黑木耳多糖提取的工藝研究

李凡姝，張煥麗，馬　慧，崔曉彤，聶文文，李歡歡，肖志剛

（沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽　110034）

黑木耳多糖提取的工藝研究

李凡姝，張煥麗，馬慧，崔曉彤，聶文文，李歡歡，*肖志剛

（沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧沈陽110034）

通過單因素試驗研究了超聲時間、超聲溫度、超聲功率、水浴溫度、水浴時間、料液比對黑木耳多糖提取率的影響，結(jié)果表明超聲時間、超聲溫度、水浴溫度、料液比對黑木耳多糖提取效果的影響相對明顯，超聲功率和水浴時間對黑木耳多糖提取效果的影響相對不明顯。在正交試驗結(jié)果上，通過極差分析、方差分析得到該試驗最佳提取工藝組合。結(jié)果表明，超聲波提取黑木耳多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)為水浴溫度75℃，超聲時間15 min，超聲溫度65℃，料液比1∶40；在此條件下，黑木耳多糖最佳提取率為10.622%。

黑木耳；多糖；超聲波；提取

黑木耳，是我國重要食用菌之一，具有涼血、活血、益氣強身等多種保健功能，是營養(yǎng)價值較高的食藥用菌，多糖是其主要的活性成分之一[1-2]。多糖能治療多種免疫缺損疾病，能抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5-6]、降低膽固醇[7]、降血糖血脂、抗病毒[8]等。周國華等人[9]研究了黑木耳多糖的降血脂作用，分別用低、中、高3種不同濃度的黑木耳多糖給高血脂小鼠灌胃。結(jié)果顯示，對照組小鼠的總膽固醇、血清甘油三酯、低密度脂蛋白均高于黑木耳多糖組小鼠，表明黑木耳多糖有降血脂作用。宗燦華等人[10]研究了黑木耳多糖對腫瘤的抑制作用，利用硝酸還原酶法測定小鼠血清NO含量。結(jié)果表明，黑木耳多糖的低、中、高劑量對腫瘤的抑制率分別為24.117%，32.148%，41.121%，說明黑木耳多糖含量越高，對腫瘤的抑制作用越顯著。

本課題以黑龍江省海林林區(qū)優(yōu)質(zhì)黑木耳為原料，通過熱水浸提協(xié)同超聲波工藝破碎黑木耳細胞壁，使功能性成分多糖溶出透過細胞壁而分散到溶劑中。通過單因素試驗測定不同提取條件對黑木耳多糖提取率的影響情況，正交試驗確定黑木耳多糖最佳提取工藝參數(shù)。

1　試驗方案設(shè)計

1.1原料與試劑

黑木耳，產(chǎn)自黑龍江省牡丹江市；葡萄糖、濃硫酸、苯酚等，均為國產(chǎn)分析純。

錘式旋風(fēng)磨，上海嘉定糧油儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9146A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；WFZUV-2000型紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；格蘭仕微波爐，佛山市格蘭仕微波爐電器有限公司產(chǎn)品；布氏抽濾器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.2黑木耳樣品預(yù)處理

黑木耳干燥（70℃，24 h）→粉碎→過篩（40目）→儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3黑木耳多糖提取工藝流程

取適量干木耳粉加水調(diào)配料液比→水浴浸提→微波/超聲處理→真空抽濾→濾液稀釋50倍→苯酚硫酸法顯色→測定吸光度。

1.4多糖的測定方法

利用苯酚-硫酸法測定多糖含量，吸取2 mL稀釋液，加入1 mL 6%的苯酚和5 mL濃硫酸，搖勻后放入100℃沸水中加熱15 min，冷卻后于490 nm波長下測定吸光度，計算黑木耳多糖化合物含量。根據(jù)回歸方程得出提取液濃度C（mg/L），然后按多糖提取率公式計算出黑木耳多糖類化合物的提取率[11]。

多糖提取率=CV×1 000/m×0.9×50×100%.

