復(fù)方蜂膠膠囊中非法添加格列波脲的分離與鑒定

黃海燕，鐘建理，饒偉文，陳瀚

（廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西桂林541002）

復(fù)方蜂膠膠囊中非法添加格列波脲的分離與鑒定

黃海燕，鐘建理，饒偉文，陳瀚

（廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西桂林541002）

目的分離和鑒定復(fù)方蜂膠膠囊中非法添加的格列波脲。方法采用半制備液相色譜法分離該化合物，并用波譜法鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果從復(fù)方蜂膠膠囊中分離純化得到的化合物，經(jīng)核磁共振（NMR）驗(yàn)證了其結(jié)構(gòu)。結(jié)論復(fù)方蜂膠膠囊中非法添加組分為格列波脲。

復(fù)方蜂膠膠囊；格列波脲；分離；鑒定；核磁共振

近年來，在藥品、保健食品中非法添加化學(xué)成分現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，危害公眾的身體健康，甚至還危及其生命安全，特別是降糖類保健食品，非法添加化學(xué)成分屢禁不止。目前，我國報(bào)道降糖類藥品、保健食品中非法添加的化學(xué)成分有二甲雙胍、苯乙雙胍、格列本脲、格列吡嗪、格列齊特、羅格列酮等［1-12］。筆者曾采用薄層色譜法和液質(zhì)聯(lián)用法從一批復(fù)方蜂膠膠囊中檢出非法添加的格列波脲（glibornuride）［13］。本研究中采用半制備液相色譜法分離出非法添加的組分格列波脲，并運(yùn)用核磁共振（NMR）進(jìn)行驗(yàn)證。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1260型高效半制備液相色譜儀（美國安捷倫公司）；1260 DAD VL+二級(jí)陣列管檢測(cè)器（美國安捷倫公司）；核磁共振儀（德國Bruker公司）；高效液相（Waters 2695型、2998 PAD型二極管陣列檢測(cè)器）-質(zhì)譜（VB-QMicro）聯(lián)用儀（美國Waters公司）。

1.2試藥

格列波脲對(duì)照品（加拿大TLC PharmaChem Inc，批號(hào)為Lot#1113-082B1，含量為86.5%）；乙腈、甲醇均為色譜純；其余試劑均為分析純；水為高純水；復(fù)方蜂膠膠囊（北京某保健食品廠，批號(hào)為110301）系消費(fèi)者郵購產(chǎn)品，服用后出現(xiàn)低血糖、頭昏等不良反應(yīng)后投訴并送檢的樣品。

2　方法與結(jié)果

2.1非法添加成分的確定（高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法）

色譜條件：色譜柱為WatersXBridgeTMC18柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm，美國Waters公司）；流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol/L乙酸銨溶液（70∶30）；流速0.2 mL/min；檢測(cè)波長235 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧電離源（ESI），正離子檢測(cè)，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，脫溶劑氣（N2）的流量為600 L/h，錐孔氣流量為50 L/h，錐孔電壓為30 V，掃描方式為全掃描一級(jí)質(zhì)譜，質(zhì)量數(shù)范圍為100～1 000。

成分測(cè)定：取格列波脲對(duì)照品2.58 mg，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取1 mL，加甲醇2 mL，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，作為對(duì)照品溶液。取1粒樣品內(nèi)容物，加三氯甲烷20 mL，超聲處理10 min，濾過，取濾液，蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL使溶解，取2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，作為供試品溶液。取對(duì)照品溶液和供試品溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液色譜出現(xiàn)與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間的色譜峰。采用二極管陣列檢測(cè)器比較相應(yīng)色譜峰的紫外-可見吸收光譜，結(jié)果吸收光譜相同，相應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜與對(duì)照品一致，即可判斷該批復(fù)方蜂膠膠囊含有格列波脲。

2.2提取分離

取10粒本品內(nèi)容物，加三氯甲烷20 mL，超聲處理10 min，濾過，殘?jiān)尤燃淄?0 mL，重復(fù)操作2次，合并濾液，濾液回收，溶劑至干，殘?jiān)蛹状?0 mL使溶解，即得供試品溶液。

