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    復(fù)方鉤藤降壓片對自發(fā)性高血壓大鼠血管重塑單核細胞趨化蛋白—1和基質(zhì)金屬蛋白酶—9表達的影響

    2016-10-29 09:11:30馮進張穩(wěn)卿俊
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2016年10期
    關(guān)鍵詞:降壓片中膜外膜

    馮進 張穩(wěn) 卿俊

    摘要:目的 觀察復(fù)方鉤藤降壓片對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血管重塑單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達的影響,探討其可能的作用機制。方法 24只12周齡雄性SHR隨機分為模型組、復(fù)方鉤藤降壓片組和陽性藥組,每組8只,另設(shè)8只WKY大鼠為空白對照組。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃,連續(xù)6周。無創(chuàng)尾動脈測壓法觀測血壓;HE染色觀察大鼠胸主動脈、腎動脈形態(tài)學(xué)變化;免疫組化檢測胸主動脈內(nèi)皮細胞MCP-1、MMP-9的蛋白表達。結(jié)果 模型組胸主動脈壁MCP-1、MMP-9蛋白表達明顯高于空白對照組(P<0.01);與模型組比較,各給藥組胸主動脈壁MCP-1、MMP-9蛋白表達顯著降低(P<0.05,P<0.01);復(fù)方鉤藤降壓片組與陽性藥組比較,胸主動脈壁內(nèi)皮細胞MCP-1、MMP-9蛋白表達無明顯差異。結(jié)論 復(fù)方鉤藤降壓片具有降低SHR血壓,減輕炎癥反應(yīng),調(diào)控血管重塑的作用,其機制可能與下調(diào)SHR胸主動脈壁內(nèi)皮細胞MCP-1、MMP-9蛋白表達有關(guān)。

    關(guān)鍵詞:復(fù)方鉤藤降壓片;自發(fā)性高血壓大鼠;血管重塑;單核細胞趨化蛋白-1;基質(zhì)金屬蛋白酶-9

    DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.013

    中圖分類號:R285.5 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2016)10-0051-05

    Abstract: Objective To observe the effects of Compound Uncaria Hypotensive Tablets on expressions of MCP-1 and MMP-9 of vascular remodeling in spontaneously hypertensive rats (SHR); To discuss it possible mechanism of action. Methods Totally 24 12-week old male SHR were randomly divided into SHR model group, Compound Uncaria Hypotensive Tablets group, and positive medicine group, with 8 rats in each group. Another 8 WKY rats were set as normal control group. Medication groups were given relevant medicine for gavage for successive 6 weeks. Noninvasive tail cuff method was used to observe blood pressure; morphological changes in thoracic aorta and renal artery were observed by HE staining; immunohistochemistry was used to detect the protein expressions of MCP-1 and MMP-9 in thoracic aortic wall. Results Protein expressions of MCP-1 and MMP-9 in thoracic aortic wall of SHR model group were significantly higher than those of normal control group (P<0.01); Compared with the SHR model group, protein expressions of MCP-1 and MMP-9 in thoracic aortic wall decreased significantly in the medication groups (P<0.05, P<0.01); Compared the Compound Uncaria Hypotensive Tablets group and positive medicine

    高血壓病是一種由多種病因相互作用導(dǎo)致的、復(fù)雜的、進行性的心血管綜合征。近年來,炎癥因素在高血壓病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中的作用受到關(guān)注。有研究認為,高血壓病是一個慢性炎癥過程,可以產(chǎn)生炎癥因子,影響血壓水平,損傷血管內(nèi)皮功能,加速血管重塑。前期研究表明,復(fù)方鉤藤降壓片具有降低血壓,逆轉(zhuǎn)心臟、腎臟的超微結(jié)構(gòu),減少血管的損傷,減輕高血壓炎癥反應(yīng)等作用[1-5]。本實驗通過觀察復(fù)方鉤藤降壓片對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血管重塑相關(guān)炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表達的影響,探討其可能的作用機制。