式中：C——測量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m——原料干質(zhì)量，g；

0.9——還原糖換算為多糖的系數(shù)；

50——提取液稀釋倍數(shù)。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL各加水補至2.0 mL，然后加入質(zhì)量分數(shù)為6%苯酚1 mL和濃硫酸5 mL，搖勻，靜止5 min，于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，于490 nm波長下以試劑空白為參比，測定吸光度。

1.6單因素試驗設(shè)計

1.6.1水浴溫度對黑木耳多糖提取率的影響

取1 g木耳粉6份，水浴溫度分別采用50，60，70，80，90℃，水浴45 min，然后在超聲功率140 W，超聲溫度60℃的條件下作用5 min，于490 nm下測定吸光度。

1.6.2水浴時間對黑木耳多糖提取率的影響

取1 g木耳粉6份，在水浴溫度60℃，水浴時間分別為15，30，45，60，75，90 min，料液比1∶50，超聲功率140 W，超聲溫度60℃的條件下作用5 min，于波長490 nm下測定吸光度。

1.6.3料液比對黑木耳多糖提取率的影響

取1 g木耳粉5份，以料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60比例加入蒸餾水，在60℃條件下水浴加熱45 min，超聲功率140 W，超聲溫度60℃條件下作用5 min，于波長490 nm下測定吸光度。

1.6.4超聲溫度對黑木耳多糖提取率的影響

取1 g木耳粉5份，料液比1∶50混合，在60℃條件下水浴加熱45 min，隨后在超聲溫度40，50，60，70，80℃，超聲功率140 W的條件下作用5 min，于490 nm下測定吸光度。

1.6.5超聲時間對黑木耳多糖提取率的影響

取1 g木耳粉6份，料液比1∶50混合，在60℃條件下水浴加熱45 min，隨后在超聲溫度60℃，超聲功率140 W的條件下分別作用5，10，15，20，25，30 min，于波長490 nm下測定吸光度。

1.6.6超聲功率對黑木耳多糖提取率的影響

取1g木耳粉6份，料液比1∶50混合，在60℃條件下水浴加熱45 min，隨后在超聲功率分別為100，120，140，160，180 W的條件下，以超聲溫度60℃作用5 min，于波長490 nm下測定吸光度。

1.7正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果選定4個主要影響因素，選取各因素的較優(yōu)區(qū)域，進行四因素三水平L9（34）正交試驗。

2　試驗結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL各加水補至2.0 mL，測定吸光度。

苯酚硫酸法測定葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1　苯酚硫酸法測定葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，葡萄糖含量與吸光度的回歸方程為Y=5.175X+0.047 5，R2=0.999 0。

2.2單因素試驗

2.2.1水浴溫度對黑木耳多糖提取率的影響

料液比1∶50，水浴時間45 min，超聲功率140 W，超聲溫度60℃，超聲時間5 min，分別采用水浴溫度50，60，70，80，90℃提取黑木耳多糖。

水浴溫度對黑木耳多糖提取率的影響見圖2。

圖2　水浴溫度對黑木耳多糖提取率的影響

由圖2可知，黑木耳多糖的提取率隨水浴溫度的上升而上升，當(dāng)水浴溫度大于80℃時提取率上升趨于平緩。這可能是因為在適宜溫度范圍內(nèi)，黑木耳破碎后溶出的纖維素酶與果膠酶破壞了細胞壁，因而多糖溶出率上升；當(dāng)溫度大到一定程度時，酶失活，影響了黑木耳多糖提取率的繼續(xù)上升。

2.2.2水浴時間對黑木耳多糖提取率的影響

料液比1∶50，超聲功率140 W，超聲溫度60℃，超聲時間5 min，水浴溫度60℃，分別采用水浴時間15，30，45，60，75，90 min提取黑木耳多糖。

水浴時間對黑木耳多糖提取率的影響見圖3。

圖3　水浴時間對黑木耳多糖提取率的影響

由圖3可知，隨水浴時間的增加，黑木耳多糖提取率緩慢上升后下降。在75 min時提取率達到最大值，此時黑木耳多糖溶解最充分。

2.2.3料液比對黑木耳多糖提取率的影響

水浴溫度60℃條件下加熱45 min，超聲功率140 W，超聲溫度60℃，超聲時間5 min，分別以料液比1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60提取黑木耳多糖。

料液比對黑木耳多糖提取率的影響見圖4。

圖4　料液比對黑木耳多糖提取率的影響

由圖4可知，隨料液比的增大黑木耳多糖提取率先上升后下降，可能是當(dāng)超聲波作用時，起初提取液過少液體較為黏稠不利于超聲波空化作用的產(chǎn)生，也不利于超聲波在水中的傳播擴散，所以提取率相對較低，料液比增大到1∶40時超聲提取效果最好。隨后隨溶劑體積增大，黑木耳多糖濃度降低，這可能是溶劑體積過大，減弱了超聲波輻射效果，影響了反應(yīng)體系的熱力學(xué)作用和機械作用，降低了細胞壁的破碎程度，因此曲線呈拋物線型。

