速效燒傷膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

葉玉華

（湖南省邵陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南邵陽(yáng)422000）

速效燒傷膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

葉玉華

（湖南省邵陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南邵陽(yáng)422000）

目的建立速效燒傷膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜（TLC）法對(duì)方中大黃和黃柏進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定黃柏中鹽酸小檗堿的含量。結(jié)果薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.100 6～2.515 0*g范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，r=0.999 2（n=6）；平均回收率為94.99%，RSD=1.40%（n=9）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便可行，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于速效燒傷膏的質(zhì)量控制。

速效燒傷膏；薄層色譜法；鹽酸小檗堿；高效液相色譜法

速效燒傷膏為湖南省武岡市中醫(yī)院制劑，主要由大黃、黃柏、紅花、延胡索等7味中藥組方，是在傳統(tǒng)名醫(yī)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上，運(yùn)用現(xiàn)代藥效學(xué)理論精心研制而成，具有清熱解毒、化瘀生肌等功效，主治燒傷、燙傷等疾病。該制劑在臨床應(yīng)用多年，療效確切，但由于為傳統(tǒng)驗(yàn)方，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有性狀、軟膏劑的通項(xiàng)檢驗(yàn)和微生物限度檢查，過(guò)于簡(jiǎn)單，不能有效地控制速效燒傷膏的質(zhì)量。為對(duì)速效燒傷膏的質(zhì)量進(jìn)行有效控制，本研究中根據(jù)處方組成、各藥材的投料量及制備工藝進(jìn)行分析，制劑中的君藥為黃柏，臣藥為大黃，故對(duì)制劑中的黃柏和大黃分別進(jìn)行了薄層色譜（TLC）定性試驗(yàn)，且經(jīng)多次試驗(yàn)證明，薄層色譜定性專屬性強(qiáng)，簡(jiǎn)便快速，且其他藥材對(duì)該試驗(yàn)均無(wú)干擾，能很好地控制上述2味藥材的質(zhì)量。為進(jìn)一步以量化的指標(biāo)來(lái)控制本制劑中的君藥，對(duì)黃柏中的有效成分鹽酸小檗堿用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行含量分析，用含量測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)精確控制黃柏藥材質(zhì)量和投料量，并進(jìn)一步驗(yàn)證該制劑的制備工藝是否穩(wěn)定成熟。現(xiàn)報(bào)道如下。

圖1　黃柏薄層色譜圖

1　儀器與試藥

1.1儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB204-N型電子天平（梅特勒-托列多儀器＜上海＞有限公司），AUW220型電子天平（日本島津公司）。

1.2試藥

黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)為120937-201007）、大黃對(duì)照藥材（批號(hào)為120909-200905）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713-201212）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；速效燒傷膏（湖南省武岡市中醫(yī)院，自制）；水為重蒸餾水；乙腈（美國(guó)天地試劑有限公司，批號(hào)為12020466）為色譜純；乙酸乙酯（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20130116）、甲醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20130508）及其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1黃柏［1］

取樣品20 g內(nèi)容物，加入50 mL稀鹽酸和80 mL乙酸乙酯，經(jīng)過(guò)30 min水浴加熱回流，靜置冷卻并分層；取酸水層，用氨水將pH調(diào)至9～10；加入三氯甲烷30 mL，萃取2次；合并三氯甲烷液并蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL，使其溶解，作為供試品溶液。取20 g速效燒傷膏缺黃柏的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，并以苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-氨水（12∶6∶3∶3∶1）為展開(kāi)劑，放置在用氨蒸氣飽和的展開(kāi)槽中預(yù)飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.2大黃［2］

取樣品20 g內(nèi)容物，加入40 mL甲醇，用超聲儀處理15 min，濾過(guò)，濾液蒸干；在殘?jiān)屑铀?0 mL，使其溶解；再加入鹽酸1 mL，經(jīng)30 min水浴加熱回流，靜置冷卻；加入乙醚20 mL，振搖提取2次；合并乙醚液并自然揮干，殘?jiān)尤燃淄? mL，使其溶解，作為供試品溶液。取20 g速效燒傷膏缺大黃的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。取0.1 g大黃對(duì)照藥材，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取大黃酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色，且陰性對(duì)照品溶液則無(wú)此斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　大黃薄層色譜圖

2.2鹽酸小檗堿含量測(cè)定

2.2.1色譜條件［3］

色譜柱：HypersilGOLDXB-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50），每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2溶液制備