    1 實驗材料

    1.1 動物

    SHR 24只、WKY大鼠8只,清潔級,雄性,體質(zhì)量180~220 g,鼠齡12周,北京維通利華實驗技術(shù)有限公司,動物合格證號SCXK(京)2012-0001。分8籠飼養(yǎng),每籠4只,室溫22 ℃~25 ℃、濕度50%~60%,人工光照時間明暗各半、環(huán)境安靜。喂飼相同標準飼料(湖南斯萊克景達實驗動物有限公司)、實驗用三級用水(湖南中醫(yī)藥大學(xué)東塘校區(qū)綜合樓實驗室)。

    1.2 藥物

    復(fù)方鉤藤降壓片,湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑制劑中心,0.4 g/片,批號131209;厄貝沙坦片,法國賽諾菲制藥公司,150 mg/片,批號4A449。

    1.3 主要試劑與儀器

    血清MCP-1、MMP-9免疫組化試劑盒,長沙麗欣生物技術(shù)有限公司;BP98A無創(chuàng)血壓檢測儀,北京軟隆科技有限責任公司;TDZ4 WS低速臺式離心機,長沙湘儀儀器廠;LEICA DM LB2型雙目顯微鏡,德國LEICA公司;Motic B5顯微攝像系統(tǒng),麥克奧迪實業(yè)集團公司;MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng),北航公司;Shandon325型石蠟切片機,英國Shandon公司。

    2 實驗方法

    2.1 分組與給藥

    先將SHR按血壓分層,隨機將24只SHR分為模型組、復(fù)方鉤藤降壓片組、陽性藥組,每組8只。以8只WKY大鼠為空白對照組。按成人體質(zhì)量70 kg折算,按成人臨床用藥劑量折合大鼠等效劑量。復(fù)方鉤藤降壓片組:用蒸餾水將復(fù)方鉤藤降壓片配成混懸液,予439.77 mg/(kg·d)灌胃;陽性藥組:用蒸餾水將厄貝沙坦片配成混懸液,予13.74 mg/(kg·d)灌胃;模型組和空白對照組給予等量蒸餾水灌胃。每日9:00按10 mL/kg給藥,連續(xù)6周。

    2.2 標本采集

    第6周測完血壓后,大鼠10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉,打開胸腔、腹腔,取血后分離胸主動脈、腎動脈,置于10%甲醛固定24 h。

    2.3 觀察指標

    2.3.1 大鼠尾動脈收縮壓測量 各組于灌胃后2 h開始專人測量血壓,每周1次,保持環(huán)境安靜、恒溫(25 ℃)、清醒非激怒狀態(tài)下測量大鼠尾動脈收縮壓,將大鼠固定裝置和測量主機電預(yù)熱30 min,大鼠置于固定網(wǎng)套中通過尾套固定,預(yù)熱10 min,使尾部動脈擴張,再將壓脈套套至大鼠尾部近心端,1/3在大鼠尾,打開脈沖波形記錄系統(tǒng),充氣使壓力上升到動脈搏動消失,然后慢慢放氣,讀取血壓值,此即尾動脈收縮壓,重復(fù)測量3次,取平均值。

    2.3.2 胸主動脈、腎動脈組織形態(tài)學(xué)觀察 用75%~100%乙醇梯度脫水;浸蠟、包埋、切片(4 μm),60 ℃烤片機烘烤12 h,置于4 ℃冰箱中備用。切片脫蠟至水、HE染色、二甲苯透明中性樹膠封片,待玻片干后,從低倍鏡至高倍鏡各拍取1張,光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

