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    高效液相色譜法測(cè)定馬鈴薯中GA3含量

    2016-10-29 07:08:48許立興崔新儀關(guān)文強(qiáng)王艷斌
    保鮮與加工 2016年4期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    雷 靜,許立興,崔新儀,關(guān)文強(qiáng),*,李 寧,王艷斌

    (1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津300134;2.天津農(nóng)學(xué)院園藝系,天津300384)

    高效液相色譜法測(cè)定馬鈴薯中GA3含量

    雷靜1,許立興1,崔新儀2,關(guān)文強(qiáng)1,*,李寧2,王艷斌1

    (1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津300134;2.天津農(nóng)學(xué)院園藝系,天津300384)

    建立了高效液相色譜法測(cè)定馬鈴薯中赤霉素(GA3)含量的方法。采用反相C18色譜柱,以甲醇∶水=3∶7(V∶V)為流動(dòng)相,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。GA3的平均回收率為99.13%,方法檢出限為0.09mg/kg,定量限為0.12mg/kg。該方法操作簡(jiǎn)單,可快速、準(zhǔn)確地分離和測(cè)定馬鈴薯中的GA3含量。

    高效液相色譜法;赤霉素;馬鈴薯;檢測(cè)

    馬鈴薯塊莖在萌芽前需經(jīng)歷一段時(shí)間的休眠期。在馬鈴薯的休眠期內(nèi),即使塊莖處于一個(gè)適宜發(fā)芽的條件下也不會(huì)發(fā)芽[1]。馬鈴薯塊莖休眠期的長(zhǎng)短受諸多因素的影響,其中內(nèi)源激素含量對(duì)塊莖的休眠與萌發(fā)起著主導(dǎo)性的作用[2-6]。赤霉素為一大類植物激素,其中使用最廣和研究最多的是GA3,其對(duì)于打破馬鈴薯休眠,促進(jìn)馬鈴薯塊莖萌發(fā)具有重要作用[7]。植物內(nèi)源赤霉素在馬鈴薯中含量甚微,激素類似物干擾組分多,且其對(duì)溫度等條件極為敏感,因而準(zhǔn)確測(cè)定其含量比較困難。

    植物內(nèi)源赤霉素的主要測(cè)定方法有免疫分析法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。其中免疫分析法主要是酶聯(lián)免疫法(ELISA)和放射免疫法(RIA)。ELISA法選擇性高、靈敏度強(qiáng),并且操作簡(jiǎn)便,但對(duì)于植物激素進(jìn)行定量分析時(shí),測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差,因此并未得到廣泛使用。RIA法靈敏度高,能夠達(dá)到nmol或pmol的檢測(cè)水平,但測(cè)定時(shí)需125I和3H等放射性同位素。由于放射性同位素的穩(wěn)定性差,并且對(duì)操作者會(huì)造成身體損害,因此RIA法已較少使用。GC法需要被測(cè)物具有較低的極性和氣化溫度,但赤霉素的揮發(fā)性較差,需對(duì)其進(jìn)行一系列復(fù)雜的衍生化處理后才能進(jìn)行GC分析,繁瑣的樣品前處理增加了工作量,不利于大批量檢測(cè)[8]。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確且重復(fù)率高,但樣品凈化過(guò)程較為復(fù)雜,測(cè)定成本相對(duì)較高[9]。HPLC法是比較理想的植物內(nèi)源赤霉素的分析方法,具有較強(qiáng)的專一性,且重復(fù)性好,現(xiàn)已在多種植物激素的分析中得到應(yīng)用[10-12]。

