ANRIL基因與中國(guó)川東北漢族人群動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)性研究*

熊利　張波　柳華　劉偉　張愛(ài)民　李健康　季一飛

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院，1.康復(fù)科；2.神經(jīng)內(nèi)科，四川 南充 637000)

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ANRIL基因與中國(guó)川東北漢族人群動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)性研究*

熊利1張波1柳華2劉偉2張愛(ài)民1李健康1季一飛2

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院，1.康復(fù)科；2.神經(jīng)內(nèi)科，四川 南充 637000)

目的探討ANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 locus, ANRIL)基因與中國(guó)川東北漢族人群動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(Atherosclerotic stroke, ATS)的相關(guān)性。方法選擇我國(guó)川東北地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，采用病例-對(duì)照研究，以200例ATS患者作為病例組，同期體檢的健康人群205例作為對(duì)照組進(jìn)行研究。對(duì)ATS發(fā)病常見(jiàn)的環(huán)境危險(xiǎn)因素和ANRIL基因4個(gè)單核甘酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)(rs1537378, rs7865618, rs10757274, rs2383206)進(jìn)行分析，比較不同基因型與ATS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，并根據(jù)性別和年齡進(jìn)一步分組，進(jìn)行亞組分析研究ATS是否具有年齡及性別遺傳特異性。結(jié)果超重、血脂異常與ATS顯著相關(guān)(P<0.05)；rs1537378多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型、rs7865618多態(tài)位點(diǎn)的AA基因型與男性ATS顯著相關(guān)(P<0.05)，rs1537378多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型與年齡≥45歲人群ATS顯著相關(guān)(P<0.05)，均顯著增加其ATS易感性。結(jié)論超重、血脂異常是ATS的危險(xiǎn)因素；ANRIL基因SNPs與中國(guó)川東北漢族人群ATS相關(guān)。

缺血性腦卒中；動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中；ANRIL基因；單核苷酸多態(tài)性

腦卒中是世界上第二位最常見(jiàn)的死亡原因和主要的致殘?jiān)騕1]。研究表明，卒中相關(guān)的年度醫(yī)療費(fèi)用預(yù)計(jì)將從2012年的716億美金突增到2030年的1831億美金[2]。在中國(guó)大陸，首次卒中年發(fā)病率為116～219/10萬(wàn)人，每年新發(fā)卒中約為1.5～2 百萬(wàn)人[3]，而2008年全國(guó)第三次居民死因調(diào)查發(fā)現(xiàn)，腦血管病已躍居為城鄉(xiāng)居民第1位死因[4]。我國(guó)每年用于治療腦血管病的總支出近200億元，給國(guó)家和眾多家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]，其中缺血性卒中(IS)是卒中的主要類型，占所有卒中的43.7%～78.9%[3]。研究表明遺傳因素在IS發(fā)病中起了重要作用[6]。由于80%的IS繼發(fā)于大動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的血管阻塞，因此，動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)易感基因研究成為IS遺傳研究的熱點(diǎn)。

染色體 9p21.3 區(qū)域上ANRIL(antisense noncoding RNA in the INK4 locus)基因與動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[7]，該基因4個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)(rs1537378, rs7865618, rs10757274, rs2383206)在動(dòng)脈粥樣硬化疾病中研究較多，因此，我們以動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死(ATS)患者為研究對(duì)象，采用SNP標(biāo)記，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析方法，探討ANRIL基因與ATS的相關(guān)性。旨在從分子水平上探討IS的發(fā)生機(jī)制和易感因素，為IS的防治提供新的理論依據(jù)。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2012年～2013年南充市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的IS患者200例作為病例組，入選標(biāo)準(zhǔn)為：① 符合世界衛(wèi)生組織(WHO)的IS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，首次發(fā)病，發(fā)病時(shí)間在3周內(nèi)。② 根據(jù)韓國(guó)修訂版的TOAST分型標(biāo)準(zhǔn)[9]，分型為ATS。③ 均為漢族，年齡19～70歲，且彼此間均無(wú)一、二、三級(jí)血緣關(guān)系。④ 均同意參與研究并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)為：① 有明確原因的繼發(fā)性腦梗死的患者；②合并嚴(yán)重肝腎功能不全、感染性疾病、惡性腫瘤及其他嚴(yán)重疾病的患者。選擇同期體檢的年齡性別匹配的健康人群205例作為對(duì)照組。

1.2研究方法

1.2.1臨床資料采用問(wèn)卷調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等方法對(duì)病例組與對(duì)照組的一般資料進(jìn)行收集，內(nèi)容包括：性別、年齡、身高、體重、體重指數(shù)(BMI)、糖尿病、高血壓、吸煙及飲酒，血脂異常等。BMI≥24為超重[10]；糖尿病以1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)確診[11]；高血壓以1999年WHO高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)確診[12]；平均每日吸煙1支以上，時(shí)間大于一年者為有吸煙史，平均每周飲白酒至少一次，時(shí)間大于一年者為有飲酒史[13]，血脂異常以2007年中國(guó)成人血脂異常防治指南標(biāo)準(zhǔn)確診[14]。