取上述供試品溶液通過半制備液相色譜分離，色譜柱為ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，10 μm），檢測(cè)波長為235 nm，柱溫為25℃，流動(dòng)相為乙腈-水（70∶30），流速為5.0 mL/min，洗脫時(shí)間為5 min。收集與格列波脲對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致（約3.349 min）的色譜峰的流出液，40℃水浴旋蒸至溶液約100 mL，轉(zhuǎn)移至離心管中，放冷，靜置，析出白色結(jié)晶，離心，棄上清液，加5 mL水，攪拌，靜置，離心，棄上清液，沉淀物于五氧化二磷減壓干燥72 h，得類白色粉末（約50 mg）。

2.3結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.11H-NMR譜

1H-NMR（CDCl3，500 MHz）顯示出4個(gè)苯環(huán)氫的信號(hào)，其化學(xué)位移和歸屬如下。δ：7.85（2H，d，J=8.0Hz，H-2，6），7.31（2H，d，J=8.0 Hz，H-3，5），H-2，6受到—SO2NH—基的去屏蔽作用移向低場，H-3，5受到—CH3的屏蔽作用而移向高場。δ：8.38（1H，bra，—SO2NH），6.99（1H，s，—CONH）為2個(gè)氮上氫質(zhì)子的化學(xué)位移值。4.08（1H，m，H-1’），4.00（1H，d，J= 4.5 Hz，m，H-2’），2.42（3H，s，H-10），1.91（1H，t，J= 4.0 Hz，m，H-6’），1.77（1H，m，H-4’a），1.38（1H，m，H-5’a），1.18（1H，m，H-4’b），1.14（1H，m，H-5’b），0.90（3H，s，H-10’），0.88（6H，s，H-8’，9’）。

2.3.213C-NMR譜

13C-NMR（CD3OD，125 MHz）數(shù)據(jù)給出16個(gè)碳原子信號(hào)。δ：151.3（C-8）為羰基信號(hào)，144.9（C-4），136.7（C-1），130.0（C-3，5），127.5（C-2，6），處于雙鍵碳的化學(xué)位移范圍，歸屬為苯環(huán)上特征信號(hào)。74.0（C-2’），50.6（C-1’），49.8（C-3’），48.8（C-6’），45.5（C-7’），25.4（C-4’），21.8（C-10），20.0（C-8’），19.7（C-5’），18.4（C-9’），14.0（C-10’）。化合物結(jié)構(gòu)見圖1。

2.3.3HMBC譜

HMBC譜中，δ144.9（C-4）分別與質(zhì)子δ7.85（H-2，6），2.42（H-10）相關(guān)，δ：74.0（C-2’）與質(zhì)子1.77（H-4’a），1.18（H-4’b），0.90（H-10’）相關(guān)。據(jù)此，推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖1　化合物的結(jié)構(gòu)

圖2　主要HMBC關(guān)系圖

2.4波譜數(shù)據(jù)

1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.85（2H，d，J= 8.0 Hz，H-2，6），7.31（2H，d，J=8.0 Hz，H-3，5），4.08（1H，m，H-1’），4.00（1H，d，J=4.5 Hz，m，H-2’），2.42（3H，s，H-10），1.91（1H，t，J=4.0 Hz，m，H-6’），1.77（1H，m，H-4’a），1.38（1H，m，H-5’a），1.18（1H，m，H-4’b），1.18（1H，m，H-5’b），1.16（3H，s，H-10’），1.14（6H，s，H-8’，9’）。

13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：151.3（C-8），144.9（C-4），136.7（C-1），130.0（C-3，5），127.5（C-2，6），74.0（C-2’），50.6（C-1’），49.8（C-3’），48.8（C-6’），45.5（C-7’），25.4（C-4’），21.8（C-10），20.0（C-8’），19.7（C-5’），18.4（C-9’），14.0（C-10’）。

3　討論

復(fù)方蜂膠膠囊是以人參、蜂膠、吡啶甲酸鉻、黃芪、桑葉、山藥、枸杞子、玉竹、女貞子為主要原料制成的保健食品，有輔助降血糖、增強(qiáng)免疫力的保健功能。本研究中從復(fù)方蜂膠膠囊中分離提純得到化合物，通過NMR法驗(yàn)證，進(jìn)一步證明該保健食品中非法添加了化學(xué)藥品格列波脲。

