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    五味子多糖對SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡的影響

    2016-10-27 09:13:54孫雨薇閆冬梅
    生物技術(shù)世界 2016年3期
    關(guān)鍵詞:五味子抑制率多糖

    孫雨薇閆冬梅

    (1.中國人民解放軍第209醫(yī)院 黑龍江牡丹江 157011;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室 黑龍江佳木斯 154007)

    五味子多糖對SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡的影響

    孫雨薇1閆冬梅2*

    (1.中國人民解放軍第209醫(yī)院 黑龍江牡丹江 157011;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫教研室 黑龍江佳木斯 154007)

    [目的]研究五味子多糖(SCP)對肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的影響。[方法] 不同濃度SCP作用于SMMC-7721,cck-8法檢測藥物對細(xì)胞增殖的影響;Tunnel檢測細(xì)胞凋亡變化。[結(jié)果]SCP能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖。熒光顯微鏡下可見細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)。[結(jié)論]SCP能抑制肝癌細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)凋亡。但詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

    五味子多糖 SMMC-7721細(xì)胞 細(xì)胞凋亡

    五味子多糖(SCP)是中藥五味子的主要有效成分之一,具有較好的抑瘤作用[1]。本研究探討SCP對SMMC-7721細(xì)胞增殖及凋亡的影響,從而為肝癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞株

    人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株,本研究室保存。

    1.2 藥品

    SCP購自寧夏宏德生物制品有限公司,用RPMI 1640培養(yǎng)液溶解成 200 mg/mL的儲(chǔ)備液,過濾除菌, 4 ℃保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)加培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

    1.3 試劑

    RPMI 1640購自美國Hyclone 公司,新生牛血清購自杭州四季青公司,胰蛋白酶、CCK-8、Tunnel試劑盒、Hoechst33342購于碧云天生物技術(shù)研究所。

    1.4 主要儀器

    MCO-15AC恒溫CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡、DXM 1200 C數(shù)碼相機(jī)(尼康公司);Multiskan Mk3酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活新生牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代,每2-3 d傳代1 次。

    2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

    SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,以5×105個(gè)/mL接種于96孔板,每孔200 μL,37℃、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí),分別加入SCP(終質(zhì)量濃度為0,0.625,1.25,2.5,5,10,20 mg/mL),每個(gè)濃度3復(fù)孔,分別培養(yǎng)24,48,72 h加入CCK-8試劑,每孔20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)3 h,450 nm波長檢測各孔A (吸光度)值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(IR):IR(%)=(1- 實(shí)驗(yàn)組A均值/對照組A均值)×100%。計(jì)算各組藥物的半數(shù)抑制率 IC50。

    圖1 給藥48 h后SMMC-7721細(xì)胞凋亡結(jié)果(Tunnel染色)

    2.3 Tunel染色法檢測細(xì)胞凋亡

    SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板中,每孔加3 mL培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2培養(yǎng)。分為SCP組(10 mg/mL)和對照組(SMMC-7721),每組3復(fù)孔。培養(yǎng)48 h,PBS洗滌細(xì)胞,4%多聚甲醛固定30 min; PBS洗滌,加入0.1% TritonX-100 PBS冰浴2 min。PBS洗滌細(xì)胞后移入濕盒中,加入100 μL的Tunnel檢測液(現(xiàn)配現(xiàn)用),37℃避光60 min。PBS洗滌細(xì)胞,37℃下Hoechst33342染色40 min;PBS洗滌,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況,拍照。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    3 結(jié)果

    3.1 SCP對SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用

    各劑量組SCP對SMMC-7721細(xì)胞生長均有抑制作用,呈現(xiàn)一定程度的劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.001或 P<0.01)。5 mg/mL以上抑制率隨時(shí)間延長而逐漸提高,呈時(shí)間依賴性。10 mg/mL SCP在48、72 h抑制率分別為51.59%、60.14%,20 mg/ mL SCP在24、48、72 h的抑制率分別達(dá)到67.08%、79.99%、92.44%,說明SCP體外對SMMC-7721細(xì)胞確實(shí)具有抑制作用。經(jīng)計(jì)算,24, 48,72 h的 IC50分別為16.48,11.12,9.09 mg/mL,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用濃度為10 mg/mL的劑量,藥物作用時(shí)間為48 h。

    3.2 SCP對凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

    熒光顯微鏡下可見,對照組細(xì)胞核染色正常,極少有標(biāo)記凋亡細(xì)胞的綠色熒光;給藥組細(xì)胞核基本沒有破裂,但能觀察到較多標(biāo)記凋亡細(xì)胞的綠色熒光(圖1)。

    4 討論

    研究發(fā)現(xiàn),SCP對S180荷瘤小鼠有抑瘤作用,使凋亡增加,瘤內(nèi)炎細(xì)胞增多,瘤周炎細(xì)胞浸潤增加,瘤細(xì)胞異型性降低,核分裂像減少,瘤細(xì)胞退變明顯[2]。于赫[3]等發(fā)現(xiàn)SCP對H22肝癌荷瘤小鼠移植瘤具有重要作用。因此,SCP具有預(yù)防和治療腫瘤的潛在價(jià)值。

    本研觀察了不同濃度五味子多糖對SMMC-7721細(xì)胞的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),五味子多糖可抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。說明五味子多糖可以在體外通過誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡,抑制肝癌細(xì)胞增殖發(fā)揮抗腫瘤作用,可能在治療肝癌上發(fā)揮一定的作用。但其抗腫瘤的具體機(jī)制還不清楚,仍待進(jìn)一步研究。

    [1]張?zhí)m杰,張維華,趙珊紅.北五味子果實(shí)中多糖的提取與純化研究[J].鞍山師范學(xué)院學(xué)報(bào),2002,4(1):58-60.

    [2]黃玲,陳玲,張振林.五味子多糖對荷瘤鼠瘤體抑制作用的病理學(xué)觀察[J].中藥材,2004,24(3):202-203.

    [3]于赫,李冀,齊彥.五味子多糖對肝癌小鼠腫瘤生長的抑制作用及其免疫學(xué)機(jī)理初探[J].中醫(yī)藥信息,2010,27(2):26-24.

    R285.5

    A

    1674-2060(2016)03-0200-01

    孫雨薇(1983—),女,主管藥師,主要從事藥品配制與檢驗(yàn)及免疫學(xué)的研究。

    閆冬梅,碩士,副教授,主要從事疫苗的免疫學(xué)評價(jià)和中草藥免疫的研究。

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