1.2.2血液DNA提取取每個(gè)受試者外周靜脈血2ml，枸櫞酸鈉抗凝，-80℃的冰箱貯存。使用血液基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Blood，DP318-02/03，北京TIANGEN)按說(shuō)明操作。

1.2.3SNPs分型本實(shí)驗(yàn)采用上海天昊生物科技有限公司的imLDR多重SNP分型平臺(tái)對(duì)所有樣本進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型。操作步驟簡(jiǎn)介如下：① DNA樣本取1μl, 1% agarose電泳對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查以及濃度估計(jì)，然后根據(jù)估計(jì)的濃度將樣本稀釋到工作濃度5～10 ng/μl。② 多重PCR反應(yīng)： PCR反應(yīng)體系(10 μl)為：1x GC-I buffer(Takara.)，3.0 mM Mg2+，0.3 mM dNTP，1 U HotStar Taq polymerase (Qiagen Inc.)，1 μl 樣本DNA和1 μl多重PCR引物(PCR 引物序列，見(jiàn)表1)。PCR循環(huán)程序?yàn)椋旱谝徊?5℃ 2分鐘；第二步是11個(gè)循環(huán)，依次是：94℃ 20秒，65℃40秒(在該步驟中每個(gè)循環(huán)每次降低0.5℃)，72℃ 1分鐘30秒；第三步是24個(gè)循環(huán)，分別是：94℃20秒，59℃30秒，72℃1分30秒；第四步72℃2分鐘，最后保持在4℃。

表1　PCR引物序列

注：F和R分別代表引物的方向(F.正向;R.反向)

③多重PCR產(chǎn)物純化：在10μl PCR產(chǎn)物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1小時(shí), 然后75 ℃滅活15分鐘。④連接反應(yīng)：連接反應(yīng)體系為：10x 連接緩沖液 1μl、高溫連接酶 0.25 μl、5′連接引物混合液(1 μM)0.4 μl，3′連接引物混合液(2 μM)0.4 μl、純化后多重PCR產(chǎn)物 2 μl、ddH2O 6 μl 混勻。連接程序?yàn)椋菏紫冗M(jìn)行38個(gè)循環(huán)(94 ℃ 1分鐘，56 ℃ 4分鐘)，最后保持在4 ℃。連接引物及其序列，見(jiàn)表2。⑤測(cè)序及分析：取0.5 μl 稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD，9μl Hi-Di 混勻，95 ℃變性5分鐘后上ABI3730XL測(cè)序儀。連接產(chǎn)物通過(guò)ABI3730XL的毛細(xì)管電泳來(lái)區(qū)分，測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用GeneMapper4.1 (AppliedBiosystems, USA) 進(jìn)行分析。

表2　連接引物及其序列

注：每個(gè)SNP位點(diǎn)有三條連接引物，兩條鑒別引物和一條通用引物，F(xiàn)和R分別代表引物的方向(F.正向，R.反向)；G、A則表示該條鑒別引物能夠鑒別出的基因，P代表該條引物為通用引物。

2　結(jié)果

2.1兩組資料分析病例組共200例，其中男性123例，女性77例，年齡36～72歲，平均(59.12±8.65)歲。對(duì)照組共205例，其中男性111例，女性94例，年齡40～70歲，平均(58.67±7.86)歲。兩組在性別、年齡及高血壓病史、糖尿病病史上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。超重 (BMI≥24)、血脂異常、吸煙史、飲酒史的比例差異在兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。多元logistic 回歸分析顯示，經(jīng)調(diào)整協(xié)變量后，兩組僅超重 (BMI≥24)、血脂異常的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3　兩組研究對(duì)象的臨床資料比較

注：P′值和OR′(95%CI)′值為調(diào)整各環(huán)境因素的影響后，多元Logistic回歸分析結(jié)果；兩組比較①P<0.05。

2.2單個(gè)SNP關(guān)聯(lián)分析病例組和對(duì)照組中SNP 多態(tài)位點(diǎn)基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡(HWE)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，所有SNP位點(diǎn)基因型頻率分布均符合HWE (P>0.05)，表明我們所選取的樣本來(lái)自同一群體，具有人群代表性適合做遺傳學(xué)分析。

2.2.1總樣本人群中SNPs和ATS的關(guān)系在總體樣本的所有遺傳模式下，病例組與對(duì)照組中rs2383206、rs10757274等2個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在等位基因及顯性遺傳模式下，2個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)(rs1537378， rs7865618)均與ATS發(fā)病顯著相關(guān)(P<0.05),調(diào)整協(xié)變量后，這種相關(guān)性仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4-1。