曾試驗(yàn)用薄層刮板法、柱色譜法、重結(jié)晶法等方法對(duì)復(fù)方蜂膠膠囊中非法添加的格列波脲進(jìn)行分離提純，結(jié)果均不理想。半制備液相色譜分離也曾試驗(yàn)用甲醇-水（70∶30）為流動(dòng)相，但以乙腈-水（70∶30）為流動(dòng)相的分離效果較好，故本研究中選用后者為流動(dòng)相。

［1］魏清芳，王嘉林.液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜測(cè)定中藥及保健品中非法添加8種化學(xué)降糖藥［J］.中國藥事，2011，25（1）：70-72.

［2］施亞琴，姚靜，張啟明，等.薄層色譜法快速篩查降血糖中成藥及保健食品中添加磺酰脲類化學(xué)降糖藥［J］.藥物分析雜志，2007，27（1）：36-39.

［3］胡青，崔益泠，張，等.降血脂和降血糖類中藥及保健食品中違禁添加17種化學(xué)藥物的液相色譜-離子肼質(zhì)譜定性檢測(cè)［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40（2）：124-127.

［4］李亞琴，錢麗華，申蘭慧.薄層色譜法快檢降糖中藥添加的格列齊特［J］.藥物分析雜志，2008，28（2）：319-320.

［5］程顯隆，劉卉，肖新月，等.HPLC-DAD-MS聯(lián)用法檢測(cè)中藥降糖制劑及膠囊殼中非法添加羅格列酮的研究［J］.藥物分析雜志，2007，27（9）：1 325-1 328.

［6］殷帥，吳公平，雷玉萍.液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)中成藥和保健食品中添加輔助降血糖類藥品的研究［J］.藥物分析雜志，2010，30（12）：2 400-2 403.

［7］楊釗，陳安珍，吳愛英，等.測(cè)定降糖類中藥制劑及保健品中8種化學(xué)藥的研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44（11）：870-873.

［8］田雁鈺.參芪降糖顆粒中非法添加格列本脲的檢測(cè)［J］.中國藥房，2008，19（27）：2 131-2 132.

［9］張翠英，李振國，徐金玲.中藥制劑及保健品中違禁添加7種降糖藥物的LC-MS/MS定性檢測(cè)［J］.中國藥學(xué)雜志，2008，43（9）：707-709.

［10］何笑榮，鄒定，吳學(xué)軍，等.反相高效液相色譜法-二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定降糖中藥制劑中的化學(xué)藥品［J］.中國藥師，2005，8（10）：827-829.

［11］付大友，陳祥輝，譚文淵，等.降糖類中成藥中非法添加化學(xué)成分的測(cè)定［J］.現(xiàn)代化工，2012，32（1）：94-96.

［12］張翠英，徐金玲，李振國，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)中成藥中添加格列本脲、格列吡嗪［J］.藥物分析雜志，2008，28（2）：326-328.

［13］黃海燕，饒偉文，何軼，等.復(fù)方蜂膠膠囊中添加格列波脲的檢測(cè)［J］.藥物分析雜志，2013，33（11）：1 961-1 963.

Isolation and Identification of Glibornuride Illegally Added in Compound Propolis Capsules

Huang Haiyan，Zhong Jianli，Rao Weiwen，Chen Han
（Guilin Institute for Food and Drug Control，Guilin，Guangxi，China541002）

ObjectiveTo separate and identify the structure of the glibornuride as an illegal adulterant in a health product Compound Propolis capsules.M ethodsA pectroscopic method was used to isolate and a NMR method was used to identify the structure of glibornuride.ResultsThe chemical structure of the compound isolated from the capsule was identified by NMR.ConclusionThe compound is glibornuride，which is illegally added in Compound Propolis Capsules.

Compound Propolis Capsules；glibornuride；isolation；identification；NMR

R954；R284．1；R286．0

A

1006－4931（2016）14－0076－03

2015－08－13；

2016－02－23）