2.2.4超聲溫度對黑木耳多糖提取率的影響

料液比1∶50，水浴溫度60℃下加熱45 min，超聲功率140 W，超聲時間5 min，超聲溫度分別采用40，50，60，70，80℃提取黑木耳多糖。

超聲溫度對黑木耳多糖提取率的影響見圖5。

圖5　超聲溫度對黑木耳多糖提取率的影響

由圖5可知，超聲溫度對黑木耳多糖提取率影響為先增大后減小，原因可能是在一定超聲功率下，隨超聲溫度升高，分子運動更加劇烈，加快了溶質(zhì)的擴散和溶劑的滲透，有利于細胞內(nèi)多糖的浸出；當(dāng)超聲溫度過高時，酶的活性遭到破壞，所以黑木耳多糖提取率下降。

2.2.5超聲時間對黑木耳多糖提取率的影響

料液比1∶50，水浴溫度60℃下加熱45 min，在超聲溫度60℃，超聲功率140 W條件下分別作用5，10，15，20，25，30 min。

超聲時間對黑木耳多糖提取率的影響見圖6。

圖6　超聲時間對黑木耳多糖提取率的影響

由圖6可知，黑木耳多糖提取率先緩慢上升后持續(xù)下降。在一定超聲功率作用下，隨超聲時間的延長，細胞壁破碎程度增大，利于黑木耳多糖溶出，提高提取率；當(dāng)超聲時間大于10 min黑木耳多糖提取率開始下降，這可能是細胞內(nèi)的淀粉糊化堵塞顆?？椎?，影響了黑木耳多糖溶出細胞壁。

2.2.6超聲功率對黑木耳多糖提取率的影響

料液比1∶50，水浴溫度60℃下加熱45 min，超聲溫度60℃作用5 min，超聲功率分別采用100，120，140，160，180 W提取黑木耳多糖。

超聲功率對黑木耳多糖提取率的影響見圖7。

圖7　超聲功率對黑木耳多糖提取率的影響

由圖7可知，隨著超聲功率增大，黑木耳多糖提取率先增大后減小，這是因為超聲功率不斷增大，黑木耳內(nèi)的分子運動加劇，細胞內(nèi)水蒸氣汽化產(chǎn)生的壓力使細胞壁破壞程度加大，細胞內(nèi)多糖的浸出率隨之提高。但超聲功率過大時，浸提出來的淀粉多糖會迅速糊化，進而堵塞黑木耳顆粒內(nèi)的孔道，使細胞內(nèi)剩余多糖的浸提變得相對困難。

2.3正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果選定4個主要影響因素為超聲時間（A）、超聲溫度（B）、料液比（C）、水浴溫度（D）。試驗過程中超聲功率為140 W，水浴時間為45 min。

正交試驗的因素與水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1　正交試驗的因素與水平設(shè)計

表2　正交試驗結(jié)果

通過極差分析可看出C>B>A>D，所以對黑木耳多糖提取影響的主次順序為料液比>超聲溫度>超聲時間>水浴溫度，即料液比的影響最大，水浴溫度影響最小，從正交試驗中可以得到最佳工藝組合為A3B3C2D1，提取率為10.622%；由極差分析得到的最佳工藝組合為A1B3C2D1。因素D的極差最小，所以將此作為方差列進行方差分析。

黑木耳多糖提取率的方差分析結(jié)果見表3。

表3　黑木耳多糖提取率的方差分析結(jié)果

由方差分析可知，超聲溫度、料液比和超聲時間對黑木耳多糖提取率的影響均達到顯著水平（p< 0.05）。由F值可知，各因素對黑木耳多糖提取率的影響顯著順序為超聲溫度>料液比>超聲時間，水浴溫度為最不顯著因素。

