漿細胞浸潤，支氣管腔內無分泌物形成，管壁平滑肌束無斷裂、萎縮，肺泡間隔稍有變薄、少量融合。與空白組比較，模型組纖毛粘連、倒伏、脫落明顯，上皮細胞增生、增厚，且存在明顯壞死脫落，杯狀細胞增生，黏膜下腺體增生、肥大。支氣管壁及支氣管周圍淋巴細胞及漿細胞明顯聚集浸潤，管壁平滑肌束斷裂、萎縮。肺泡間隔明顯變薄并斷裂、毛細血管減少，相鄰肺泡廣泛融合形成較大囊腔，典型肺氣腫表現(xiàn)，肺間質血管充血明顯。與模型組比較，清金化痰湯組纖毛粘連、倒伏、脫落，杯狀細胞增生，肺泡間隔變薄，相鄰肺泡隔融合均顯著減輕，支氣管壁輕微水腫，淋巴細胞浸潤，管壁平滑肌束斷裂、萎縮，肺間質淋巴細胞浸潤、充血。克拉霉素組纖毛粘連、倒伏、脫落，上皮細胞存在壞死脫落，杯狀細胞增生程度較輕，支氣管壁淋巴細胞浸潤，管壁平滑肌束萎縮。肺泡間隔明顯變薄，相鄰肺泡隔融合與模型組相比減輕，肺間質淋巴細胞浸潤、充血。結果見圖1。

2.2 清金化痰湯對大鼠氣道上皮黏液腺體增生的影響

與空白組比較，模型組Reid值顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，清金化痰湯組、克拉霉素組Reid值均顯著降低（P<0.01）；清金化痰湯組與克拉霉素組Reid值比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表1。

2.3 清金化痰湯對大鼠肺組織細胞表皮生長因子受體、黏蛋白5AC基因表達的影響

總RNA樣品經瓊脂糖凝膠電泳之后，紫外燈下觀察可見18 s、28 s兩條清晰的條帶，未被降解。紫外分光比色測定顯示，所有RNA樣品在260、280 nm處A值之比均在1.8～2.0之間，純度符合要求，各目標融解曲線均為單一峰，擴增曲線均呈平行分布。與空白組比較，模型組MUC5AC mRNA表達升高（P<0.05），EGFR mRNA表達無差異（P>0.05）。與模型組比較，清金化痰湯組EGFR、MUC5AC mRNA表達顯著降低（P<0.01）；克拉霉素組EGFR mRNA表達顯著升高（P<0.01），MUC5AC mRNA表達降低（P<0.05）；與克拉霉素組比較，清金化痰湯組EGFR、MUC5AC mRNA表達降低（P<0.05，P<0.01）。

2.4 清金化痰湯對大鼠肺組織及氣道上皮P-細胞表皮生長因子受體蛋白表達的影響

肺組織輪廓清晰，其中棕黃色區(qū)域為陽性蛋白表達?？梢奝-EGFR主要表達在小氣道。與空白組比較，模型組氣道上皮P-EGFR表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，清金化痰湯組和克拉霉素組氣道上皮P-EGFR表達均無差異；與克拉霉素組比較，清金化痰湯組氣道上皮P-EGFR表達顯著升高（P<0.01）。

2.5 清金化痰湯對大鼠肺組織及氣道上皮P-ERK蛋白表達的影響

肺組織輪廓清晰，其中棕黃色區(qū)域為陽性蛋白表達?？梢奝-ERK主要表達在小氣道，在肺組織中也有表達。與空白組比較，模型組氣道上皮P-ERK表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，清金化痰湯組和克拉霉素組氣道上皮P-ERK表達顯著降低（P<0.01）；與克拉霉素組比較，清金化痰湯組氣道上皮P-ERK表達顯著升高（P<0.01）。

2.6 清金化痰湯對大鼠肺組織及氣道上皮P-JNK蛋白表達的影響

肺組織輪廓清晰，其中棕黃色區(qū)域為陽性蛋白表達?？梢奝-JNK主要表達在小氣道，肺組織內也可見少量表達。與空白組比較，模型組氣道上皮P-JNK表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，清金化痰湯組氣道上皮P-JNK表達顯著升高（P<0.01），克拉霉素組氣道上皮P-JNK表達顯著降低（P<0.01）；與克拉霉素組比較，清金化痰湯組氣道上皮P-JNK表達顯著升高（P<0.01）。結果見圖4、表5。

2.7 清金化痰湯對大鼠肺組織及氣道上皮P-p38蛋白表達的影響

肺組織輪廓清晰，其中棕黃色區(qū)域為陽性蛋白表達。可見P-p38主要表達在小氣道，在肺組織中也可見少量表達。與空白組比較，模型組氣道上皮P-p38表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，清金化痰湯組和克拉霉素組氣道上皮P-p38表達顯著降低（P<0.01）；與克拉霉素組比較，清金化痰湯組氣道上皮P-p38表達無差異。

2.8 清金化痰湯對大鼠肺組織及氣道上皮MUC5AC蛋白表達的影響

肺組織輪廓清晰，其中棕黃色區(qū)域為陽性蛋白表達。可見MUC5AC主要表達在小氣道。與空白組比較，模型組氣道上皮MUC5AC表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，清金化痰湯組和克拉霉素組氣道上皮MUC5AC表達均降低（P<0.05）；與克拉霉素組比較，清金化痰湯氣道上皮MUC5AC表達無差異。