    目前馬鈴薯中GA3的提取大多采用80%甲醇提取后,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法濃縮,其提取過(guò)程復(fù)雜,且用時(shí)較長(zhǎng),不利于快速測(cè)定馬鈴薯中GA3的含量[13-14]。HPLC法在測(cè)定內(nèi)源赤霉素時(shí),經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)分離效果差、峰形不良及拖尾嚴(yán)重等問(wèn)題,因此選擇合適的GA3提取方法和色譜條件尤為重要。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)馬鈴薯塊莖中的GA3含量進(jìn)行測(cè)定,建立靈敏、簡(jiǎn)單、快速的馬鈴薯中GA3含量的測(cè)定方法,以期為進(jìn)一步研究馬鈴薯萌芽過(guò)程中的GA3代謝與調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1材料與設(shè)備

    1.1.1材料與試劑

    馬鈴薯,品種為大西洋,由天津市西青區(qū)辛口鎮(zhèn)第六埠村脫毒馬鈴薯微型種薯繁育基地提供;GA3標(biāo)樣,純度≥98%,由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn);甲醇(色譜純),由天津康科德化學(xué)試劑公司生產(chǎn);1,2-二氯乙烷(色譜純),由天津市津科精細(xì)化工研究所生產(chǎn);冰乙酸(色譜純),由天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠生產(chǎn);濃鹽酸(分析純),由天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司生產(chǎn);試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

    1.1.2儀器與設(shè)備

    LC-20A日本島津高效液相色譜儀(LC-20T二元梯度泵,SPD-M20A檢測(cè)器,SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器),SPE C18固相萃取柱(規(guī)格:500 mg,6 mL),TUBE-MILL control試管研磨機(jī),F(xiàn)D8-4西盟國(guó)際真空冷凍干燥機(jī),Extrapid柱-盤式手動(dòng)固相萃取儀,BDSThermo C18反相色譜柱。

    1.2方法

    1.2.1處理方法

    馬鈴薯采收后立即運(yùn)送至天津商業(yè)大學(xué)冷庫(kù),16℃愈傷一周后貯藏于10℃冷庫(kù)中,每45 d取樣進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)將馬鈴薯從冷庫(kù)中取出,每6個(gè)馬鈴薯為一組,用削皮器去皮(2mm左右)后切成1 cm3的方塊混勻,取部分樣品真空冷凍干燥72 h,取出后用試管研磨機(jī)粉碎,裝入175mm×130mm×0.12mm規(guī)格的聚乙烯自封袋中密封保存,于-28℃冰箱中備用。試驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品的制備

    精密稱取GA3標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg于5mL棕色容量瓶中,用50%的甲醇溶解后稀釋至刻度,制得濃度為1mg/mL的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20℃冰箱中避光保存。

    1.2.3樣品前處理

    馬鈴薯赤霉素的提取參照Pan等[11]的方法并稍作改動(dòng)。稱取真空冷凍干燥后的馬鈴薯粉末2.00 g(相當(dāng)于鮮樣7.50 g),加入10mL丙醇∶水∶濃鹽酸= 2∶1∶0.002(V∶V∶V)的混合溶液,于4℃下振蕩30min,加入10mL二氯乙烷,4℃下振蕩30min后于4℃、12 000 r/min條件下離心15min,取下清液,并向殘?jiān)屑尤?mL二氯乙烷,二次離心,合并下清液為粗提液。將粗提液真空冷凍干燥(-80℃,12 h),所得殘留物加入5mL磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L,pH=3.5)中溶解,經(jīng)預(yù)活化的C18柱(6mL甲醇活化后用6mL 80%甲醇平衡)過(guò)濾,以1mL的80%甲醇進(jìn)行洗脫,并收集全部洗脫液,真空冷凍干燥后用流動(dòng)相溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?mL,溶液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾,濾液用于HPLC測(cè)定。

    1.2.4色譜條件

    BDSThermo C18反相色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇∶水=3∶7(V∶V);流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:20μL;波長(zhǎng):235 nm;柱溫:30℃。