2.4驗證試驗

對直觀分析得到的2組最佳工藝組合A3B3C2D1和A1B3C2D1分別進行黑木耳多糖提取率的測定。

驗證試驗見表4。

表4　驗證試驗

由表4可知，工藝組合A3B3C2D1的提取率高于A1B3C2D1，所以該試驗的最佳工藝條件為A3B3C2D1。

3　結(jié)論

試驗研究了黑木耳多糖提取的最佳工藝，單因素試驗中分別研究了超聲溫度、超聲時間、超聲功率、水浴溫度、水浴時間、料液比對黑木耳多糖提取率的影響。結(jié)果表明，超聲時間、超聲溫度、料液比、水浴溫度對黑木耳多糖提取率影響較大，而超聲功率和水浴時間對多糖提取率影響不大。由正交試驗結(jié)果可知，最佳工藝組合為A3B3C2D1；由極差分析可知，最佳工藝組合為A1B3C2D1；由方差分析可知，各因素對黑木耳多糖提取率影響的主次順序依次為料液比>超聲溫度>超聲時間>水浴溫度；超聲溫度>料液比>超聲時間，其都為顯著性因素，水浴溫度為最不顯著因素。通過驗證試驗確定了最佳工藝組合為A3B3C2D1，即超聲時間15 min，超聲溫度65℃，水浴溫度75℃，料液比1∶40，最大提取率為10.622%。

[1]朱雪瓊.黑木耳多糖的提取、功能及單糖組成的研究[D].南寧：廣西大學(xué)，2014.

[2]韓春然，徐麗萍.黑木耳多糖的提取、純化及降血脂作用的研究 [C].//東西方食品業(yè)高層論壇論文匯編.北[3]Jie Y，Sun R，Zhao Z，et al.Auricularia polytricha，polysaccharides induce cell cycle arrest and apoptosis in human lung cancer A549 cells[J].International Journal of Biological Macromolecules，2014，68（7）：67-71.

京：中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會，2007：54-58.

[4]Song G，Du Q.Structure characterization and antitumor activity of an α β-glucan polysaccharide from Auricularia polytricha[J].Food Research International，2012，45（1）：381-387.

[5]Zhang H，Wang Z Y，Zhang Z，et al.Purified Auricularia auricular judae polysaccharide（AAP I-α） prevents oxidative stress in an ageing mouse model[J].Carbohydrate Polymers，2011，84（1）：638-648.

[6]Sun Y X，Liu J C，Kennedy J F.Purification，composition analysis and antioxidant activity of different polysaccharide conjugates（APPs） from the fruiting bodies of Auricularia polytricha[J].Carbohydrate Polymers，2010，82（2）：299-304.

[7]Shuang Z，Rong C，Yu L，et al.Extraction of a soluble polysaccharide from Auricularia polytricha，and evaluation of its anti-hypercholesterolemic effect in rats[J].Carbohydrate Polymers，2015，122（3）：39-45.

[8]Nguyen T L，Chen J，Hu Y，et al.In vitro antiviral activity of sulfated Auricularia auricula，polysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers，2012，90（3）：1 254-1 258.

[9]周國華，于國萍.黑木耳多糖降血脂作用的研究 [J].現(xiàn)代食品科技，2005，21（1）：46-48.

[10]宗燦華，于國萍.黑木耳多糖抑制腫瘤作用的研究 [J].中國醫(yī)療前沿，2007（12）：5-7.

[11]李公斌.黑木耳多糖分子修飾及功能與應(yīng)用研究 [D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2006.◇

Study of Auricularia auricula Polysaccharide Extraction Technology

LI Fanshu，ZHANG Huanli，MA Hui，CUI Xiaotong，NIE Wenwen，LI Huanhuan，*XIAO Zhigang
（College of Grain Science and Technology，Shenyang Normal University，Shenyang，Liaoning 110034，China）

Through the single factor experiments of ultrasonic time，ultrasonic temperature，ultrasonic power meter，water bath temperature，bath time，ratio of material to liquid on the Auricularia auricula polysaccharide extraction are studied.The results show that the effects of ultrasonic time，ultrasonic，temperature，water bath temperature，solid to liquid ratio on the extraction effect of Auricularia auricula polysaccharide is relatively obvious，ultrasonic power and water bath time on the effect of Auricularia auricula polysaccharide extraction effect is not obvious.The results show that the optimum process parameters of ultrasonic extraction of Auricularia auricula polysaccharides the temperature is 75℃，ultrasonic time 15 min，ultrasonic temperature of 65℃，ratio of solid to liquid 1∶40.In the condition of Auricularia auricula polysaccharides，extraction rate is 10.622%.

Auricularia auricula；polysaccharide；ultrasonic；extraction

TS201

Adoi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.09.034

2016-07-25

遼寧省“百千萬人才工程”資助項目（2013921038）；沈陽市科技創(chuàng)新專項資金（F14-104-3-00）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀科技人才支持計劃（第一層次）資助專項（LR2015062）。

李凡姝（1991— ），女，在讀碩士，研究方向為生物化工。

肖志剛（1972— ），男，博士，教授，研究方向為糧食油脂及植物蛋白工程。