    2.3.3 胸主動脈壁內(nèi)皮細胞單核細胞趨化蛋白-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白表達測定 按免疫試劑盒說明方法進行操作。先將組織切片在二甲苯中脫蠟,持續(xù)10~15 min,然后放在100%、95%、80%梯度乙醇脫水,脫水時間為每個濃度10 min,然后用蒸餾水洗滌2次×5 min。再封閉內(nèi)源性過氧化物酶、微波爐加熱修復(fù)抗原、正常羊血清封閉液滴添加到每張切片進行非特異性抗原封閉、滴加第一抗體、滴加生物素化抗小鼠IgG、DAB顯色、蒸餾水終止顯色、脫水、透明等處理,采集圖像。應(yīng)用MOTIC圖像分析軟件對所取圖片定量分析,陽性信號為胞質(zhì)或胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒,測定陽性顆粒的平均光密度(AOD)值。AOD值越大陽性越強,AOD值越小陽性越弱。

    3 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示。采用方差分析,方差齊者組間比較采用LSD法,方差不齊者采用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    4 結(jié)果

    4.1 復(fù)方鉤藤降壓片對模型大鼠尾動脈收縮壓的影響

    與空白對照組比較,模型組SHR尾動脈收縮壓明顯升高(P<0.01);與模型組比較,除第0周外,各給藥組SHR尾動脈收縮壓明顯降低(P<0.05,P<0.01),但陽性藥組較復(fù)方鉤藤降壓片組降低明顯(P<0.05)。結(jié)果見表1。

    4.2 復(fù)方鉤藤降壓片對模型大鼠胸主動脈病理形態(tài)的影響

    空白對照組胸主動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮完整,中膜平滑肌細胞核、彈性纖維完整,外膜與中膜分界明顯;模型組胸主動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮局部有斑塊,內(nèi)膜上有少量炎癥細胞附著,內(nèi)皮細胞不完整,中膜外層平滑肌細胞核、彈性纖維排列不整齊,外膜與中膜分界欠佳;陽性藥組胸主動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮基本完整,內(nèi)膜上有單個炎癥細胞附著,中膜平滑肌細胞核、彈性纖維排列整齊,外膜與中膜分界欠佳,外膜正常;復(fù)方鉤藤降壓片組胸主動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮完整,中膜平滑肌細胞核、彈性纖維排列整齊,外膜與中膜分界清楚。結(jié)果見圖1。

    4.3 復(fù)方鉤藤降壓片對模型大鼠腎動脈病理形態(tài)的影響

    空白對照組腎動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮完整,中膜平滑肌細胞核、纖維完整,外膜正常;模型組腎動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮大多數(shù)完整,局部有缺損,中膜平滑肌細胞核、纖維排列紊亂,外膜正常;陽性藥組腎動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮完整,中膜平滑肌細胞核、纖維基本正常,外膜正常;復(fù)方鉤藤降壓片組腎動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮完整,中膜平滑肌細胞核、纖維排列正常,外膜正常。結(jié)果見圖2。

    4.4 復(fù)方鉤藤降壓片對模型大鼠胸主動脈壁單核細胞趨化蛋白-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-9蛋白表達的影響

    空白對照組胸主動脈壁內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮弱陽性,中膜小部分平滑肌細胞核弱陽性,外膜纖維部分弱陽性;模型組胸主動脈壁內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮陽性,中膜部分平滑肌細胞核陽性,外膜纖維陽性;陽性藥組胸主動脈壁內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮輕度陽性,中膜少量平滑肌細胞核弱陽性,外膜纖維部分弱陽性;復(fù)方鉤藤降壓片組胸主動脈壁內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮輕度陽性,中膜少量平滑肌細胞核弱陽性,外膜纖維部分弱陽性。陽性顆粒為棕黃色,主要位于細胞核中,見圖3??瞻讓φ战M胸主動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮強陽性,中膜少數(shù)平滑肌細胞核弱陽性,外膜纖維強陽性;模型組胸主動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮強陽性,中膜部分平滑肌細胞核、胞質(zhì)弱陽性,外膜纖維強陽性;陽性藥組胸主動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮強陽性,中膜少量平滑肌細胞核弱陽性,外膜纖維強陽性;復(fù)方鉤藤降壓片組胸主動脈內(nèi)膜與內(nèi)膜上皮強陽性,中膜近內(nèi)膜部平滑肌細胞核弱陽性,外膜纖維強陽性。陽性顆粒為棕黃色,主要位于細胞核、細胞質(zhì)中,見圖4。與空白對照組比較,模型組胸主動脈壁內(nèi)皮細胞MCP-1、MMP-9蛋白表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,各給藥組胸主動脈壁內(nèi)皮細胞MCP-1、MMP-9蛋白表達顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

