溫度、pH及金屬離子對大連蝦蛄消化酶活性的影響

姜　鶴，孔繁東，劉兆芳

（大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034）

溫度、pH及金屬離子對大連蝦蛄消化酶活性的影響

姜鶴，孔繁東*，劉兆芳

（大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034）

以大連蝦蛄為原料，從肌肉及消化腺中提取消化酶（蛋白酶和淀粉酶），研究其酶學特性。結(jié)果表明，大連蝦蛄肌肉中蛋白酶最適溫度為50℃，最適pH為8，反應激活劑為Mg2+、Ca2+和Mn2+，抑制劑為Pb2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+；消化腺中蛋白酶最適溫度為40℃，最適pH為6，EDTA對其有抑制作用，反應激活劑為Ca2+和Mn2+，抑制劑為Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+；大連蝦蛄肌肉中淀粉酶最適溫度為30℃，最適pH為7，反應激活劑為Mn2+，在濃度為20mmol/L時，激活作用最大，抑制劑為Pb2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+；消化腺中淀粉酶最適溫度為30℃，最適pH為7，EDTA對消化腺淀粉酶有抑制作用，反應激活劑為Mn2+和高濃度Ca2+，抑制劑為Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+。

大連蝦蛄；蛋白酶；淀粉酶；相對活性；溫度；pH；金屬離子

蝦蛄又叫“蝦爬子”、“螳螂蝦”、“琵琶蝦”、“蝦虎”，屬于節(jié)肢動物門，甲殼綱，口足目，蝦蛄科，渤海灣一帶數(shù)量較大，春汛4—7月、秋汛10—11月為捕撈的最佳時期［1-3］。蝦蛄與其他品種相比，具有能自然越冬，抗害避難和養(yǎng)殖風險小的優(yōu)點，值得推廣養(yǎng)殖［4］。

大多數(shù)研究認為，消化酶活性是反映甲殼類動物攝食、營養(yǎng)條件、生理狀況的良好指標。消化酶活性高低直接影響了甲殼動物對營養(yǎng)的吸收利用程度，進而影響其生長發(fā)育。大連蝦蛄因其產(chǎn)地在大連渤海灣附近海域而得名，為重要的經(jīng)濟類海鮮。了解蝦蛄體內(nèi)消化酶的特性，對蝦蛄的人工養(yǎng)殖具有重要的理論意義。試驗以大連渤海灣蝦蛄為研究對象，分別從蝦蛄肌肉及消化腺中提取蛋白酶和淀粉酶，并對其特性進行研究，以期為人工飼料的配制和蝦蛄的培育養(yǎng)殖提供一定的理論指導，同時為大連蝦蛄的消化生理、營養(yǎng)生理的研究提供重要的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1材料與試劑

鮮活渤海蝦蛄，2015年6月購于大連市海產(chǎn)品批發(fā)市場。

酪氨酸、干酪素、三氯乙酸、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、硫酸銨、福林酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、3，5-二硝基水楊酸、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鋅、乙酸鉛、硝酸鎂、氯化鈣、硫酸鐵、EDTA等，均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2儀器與設備

722型分光光度計，DK-S26型電熱恒溫水浴鍋，JJ200Y型精密電子天平，CT14RD冷凍離心機。

1.2方法

1.2.1酶液提取

蛋白酶液提?。喝∥r蛄消化腺及肌肉組織與預冷Tris-Hcl緩沖液按照1∶3（m/V）的比例混合，玻璃研磨器研磨，高速冷凍離心（4℃，10 000 r/min）20min，取上清液。采用（NH4）2SO4二級沉淀法提純，透析24 h后得蛋白酶液，冷藏備用［5-6］。

淀粉酶液提取：取蝦蛄消化腺及肌肉組織與pH 7.2的預冷磷酸鹽緩沖溶液以1∶10（m/V）的比例混合，用玻璃研磨器研磨，高速冷凍離心（4℃，10 000 r/min）