2.2.2亞組分析兩組研究對(duì)象均分別根據(jù)性別和年齡分成亞組，對(duì)不同組別的亞組間進(jìn)行分析。在年齡(<45和≥45 歲) 亞組中，由于年齡 <45 歲組中僅有10名ATS患者及32名對(duì)照人員，因此，僅對(duì)≥45 歲年齡組進(jìn)行分析。

2.2.2.1男性亞組分析男性亞組中4個(gè)SNPS位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布分析結(jié)果顯示，所有遺傳模式下，ATS組與對(duì)照組中rs2383206、rs10757274等2個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在等位基因及顯性遺傳模式下，rs1537378多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型(P=0.004)和等位基因A(P=0.004)與ATS顯著相關(guān)；rs7865618多態(tài)位點(diǎn)的AA基因型(P=0.013)和等位基因G(P=0.014)與ATS顯著相關(guān)。調(diào)整協(xié)變量后，rs1537378位點(diǎn)的GG基因型和rs7865618位點(diǎn)的AA基因型仍與ATS顯著相關(guān)，見(jiàn)表4-2。

表4-1　4個(gè)SNPS位點(diǎn)在總樣本人群中基因型分布情況

注：G#：表示基因型和少見(jiàn)等位基因；模型(D, R, A)#：表示顯性基因模式、隱性基因模式、等位基因模式；①：P<0.05

表4-2　4個(gè)SNPS位點(diǎn)在男性人群中基因型分布情況

注：G#：表示基因型和少見(jiàn)等位基因；模型(D, R, A)#：表示顯性基因模式、隱性基因模式、等位基因模式；①：P<0.05

2.2.2.2女性亞組分析在女性亞組的所有遺傳模式下，單變量分析和多元回歸分析均顯示ATS組與對(duì)照組中4個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型頻率均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。

2.2.2.3年齡≥45歲亞組分析在所有遺傳模式下，ATS組與對(duì)照組中rs2383206、rs10757274等2個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型頻率均沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。在等位基因及顯性遺傳模式下，在調(diào)整協(xié)變量前后，rs1537378多態(tài)位點(diǎn)和rs7865618多態(tài)位點(diǎn)都與ATS顯著相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4-3。

3　討論

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管系統(tǒng)疾病的主要病理基礎(chǔ)，斑塊破裂及繼發(fā)血栓形成可導(dǎo)致多種急性腦血管疾病的發(fā)生。IS大多繼發(fā)于大動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的血管阻塞，抗動(dòng)脈粥樣硬化是防治IS的重要手段之一。IS是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用或分別作用于不同環(huán)節(jié)而引起的一種復(fù)雜疾病，其與冠心病具有共同風(fēng)險(xiǎn)因子和病理生理學(xué)機(jī)制，環(huán)境危險(xiǎn)因素只能解釋大約50%的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，遺傳因素在IS發(fā)病中也具有十分重要的作用[6]，研究動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)易感基因，已成為IS遺傳研究的熱點(diǎn)之一。研究顯示，染色體9p21區(qū)域是與多種動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病相關(guān)的易感位點(diǎn)[15- 19]，包含多種基因簇參與細(xì)胞周期調(diào)控、增殖分化及調(diào)亡等多種重要生理過(guò)程[20]，該區(qū)域的遺傳變異是廣大學(xué)者最為關(guān)注的焦點(diǎn)之一。ANRIL是其基因簇的一員，并參與調(diào)控該基因簇的表達(dá)[19, 21]。已有研究證實(shí)，ANRIL與多種心腦血管疾病有關(guān)[22- 25]。通過(guò)對(duì)ANRIL基因與ATS相關(guān)性的研究，從遺傳因素角度并結(jié)合環(huán)境因素進(jìn)一步闡述ATS的發(fā)病機(jī)制，為ATS的防治提供理論基礎(chǔ)，具有重要意義。

表4-3　4個(gè)SNPS位點(diǎn)在45歲以上人群中基因型分布情況

注：G#：表示基因型和少見(jiàn)等位基因；模型(D, R, A)#：表示顯性基因模式、隱性基因模式、等位基因模式；①：P< 0.05

3.1ATS的環(huán)境危險(xiǎn)因素本研究對(duì)ATS患者常見(jiàn)的環(huán)境危險(xiǎn)因素進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)超重、血脂異常增加了ATS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。ATS被認(rèn)為是與血脂異常最為相關(guān)的卒中亞型[26]，高密度脂蛋白膽固醇(HDL- C)是動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)性因素，具有改善血管內(nèi)皮功能、抗血栓、促纖溶等作用[27]，越來(lái)越多的研究證實(shí)，HDL- C偏低是IS的危險(xiǎn)因素之一[28]。BMI是反應(yīng)人體是否肥胖的重要指標(biāo)，超重或肥胖是高血壓、糖尿病、血脂異常等多種代謝性疾病的危險(xiǎn)因素[29, 30]，有報(bào)道顯示30.6%的腦卒中由肥胖引起，肥胖可作為腦卒中的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，能增加腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[31, 32]。