    5 討論

    血管重塑是心血管疾病的靶器官損害的共同病理基礎(chǔ),貫穿于高血壓病發(fā)生、發(fā)展的整個過程。有研究者利用自發(fā)性高血壓卒中型大鼠腦模型研究血管重塑,發(fā)現(xiàn)動脈壁平滑肌細胞重新排列和平滑肌細胞增生,血管反應(yīng)性的改變直接侵犯管腔等均可導(dǎo)致血管擴張、管壁肥厚、血管重塑[6]。

    有研究顯示,MCP-1、MMP-9等炎癥因子與高血壓病血管重塑密切相關(guān)[7]。MCP-1屬于趨化因子,在眾多SHR模型中,檢測到靶器官內(nèi)MCP-1表達均增強;有研究顯示,MCP-1對單核/巨噬細胞及T淋巴細胞有強烈化學(xué)趨化性[8]。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員中明膠酶的一種,是一種炎癥標記物。高血壓時,血壓異常波動容易導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損,并伴有大量的炎性細胞因子參與炎癥因子的表達,可刺激MMP-9增強[7];研究表明,增強MMP-9的表達和活性,將影響眾多心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展,尤其與高血壓相關(guān)[9-11];Derosa等[12]發(fā)現(xiàn)高血壓病患者心臟和血液中MMP-9、MMP-2表達均上調(diào);Tayebjee等[13]研究發(fā)現(xiàn),高血壓病患者血漿MMP-9水平在治療前顯著升高,標準治療后均下降,且血漿MMP-9濃度與心血管危險呈正相關(guān)趨勢。

    高血壓病屬中醫(yī)學(xué)“眩暈”范疇,多為本虛標實之證,肝腎虧虛為其本,風、瘀為其標。復(fù)方鉤藤降壓片是基于陰虛-陽亢-絡(luò)阻機制而設(shè)立,方中鉤藤清熱平肝、熄風定驚,為君藥。川芎活血化瘀、行氣止痛;麥冬養(yǎng)陰生津、滋補肝陰,使肝陽平復(fù),肝風自滅,與川芎共為臣藥。諸藥合用,共奏養(yǎng)陰、清熱、柔肝、活血通絡(luò)之效。本研究結(jié)果顯示,模型組較空白對照組MCP-1、MMP-9表達呈上升趨勢,提示MCP-1、MMP-9參與高血壓病血管重塑。葉氏等[14]發(fā)現(xiàn)復(fù)方鉤藤降壓片能有效地降低SHR血壓及逆轉(zhuǎn)左室肥厚;能明顯降低胸主動脈中膜厚度,抑制胸主動脈血管重塑;顯著促進血管內(nèi)皮依賴性舒張功能,抑制血管重構(gòu)。本研究表明,復(fù)方鉤藤降壓片對SHR具有較好的降壓效果,與前期實驗結(jié)果一致,降壓溫和、平穩(wěn)。該方能減輕炎癥反應(yīng),調(diào)控血管重塑,保護靶器官。此作用可能是通過下調(diào)胸主動脈壁內(nèi)皮細胞MCP-1、MMP-9蛋白表達而實現(xiàn)的。

    參考文獻:

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    (收稿日期:2016-01-10)

    (修回日期:2016-02-26;編輯:華強)

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