20min，取上清液作為淀粉酶粗提物，冷藏備用。

1.2.2酶活性測定

蛋白酶活性：以酪蛋白為底物，采用福林-酚法［7］測定。

淀粉酶活性：以淀粉為底物，采用3，5-二硝基水楊酸法測定。

1.2.3酶性質(zhì)研究

1.2.3.1最適溫度

將酶反應體系分別置于20、30、40、50、60、70、80℃恒溫水浴，測定酶活性，確定最適溫度。將酶活性最高的一組設為100%。為能直觀看出各因素對酶活性的影響，本文一律采用相對酶活性。

1.2.3.2最適pH

將酶反應體系分別置于pH為5、6、7、8、9、10、11（pH 5～8的緩沖液為磷酸氫二鈉-檸檬酸，pH 9～11的緩沖液為甘氨酸-氫氧化鈉），測定酶活性，確定最適pH。酶活性最高一組設為100%。

1.2.3.3EDTA和金屬離子對酶活性的影響

在酶液中分別加入濃度為5、10、15、20 mmol/L的EDTA、硫酸錳、硫酸銅、乙酸鉛、硫酸鋅、硝酸鎂、氯化鈣、硫酸鐵，室溫放置30min后測定殘余酶活性。以未經(jīng)金屬離子處理的酶液為對照組，其活性設為100%。

1.2.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Excel軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1蛋白酶性質(zhì)

2.1.1蝦蛄蛋白酶最適溫度的篩選

如圖1所示，在溫度為30～50℃范圍內(nèi)，肌肉中蛋白酶相對活性隨著溫度升高而升高，50℃時達到最高，然后隨溫度升高，蛋白質(zhì)變性，導致酶活性明顯下降［8-10］。消化腺中蛋白酶在溫度為40℃時相對活性最高，之后隨溫度升高而降低。大連蝦蛄肌肉中蛋白酶最適溫度為50℃，這與沈文英等［11］研究的溫度和pH對南美白對蝦消化酶活性的影響結(jié)果中，南美白對蝦蛋白酶最適溫度為50～60℃相吻合，消化腺中蛋白酶最適溫度為40℃。

2.1.2蝦蛄蛋白酶最適pH的篩選

如圖2所示，大連蝦蛄肌肉中蛋白酶相對活性隨著pH升高而增大，在pH為8時，相對酶活性最高；消化腺中蛋白酶在pH為6時相對活性最高?？梢?，肌肉中蛋白酶呈弱

堿性，消化腺中蛋白酶呈弱酸性，二者最適pH分別為8和6。消化腺中消化酶活性代表著蝦蛄消化能力和消化率，據(jù)此建議在蝦蛄飼料中可添加適量酸化劑，以增強酶活性，提高消化率，促進生長發(fā)育［12］。

2.1.3EDTA和金屬離子對蝦蛄蛋白酶活性的影響

如圖3所示，隨著EDTA濃度的升高，其對大連蝦蛄消化腺蛋白酶活性的抑制作用顯著增加。當EDTA濃度為20mmol/L時，對酶活性抑制率達到64%。

由表1可見，Mg2+、Ca2+和高濃度的Mn2+對蝦蛄肌肉中蛋白酶活性有不同程度的促進作用。Mg2+濃度為20mmol/L時對酶活性促進作用最大，此時酶相對活性升高約51%；Ca2+濃度為5mmol/L時，對酶活性促進作用最大，酶相對活性升高約27%；Mn2+濃度為

20mmol/L時，對酶活性促進作用最大，酶相對活性升高約85%，由此推斷該酶可能為一種金屬蛋白酶，需要一定的輔助因子，如Mg2+、Ca2+和Mn2+來促進底物和酶活性中心的親和力，從而提高酶活性［13-16］；在濃度為20mmol/L時，Pb2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+對酶活性抑制作用大小排序為：Pb2+＞Zn2+＞Cu2+＞Fe2+。

表1　　金屬離子對蝦蛄肌肉中蛋白酶相對活性的影響Table 1　Effects of differentmetal ions on the relative activity ofprotease in themuscle ofmantis shrimp　?。?）

由表2可見，Mn2+濃度為15～20mmol/L時，對蝦蛄消化腺蛋白酶活性有明顯的促進作用，在濃度為

20mmol/L時，對酶活性促進作用最大，酶相對活性升高約42%；Ca2+在濃度為20mmol/L時對酶活性促進作用最大；Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+對酶活性有不同程度的抑制作用，其中Cu2+、Zn2+、Fe2+濃度越大，對酶活性抑制作用呈增強趨勢，濃度為20mmol/L時，抑制作用大小排序為：Cu2+＞Fe2+＞Pb2+＞Zn2+＞Mg2+。