3.2SNP與ATS相關(guān)性總體樣本人群的單位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，在等位基因及顯性遺傳模式下，rs1537378及rs7865618等2個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)基因型在病例組和對(duì)照組人群中的分布均有顯著性差異(P<0.05)，表明此2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)基因型是我國(guó)漢族人群ATS的易感位點(diǎn)。調(diào)整各環(huán)境因素的影響后，rs1537378多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型、rs7865618多態(tài)位點(diǎn)的AA基因型均與ATS顯著相關(guān)，是ATS的危險(xiǎn)等位基因，可增加ATS的易感性，也間接證實(shí)了9p21染色體區(qū)域遺傳與ATS的關(guān)聯(lián)性。

按照性別和年齡不同做進(jìn)一步的亞組分析，結(jié)果顯示在男性亞組中， rs1537378多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型、rs7865618多態(tài)位點(diǎn)的AA基因型與ATS顯著相關(guān)，增加了ATS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在女性亞組的所有遺傳模式下，4個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率及基因型頻率在病例組和對(duì)照組中均未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。在年齡≥45歲亞組中，可見(jiàn)rs1537378多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型與ATS顯著相關(guān)(P<0.05)，是ATS發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)基因型。提示rs1537378多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型、rs7865618多態(tài)位點(diǎn)的AA基因型可增加男性ATS的易感性，使ATS的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別增加了3.124倍和2.973倍；rs1537378多態(tài)位點(diǎn)的GG基因型與年齡≥45歲人群ATS顯著相關(guān)，ATS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別增加了2.191倍。

綜上所述，本研究首次揭示了ANRIL基因與中國(guó)漢族人群ATS的相關(guān)性，從遺傳學(xué)角度在基因水平上探討了ATS的易感因素，為ATS發(fā)生機(jī)制和防治的研究提供了新的理論基礎(chǔ)。但本研究病例來(lái)源均為我國(guó)四川地區(qū)的漢族人群，且樣本量較少，為闡明ANRIL基因在ATS中的確切作用，并避免因樣本量少所造成的偏倚，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本納入范圍，在其他地區(qū)和種族人群中進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，并增加更多相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行隨訪，以了解正常人群后期該病的發(fā)病情況以及病例人群的病程、進(jìn)展及預(yù)后與該基因的關(guān)系。

4　結(jié)論

本文資料顯示，在川東北漢族人群中，體質(zhì)量超重、血脂異常是ATS的危險(xiǎn)因素；并提示ANRIL基因SNPs與ATS有臨床相關(guān)性。

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ANRIL genetic variation is associated with atherothrombotic stroke in Chinese Han population in Northeast Sichuan

XIONG Li, ZHANG Bo, LIU Wei, et al.

(1.DepartmentofRehabilitation,TheSecondClinicalMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China; 2.DepartmentofNeurology,TheSecondClinicalMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

ObjectiveThis study aims were to evaluate whether the single nucleotide polymorphisms (SNP) of the ANRIL gene were associated with increased risk of atherosclerosis stroke (ATS) in Chinese Han population in Northeast Sichuan. Methods200 patients with ATS of Chinese Han population in Nanchong region (Northeast Sichuan) included as case group and 205 healthy people as control group. The genotyping of 4 SNPs in ANRIL gene were tested and analyzed, as well as the association of SNPs with ATS were compared. Subgroup analyses were also carried out to determine whether the effect of the ANRIL polymorphism is specific to age and gender in participants. ResultsDyslipidemia and overweight were significantly associated with ATS (P<0.05). GG genotype of rs1537378 and AA genotype of rs7865618 were significantly associated with ATS in male subgroup (P<0.05), while GG genotype of rs1537378 was significantly associated with ATS in ≥45 year’s old subgroup (P<0.05), which could increase ATS susceptibility. ConclusionsDyslipidemia and overweight are risk factor for ATS. SNPs of ANRIL genes are associated with ATS in Han nationality of Chinese population.

Ischemic stroke; Atherothrombotic stroke; ANRIL gene; Single nucleotides polymorphism

四川省科技廳資助項(xiàng)目(2012JY0043)；四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目資助(12ZA049)

柳華，博士，E-mail:hxliumedidoctor@163.com

R 543.5

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.005

2016-01-04； 編輯： 陳舟貴)