    1.2.5試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

    1.2.5.1流動(dòng)相的篩選

    分別以甲醇∶水(用乙酸調(diào)節(jié)pH=3)=5∶5(V∶V)、4∶6(V∶V)、3∶7(V∶V)以及甲醇∶水=5∶5(V∶V)、4∶6(V∶V)、3∶7(V∶V)為流動(dòng)相,在流速為1.0mL/min,進(jìn)樣量為20μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm,柱溫為30℃的色譜條件下對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)品(10μg/mL)進(jìn)行分離,篩選最佳流動(dòng)相。

    1.2.5.2流速的篩選

    分別以0.8、1.0、1.5mL/min為流速,在流動(dòng)相為甲醇∶水=3∶7(V∶V),進(jìn)樣量為20μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm,柱溫為30℃的色譜條件下對(duì)馬鈴薯樣品中的GA3進(jìn)行分離檢測(cè),篩選最佳流速。

    1.2.5.3波長(zhǎng)的選擇

    分別以205、215、225、235 nm為檢測(cè)波長(zhǎng),在流動(dòng)相為甲醇∶水=3∶7(V∶V),流速為1.0mL/min,進(jìn)樣量為20μL,柱溫為30℃的色譜條件下對(duì)馬鈴薯樣品中的GA3進(jìn)行分離檢測(cè),篩選最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

    1.2.5.4內(nèi)源激素的定性分析

    將1.0mg/mLGA3儲(chǔ)備液稀釋至10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用“1.2.4”中的色譜條件對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離檢測(cè)。

    1.2.5.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

    向基質(zhì)中分別加入濃度為3、10、20、30、40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品,以基質(zhì)加標(biāo)濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將GA3的標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣,根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值,計(jì)算出此方法檢出限;根據(jù)10倍信噪比的峰響應(yīng)值,得出定量限。

    1.2.5.6回收率的測(cè)定和實(shí)際樣品分析

    按“1.2.3”所述方法進(jìn)行馬鈴薯塊莖中的GA3提取,并按照“1.2.4”中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,在已測(cè)樣品中加入2μg/g及4μg/g的標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定GA3含量,計(jì)算加標(biāo)回收率。利用“1.2.3”中的提取方法以及“1.2.4”中的色譜條件,分別對(duì)0、45、90 d的馬鈴薯樣品進(jìn)行GA3的提取測(cè)定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1流動(dòng)相的選擇

    流動(dòng)相篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以甲醇∶水(用乙酸調(diào)節(jié)pH=3)=5∶5(V∶V)、4∶6(V∶V)、3∶7(V∶V)為流動(dòng)相,對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)品(10μg/mL)進(jìn)行測(cè)定,分離效果不理想。由圖1可以看出,選用不同比例的甲醇-水作為流動(dòng)相,對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn),以甲醇∶水= 5∶5(V∶V)或者4∶6(V∶V)為流動(dòng)相時(shí),色譜峰不能實(shí)現(xiàn)徹底分離(圖1A,圖1B);而以甲醇∶水=3∶7(V∶V)為流動(dòng)相時(shí),液相色譜峰尖銳,且分離度高,重復(fù)性好(圖1C)。因此本試驗(yàn)以甲醇∶水=3∶7(V∶V)為流動(dòng)相。

    2.2流速的選擇

    試驗(yàn)共考察了0.8、1.0、1.5mL/min三個(gè)流速,比較其對(duì)GA3樣品分離效果的影響。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),當(dāng)流速為0.8mL/min時(shí),GA3的保留時(shí)間為7.196min;當(dāng)流速為1.5 mL/min時(shí),GA3的保留時(shí)間縮短至3.615min,但受到樣品中雜質(zhì)的干擾,出現(xiàn)雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰重疊現(xiàn)象嚴(yán)重的問(wèn)題;當(dāng)流速為1.0mL/min時(shí),GA3的保留時(shí)間為5.424min,此時(shí),雜質(zhì)峰和目標(biāo)峰可實(shí)現(xiàn)有效分離。經(jīng)過(guò)篩選最終確定測(cè)定的最佳流速為1mL/min。