對(duì)照品溶液：取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.100 6 g/L的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密稱取樣品10 g，加稀鹽酸25 mL和乙酸乙酯50 mL，加熱回流30 min，靜置冷卻并分層；取酸水層用氨水將pH調(diào)至9～10，加入三氯甲烷25 mL，振搖提取3次；合并三氯甲烷液并水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按制備工藝，制備缺黃柏的陰性樣品；按供試品溶液制備方法，制成缺黃柏的陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果各色譜峰均達(dá)基線分離且峰形良好；理論板數(shù)均在4 000以上。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜峰相應(yīng)的位置上檢出色譜峰，陰性對(duì)照品溶液色譜中未檢出相應(yīng)色譜峰，說(shuō)明陰性樣品無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

線性關(guān)系考察：精密吸取質(zhì)量濃度為0.100 6 g/L的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液1，5，10，15，20，25 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=36 356×106C-4.005 3×104，r= 0.9992（n=6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.1006～2.515 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果其平均值為1573235，RSD為0.28%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0，1，2，4，8，16，24 h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積。結(jié)果其平均值為1 568 594，RSD為0.49%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：按擬訂含量測(cè)定方法，取同一批號(hào)（武岡市中醫(yī)院制備，批號(hào)為20130801）樣品5份，重復(fù)測(cè)定其鹽酸小檗堿含量。結(jié)果其平均含量為0.640 2 mg/g，RSD為0.37%（n=5），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密吸取已知含量的供試品（武岡市中醫(yī)院制備，批號(hào)為20130801，含量為0.6402mg/g）4，5，6 g各3份，共9份，各精密加入對(duì)照品溶液（0.301 2 g/L）8.0，8.0，8.0，10.0，10.0，10.0，12.0，12.0，12.0 mL，加稀鹽酸和乙酸乙酯各25 mL，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定鹽酸小檗堿含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖3　高效液相色譜圖

2.2.4樣品含量測(cè)定

按擬訂方法測(cè)定3批樣品中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3　討論

3.1定性鑒別

黃柏有清熱燥濕、解毒療瘡的功效，大黃有清熱瀉火、涼血解毒的功效，故兩者均被應(yīng)用于速效燒傷膏，用于治療燒傷、燙傷。為保證制劑的療效，故對(duì)黃柏、大黃進(jìn)行了薄層色譜鑒別。薄層色譜鑒別法在中成藥及中藥材質(zhì)量控制中是一種操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確的方法，在《中國(guó)藥典》和各種藥品標(biāo)準(zhǔn)中均被廣泛使用。本研究中參照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》提取方法及薄層層析條件分別對(duì)黃柏、大黃建立了薄層色譜鑒別方法。

由于該制劑為軟膏劑，基質(zhì)中含大量的蜂蠟和麻油，用甲醇直接提取，帶入雜質(zhì)太多，薄層色譜結(jié)果不理想。為除去基質(zhì)干擾，本試驗(yàn)中分別用乙醚、乙酸乙酯、乙醇對(duì)基質(zhì)進(jìn)行溶解性試驗(yàn)，結(jié)果用乙酸乙酯加熱回流能溶解大部分的基質(zhì)。因大黃的有效成分在甲醇中易溶，故同時(shí)在樣品中加入甲醇和乙酸乙酯溶劑，加熱回流提取后，靜置后2種溶劑可分層。這樣在消除基質(zhì)干擾的同時(shí)又能提取大黃的有效成分，且操作簡(jiǎn)單、省時(shí)。用甲醇加熱回流提取得到的是大黃粗品，為保證大黃的薄層色譜圖主斑點(diǎn)清晰，需對(duì)其進(jìn)行精制處理。本研究中對(duì)大黃粗品酸水解后用乙醚萃取，進(jìn)行薄層色譜鑒別，色譜圖效果良好，且陰性樣品也未見(jiàn)干擾。

表1　鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表2　樣品含量測(cè)定結(jié)果

根據(jù)中藥市場(chǎng)大黃目前的質(zhì)量狀況，大黃的偽品土大黃易被誤作大黃投料使用，故本試驗(yàn)中用大黃對(duì)照藥材進(jìn)行薄層色譜定性鑒別。并分別通過(guò)用氨氣熏顯色和在紫外光燈下（365 nm）2種檢視方法進(jìn)行檢測(cè)，有效地控制了大黃原藥材的質(zhì)量。由于黃柏為該處方中的君藥，有效成分為小檗堿類生物堿，故根據(jù)本處方工藝，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，對(duì)鹽酸小檗堿采用酸溶堿沉的方法取凈后，再進(jìn)行薄層色譜鑒別。結(jié)果各斑點(diǎn)分離效果好，圖譜清晰，陰性樣品也未見(jiàn)干擾。黃柏藥材在2010年版《中國(guó)藥典（一部）》分別被列為黃柏與關(guān)黃柏2個(gè)品種，其來(lái)源不同，主成分鹽酸小檗堿的含量也相差較大。本處方中明確投入黃柏，為防止以關(guān)黃柏充黃柏用，特制訂了鹽酸小檗堿的含量測(cè)定方法。其他藥材如延胡索、紅花及穿心蓮在該處方中用量較小，均為佐、使藥，也分別對(duì)其進(jìn)行了薄層色譜鑒別摸索。由于用量不大，有效成分不能被完全提出，薄層色譜圖不理想，甚至有的陰性樣品有干擾，故未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