表2　　金屬離子對蝦蛄消化腺蛋白酶相對活性的影響Table 2　Effects of differentmetal ions on the relative activity ofprotease in the digestive gland ofmantis shrimp　　（%）

2.2淀粉酶性質(zhì)

2.2.1蝦蛄淀粉酶最適溫度的篩選

如圖4所示，在溫度為20～30℃范圍內(nèi)，肌肉及消化腺中淀粉酶相對活性隨著溫度升高而升高，在30℃時酶相對活性達到最高，然后隨溫度升高，蛋白質(zhì)變性，導致淀粉酶活性明顯下降。因此確定大連蝦蛄淀粉酶最適溫度為30℃。

2.2.2蝦蛄淀粉酶最適pH的篩選

pH是影響酶活性的重要因素之一，主要通過兩種途徑改變酶活性，一是改變酶和底物的結(jié)合，二是改變酶的構(gòu)象。如圖5所示，在設定的pH范圍內(nèi)，大連蝦蛄淀粉酶相對活性呈先升高后降低的趨勢，肌肉和消化腺中淀粉酶在pH為7時，酶相對活性最高?？梢姶筮B蝦蛄肌肉和消化腺中淀粉酶最適pH為7。

2.2.3EDTA和金屬離子對蝦蛄淀粉酶活性的影響

如圖6所示，隨著EDTA濃度的升高，其對大連蝦蛄消化腺淀粉酶活性的抑制作用顯著增加。當EDTA濃度為20mmol/L時，對酶活的抑制率達到70%。武忠亮等［17］研究表明，EDTA對煙草蔗糖酶有抑制作用。張勇俠等［18］的研究表明，EDTA對豬精液酸性磷酸酶有抑制作用，并認為EDTA由于鰲合酶活性中心的金屬離子而使酶活性降低。由此推斷，EDTA抑制蛋白酶和淀粉酶活性的主要原因是活性中心金屬離子被EDTA鰲合所致。

由表3可見，Mn2+對大連蝦蛄肌肉中淀粉酶活性有明顯的促進作用，濃度為20mmol/L時，促進作用最大，酶相對活性升高約68%；Pb2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+對淀粉酶活性有不同程度的抑制作用，其中Cu2+濃度越大對酶活性抑制作用越顯著，在濃度為20mmol/L時，各金屬離子抑制作用大小排序為：Zn2+＞Cu2+＞Pb2+＞Mg2+＞Ca2+＞Fe2+。

表3　金屬離子對蝦蛄肌肉中淀粉酶相對活性的影響Table 3　Effects of differentmetal ions on the relative activity ofamylase in themuscle ofmantis shrimp?。?）

由表4可見，Mn2+對大連蝦蛄消化腺淀粉酶活性有明顯的促進作用，濃度越高其對酶活性促進作用越強，濃度為20mmol/L時，促進作用最大，相對酶活性升高約215%；Ca2+在高濃度（15～20mmol/L）時，對酶活性表現(xiàn)為促進作用，15mmol/L時相對酶活性升高約93%；Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+對酶活性有不同程度的抑制作用，Cu2+表現(xiàn)為濃度越高，抑制作用越明顯，在濃度為20mmol/L時，抑制作用大小排序為：Fe2+＞Pb2+＞Zn2+＞Cu2+＞Mg2+。有毒金屬離子與酶之間可能存在著某種作用形式，即有毒金屬離子置換酶活性中心的必需金屬或有毒金屬離子結(jié)合酶分子中的咪唑基、巰基、羥基、氨基、肽基等功能基團，從而導致酶失活［19］。

表4　金屬離子對蝦蛄消化腺淀粉酶相對活性的影響Table 4　Effects of differentmetal ions on the relative activity of amylase in the digestive gland ofmantis shrimp　（%）

3　結(jié)論與討論

上述試驗結(jié)果表明，大連蝦蛄的蛋白酶特性為：①肌肉中蛋白酶最適溫度為50℃；最適pH為8；反應激活劑為Mg2+、Ca2+和Mn2+，當Mg2+和Mn2+濃度為