    2.3波長(zhǎng)的選擇

    由圖2可見(jiàn),在205 nm(圖2A)、215 nm(圖2B)、225 nm(圖2C)檢測(cè)波長(zhǎng)下樣品中雜質(zhì)干擾性較強(qiáng),不能實(shí)現(xiàn)GA3的有效分離;235 nm(圖2D)下分離度最好,目標(biāo)峰與樣品中的雜峰均分離良好,色譜峰形對(duì)稱。

    2.4內(nèi)源激素的定性分析

    采用“1.2.4”中的色譜條件對(duì)GA3標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離。結(jié)果表明,GA3的保留時(shí)間為(5.424±0.072)min。

    2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

    為了減少基體效應(yīng)的影響,本試驗(yàn)采用試樣基體加標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)減小基質(zhì)的干擾,結(jié)果如圖3所示。經(jīng)計(jì)算得出GA3的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=3 386.5x+2 619.7,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1,線性關(guān)系良好,符合分析要求。該方法檢出限為0.09mg/kg,定量限為0.12mg/kg。

    2.6回收率的測(cè)定和實(shí)際樣品分析

    由表1可見(jiàn),加標(biāo)后回收率分別為100.50%和97.75%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.54%和3.57%。GA3的平均回收率為99.13%,平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%,符合定量分析的要求,并且數(shù)據(jù)誤差小,說(shuō)明上述樣品提取方法及色譜測(cè)定條件是可行的。

    表1 GA3加標(biāo)回收率Table 1 Standard addition recovery rate of GA3

    馬鈴薯貯藏期間GA3的變化見(jiàn)圖4。由圖4可以看出,馬鈴薯中GA3含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì),周長(zhǎng)艷[15]對(duì)4種窖藏方式下馬鈴薯中GA3變化情況進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,4種窖藏方式下馬鈴薯中GA3含量均呈先上升后下降的趨勢(shì),這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。馬鈴薯在休眠期時(shí),GA3含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,當(dāng)含量升高至一定的閾值時(shí)會(huì)引起馬鈴薯塊莖休眠解除[7]。本試驗(yàn)測(cè)定馬鈴薯中GA3含量最高為3.52μg/g,最低為2.04μg/g。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)馬鈴薯中的GA3含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,在以甲醇∶水=3∶7(V∶V)為流動(dòng)相,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm,柱溫為30℃條件下能實(shí)現(xiàn)馬鈴薯中GA3的有效分離,方法檢出限為0.09mg/kg,定量限為0.12mg/kg。該方法能滿足馬鈴薯貯藏過(guò)程中GA3變化的檢測(cè)要求,為進(jìn)一步研究馬鈴薯中的激素代謝奠定了基礎(chǔ)。

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    Determ ination of Gibberellin Acid in Potato by High Performance Liquid Chromatography

    LEIJing1,XU Li-xing1,CUIXin-yi2,GUANWen-qiang1,*,LINing2,WANG Yan-bin1
    (1.Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,CollegeofBiotechnology and Food Sciences,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China;2.Tianjin AgriculturalCollege,DepartmentofHorticulture,Tianjin 300384,China)

    A high performance liquid chromatographic(HPLC)method was developed for the determination of gibberellin acid(GA3)in potato.The chromatographic separation was carried out on a reverse phase C18 column using methanol∶water=3∶7(V∶V).The flow ratewas1.0mL/min,the sample injection volumewas 20μL,and the detection wavelength was235 nm.The average recovery ofGA3was99.13%.The limitofdetectionwas0.09mg/kg,and the limit ofquantitywas0.12mg/kg.It showed a simple and convenientmethod for rapid,accurate separation and determination gibberellin acid in potato.

    high performance liquid chromatography;gibberellin acid;potato;determination

    S532

    A

    10.3969/j.issn.1009-6221.2016.04.022

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271949)

    雷靜(1991—),女,漢族,碩士在讀,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

    關(guān)文強(qiáng),博士,教授,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

    2016-05-26

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