3.2定量鑒別

樣品加稀鹽酸和乙酸乙酯回流時(shí)間考察：分別回流15，30，60 min，結(jié)果表明，15 min太短，有效成分未完全提取出來(lái)；60 min時(shí)間太長(zhǎng)，有效成分的提取率與30 min相當(dāng)。故選擇加熱回流30 min提取方法。

黃柏來(lái)源于蕓香科植物黃皮樹(shù)的干燥樹(shù)皮，為該制劑處方的君藥，其主要有效成分為鹽酸小檗堿，故選擇鹽酸小檗堿作為含量測(cè)定指標(biāo)。參照2010年版《中國(guó)藥典（一部）》黃柏含量測(cè)定項(xiàng)下的方法要求，用HPLC法測(cè)定該樣品中的鹽酸小檗堿含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸小檗堿色譜峰與相鄰色譜峰的分離效果良好，各項(xiàng)方法學(xué)考察指標(biāo)較好，方法可行。

用三氯甲烷振搖提取次數(shù)考察：分別比較三氯甲烷振搖提取1，3，5次的效果，結(jié)果表明，3次即可提取完全。

流動(dòng)相選擇：試用乙腈-水（40∶60，每1 000 mL流動(dòng)相中含磷酸二氫鉀3.5 g，十二烷基磺酸鈉1.5 g）［4］、乙腈-0.1%磷酸溶液（45∶55，每100 mL加十二烷基硫酸鈉0.2 g）［5］、0.033 mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈（60∶40）［6］、乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g），經(jīng)試驗(yàn)，只有以乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g）為流動(dòng)相時(shí)，鹽酸小檗堿的色譜峰與相鄰色譜峰才能達(dá)到有效分離，且峰形良好。

流速選擇：分別將流動(dòng)相的流速設(shè)置為0.8，1.0，1.2 mL/min，色譜峰無(wú)明顯改善，故選用常規(guī)流速1.0 mL/min對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

色譜柱選擇：分別采用Hypersil GOLD XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）、Ultimate XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析樣品，結(jié)果用Hypersil GOLD XB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）時(shí)，樣品的色譜峰理論板數(shù)、保留時(shí)間及分離度均達(dá)到藥典要求。

柱溫選擇：將柱溫分別設(shè)為30，35，40℃，結(jié)果色譜峰的保留時(shí)間、峰形及分離度在柱溫為35℃時(shí)均比較滿意。

檢測(cè)波長(zhǎng)確定：取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描測(cè)定［7］，結(jié)果在263nm及348nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，但348nm更接近紫外區(qū)的邊緣，易受其他雜質(zhì)干擾。故選用了2010年版《中國(guó)藥典（一部）》方法中的265 nm為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3方法評(píng)估

該方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、精密度高、回收率好，可作為速效燒傷膏的質(zhì)量控制方法。

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Quality Standard for Suxiao Shaoshang Ointment

Ye Yuhua
（Shaoyang Institute for Food and Drug Control，Shaoyang，Hunan，China 422000）

ObjectiveTo establish the quality control standard of Suxiao Shaoshang Ointment.MethodsThe qualitative identification of Radix et Rhizoma Rhei and Cortex phellodendri chinensis were done by TLC，the content of berberine hydrochloride was determined by HPLC.ResultsTheRadix et Rhizoma Rhei andCortex phellodendri chinensis could be identified by TLC，the TLC spots developed were fairly clear；the linear range of Berberine hydrochloride was 0.100 6-2.515 0 μg，r=0.999 2（n=6）；the average recovery rate was 94.99%，RSD%=1.40%（n=9）.ConclusionThe method is simple，accurate，high sensitive and good reproducible，and can be used for the quality control of Suxiao Shaoshang Ointment.

Suxiao Shaoshang Ointment；TLC；berberine hydrochloride；HPLC

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2016）14－0044－05

葉玉華（1976-），女，副主任藥師，主要從事中藥材及中成藥檢驗(yàn)工作，（電子信箱）1005613544@ qq.com。

2016－01－06；

2016－02－12）