20mmol/L時，對酶活性促進作用最大，Ca2+濃度為5mmol/L時，對酶活性促進作用最大，推斷該酶可能為一種金屬酶；抑制劑為Pb2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+。②消化腺中蛋白酶最適溫度為40℃；最適pH為6；EDTA對其有抑制作用，Ca2+和Mn2+濃度為20mmol/L時，對酶活性促進作用最大，Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+對酶活性有不同程度的抑制作用。蛋白酶在不同部位最適pH不同，而消化腺蛋白酶最適pH為6，與南美白對蝦胃內(nèi)pH（5.4～5.5）相接近［20］，表明蝦蛄消化腺蛋白酶在偏酸性條件下活性較高。因此，在蝦蛄養(yǎng)殖過程中可適當添加酸化劑，提高其消化酶活性。

大連蝦蛄淀粉酶特性為：①肌肉中淀粉酶最適溫度為30℃；最適pH為7；反應激活劑為Mn2+，在濃度為20mmol/L時，激活作用最大；抑制劑為Pb2+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+。②消化腺中淀粉酶最適溫度為30℃；最適pH為7；EDTA對消化腺淀粉酶有抑制作用，反應激活劑為Mn2+和高濃度Ca2+（15～20mmol/L），Ca2+濃度為15mmol/L時促進作用最大，抑制劑為Pb2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+。大多數(shù)甲殼類動物淀粉酶的最適pH偏酸性或中性，在pH 5～7范圍內(nèi)［15］，本試驗中大連蝦蛄淀粉酶最適pH為7，與甲殼類動物淀粉酶性質(zhì)研究結(jié)果相一致。

以上研究均在試驗規(guī)定的反應時間條件下進行，但實際蝦蛄體內(nèi)酶起作用的時間要長得多，所以最適溫度只在一定條件下才有意義，在一定程度上反映消化酶的耐熱性和溫度對酶活性的影響規(guī)律。溫度通過影響動物消化器官中消化酶活性來影響食物的消化吸收，最終影響其生長發(fā)育。因此，應根據(jù)環(huán)境溫度的變化，及時調(diào)整飼料配方和投喂方式，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，促進人工養(yǎng)殖的快速、健康發(fā)展。

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Effectsof Tem perature，pH and M etal Ion on the Activity of Digestive Enzyme from Dalian M antis Shrim p

JIANG He，KONG Fan-dong*，LIU Zhao-fang
（Schoolof Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

The properties of digestive enzymes（protease and amylase）were investigated existing in themuscle and digestive gland of Dalianmantis shrimp.The results showed that，in themuscle of Dalianmantis shrimp，the optimal temperature for protease was 50℃，the optimal pH was 8，the protease was activated by Mg2+，Ca2+and Mn2+，declined by Pb2+，Cu2+，Zn2+and Fe2+.In the digestive gland of Dalian mantis shrimp，the optimal temperature for protease was 40℃，the optimal pH was 6，EDTA could inhibit the enzyme activity，protease was activated by Ca2+and Mn2+，and declined by Pb2+，Mg2+，Cu2+，Zn2+and Fe2+.In themuscle of Dalian mantis shrimp，the optimal temperature for amylase was 30℃，the optimal pH was 7，amylase was activated by Mn2+at high concentration，when the concentration of Mn2+was 20 mmol/L，the activating effectwas the largest，and declined by Pb2+，Mg2+，Ca2+，Cu2+，Zn2+and Fe2+.In the digestive gland of Dalian mantis shrimp，the optimal temperature for amylase was 30℃，the optimal pH was 7，EDTA could inhibit the enzyme activity，amylasewas activated by Mn2+and high concentration of Ca2+，and declined by Pb2+，Mg2+，Cu2+，Zn2+and Fe2+.

Dalianmantis shrimp；protease；amylase；relative activity；temperature；pH；metal ion

S917

A

10.3969/j.issn.1009－6221.2016.04.015

姜鶴（1989—），女，漢族，碩士在讀，研究方向：蛋白質(zhì)資源開發(fā)利用。

孔繁東，碩士，教授，研究方向：蛋白質(zhì)工程。

2016-04-22