3 討論

氣道黏液高分泌是COPD的重要特征，多種細胞信號通路參與黏液分泌調節(jié)。EGFR是受體酪氨酸激酶EerbB家族成員[8]。Takeyama研究表明，EGFR在黏蛋白MUC5AC合成及杯狀細胞增生起著關鍵作用[9]。EGFR磷酸化后，激活多條下游通路——MAPK信號通路、PI3K 信號通路和PKC信號通路[10]。進一步研究表明，EGFR及下游MAPK信號通路誘導了氣道上皮細胞黏蛋白表達上調[11-12]。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)激活是多種信號通路的中心。研究表明，MAPK相關的信號通路（包括ERK、JNK、p38）在誘導氣道上皮細胞合成和分泌黏蛋白過程中發(fā)揮了非常重要的作用[13]。

ERK是MAPK家族的重要成員之一，是胞內極為重要的信號轉導分子。多項研究表明，肺炎鏈球菌、白細胞介素-1β及腫瘤壞死因子-α可通過ERK信號通路誘導MUC5AC基因高表達[14-15]。抑制ERK磷酸化，可以降低氣道黏液高分泌[16]。

JNK信號通路功能失調可造成慢性炎癥的發(fā)生[17]。JNK因不同因素誘導黏蛋白生成中發(fā)揮作用不同。香煙煙霧[18]、LPS[19]可通過激活JNK信號通路誘導MUC5AC合成，而肺炎鏈球菌誘導的氣道MUC5AC表達，JNK則起負性調節(jié)作用。

p38通路與炎癥和應激反應的調控密切相關[20-21]。非典型流感嗜血桿菌通過激活p38信號通路，上調MUC5AC表達[22]。目前，p38MAPK已成為抗炎療法中重要的潛在靶點。

COPD屬中醫(yī)學“肺脹”范疇，COPD急性發(fā)作期，痰熱壅肺為其主要病機[23]。清金化痰湯為北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院武維屏教授治療COPD的經驗方，以清熱化痰理氣為法，熱清使痰無助長之因，痰消使熱無生長之源，同時順應肺主宣發(fā)肅降的生理特性，使肺之氣機通暢，痰熱得消，從而恢復機體的功能狀態(tài)，緩解氣道黏液高分泌狀態(tài)。本方由清金化痰方化裁而成，方中瓜蔞皮性寒，味甘，主清熱化痰、寬胸理氣。黃芩，《本草正》載其“枯者清上焦之火，消痰利氣，定喘咳”。二者相合，共奏清熱化痰之效，為君藥。連翹、漏蘆為清熱解毒之品，武維屏教授將之用于肺部感染、支氣管擴張等呼吸系統(tǒng)感染性疾病，收效良好。清半夏，《本經逢原》載“半夏同蒼術、茯苓治濕痰；同瓜蔞、黃芩治熱痰；同膽南星、前胡治風痰；同芥子、姜汁治寒痰。惟燥痰宜瓜蔞、貝母，非半夏所能治也”。前胡，《藥義明辨》載“其功先在散結，結散則氣下，而痰亦降，所以為痰氣要藥”。浙貝母苦寒，《本草綱目拾遺》載“解毒利痰，開宣肺氣，凡肺家夾風火有痰者宜此”。桔梗，苦、辛，歸肺經，“開胸膈，除上氣壅……逐肺熱，住咳，下痰，治肺癰排膿”（《本草蒙筌》）。諸藥相合，寒溫適宜，助君藥清熱、化痰、理氣、止咳。全方配伍得當，共奏清熱化痰理氣之功。前期研究表示，該方具有抗炎、減少MUC5AC合成的作用[24]。

有研究表明，EGFR以及其下游信號通路的激活被認為是COPD氣道黏液高分泌的重要參與因素[25-26]。應用EGFR抑制劑，可以顯著抑制黏液高分泌[27]。

清金化痰湯可顯著抑制EGFR mRNA表達，但對P-EGFR蛋白表達無影響，觀察其最終對黏蛋白的影響，結果顯示MUC5AC mRNA及蛋白表達均顯著降低。在EGFR誘導的MUC5AC合成過程中，其下游信號通路的激活起著重要作用。抑制ERK、JNK、p38的激活，可明顯抑制氣道黏液高分泌[28]。有研究表明，ERK信號通路與EGFR介導的MUC5AC分泌關系密切[29]。本研究中，清金化痰湯顯著抑制氣道上皮P-ERK表達。p38 MAPK作為抗炎療法中的重要靶點，清金化痰湯可顯著抑制P-p38的表達，減輕氣道炎癥。有研究表明，JNK信號通路在MUC5AC合成中起負性調節(jié)作用[14]。清金化痰湯上調了氣道上皮P-JNK表達，表明P-JNK可能在MUC5AC合成中起負性調節(jié)作用。清金化痰湯對MAPK信號通路的上游信號分子EGFR無影響，考慮一方面可能與EGFR自身復雜的生物學特性、EGFR信號通路多面性及時空特異性調節(jié)特點相關[30-31]，另一方面與免疫組化檢測方法的局限性有關。另外，與克拉霉素組比較，清金化痰湯組可顯著抑制大鼠肺組織EGFR mRNA表達，但最終清金化痰湯組大鼠氣道上皮P-EGFR蛋白表達顯著高于克拉霉素組。研究顯示，真核基因表達的轉錄和翻譯發(fā)生的時間和位點存在時空間隔；在基因轉錄后，還有轉錄后加工、轉錄產物的降解、翻譯、翻譯后加工、降解及修飾很多層面，檢測的時間點不同，均會使mRNA水平和蛋白水平出現(xiàn)不完全一致[32]。

綜上所述，清金化痰湯可能通過抑制EGFR下游信號通路中ERK、p38信號通路，干預COPD氣道黏液高分泌，其具體機制將在后續(xù)的實驗中進一步研究。

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（收稿日期：2015-12-19）

（修回日期：2016-01-05；編輯：華強）