甜葉菊中總多酚及總多糖含量測定*

何巧麗，李柯翱，季志紅，田樹革

1新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆烏魯木齊830011；2新疆奇康哈博維藥有限公司；3新疆醫(yī)科大學中心實驗室

甜葉菊中總多酚及總多糖含量測定*

何巧麗1，李柯翱2，季志紅2，田樹革3△

1新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆烏魯木齊830011；2新疆奇康哈博維藥有限公司；3新疆醫(yī)科大學中心實驗室

目的:建立測定甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量的方法，并測定其含量。方法:分別以沒食子酸和葡萄糖作為測定總多酚和總多糖含量的對照品，采用可見分光光度法測定甜葉菊提取物中總多酚和總多糖的含量。結果:測得甜葉菊提取物中總多酚總多糖含量分別為1.36 m g、1.73 m g。結論:該方法簡單可行，重現(xiàn)性良好，測定結果準確、可信，可以作為甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量的測定方法。

甜葉菊提取物；總多酚；總多糖；含量測定

甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni），別名甜菊、糖草、屬菊科（Compositae），斯臺維亞屬，是一種多年生菊科草本植物。作為一種非糖、非營養(yǎng)型的甜味劑，甜葉菊符合現(xiàn)代健康飲食的理念，還具有清熱、利尿、調節(jié)胃酸的功效。甜葉菊葉子的化學成分多種多樣，主要成分是甜葉菊總糖苷，甜葉菊的根、莖、葉中含有甜葉菊糖甙，含量占10%左右。甜葉菊糖甙具有高甜度（為蔗糖的200～300倍）、低熱量（僅為蔗糖的1/300）的特性［1］。此外，還富含黃酮類成分。截止目前，甜葉菊中的ent-貝殼杉烯型二萜類是研究最為深入的一類成分［2］。

預實驗研究表明甜葉菊中還含有多糖和酚酸類成分?？偺鞘菃翁?、低聚糖、多糖等化合物的總和，其中多糖具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗凝血、抗血栓、提高記憶力等作用［2-3］。植物多酚類化合物在自然界分布廣泛，具有抗氧化、清除自由基、與金屬離子發(fā)生絡合、與蛋白質形成多種生理學活性等功能［4］，是有效的腫瘤化學預防劑［5］。此外，有些多酚類化合物本身具有抗腫瘤作用［6］。

本研究采用可見分光光度法測定甜葉菊提取物中總多酚和總多糖的含量，建立甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量測定方法，為甜葉菊資源的綜合利用提供基礎數(shù)據(jù)。

1　材料

1.1藥材甜葉菊為采集于新疆阜康市（2013年9月，原料藥材經(jīng)新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院徐海燕老師鑒定為菊科多年生草本植物甜葉菊（Stevia rebaudiana Bertoni）的干燥葉片。

1.2試劑葡萄糖對照品（天津市天新精細化工開發(fā)中心）；沒食子酸（批號：20130415，成都市科龍化工試劑廠）；鎢酸鈉、蒽酮、鉬酸鈉、磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、雙氧水、甲醇、乙醇、碳酸鈉、硫酸等均為分析純。實驗用水為自制蒸餾水。

1.3儀器AK-100搖擺式中藥粉碎機（溫嶺市奧力中藥機械有限公司）；METTLER TOLEDO型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-200KDE型超聲清洗器（昆山市超生儀器有限公司）；B-260水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；752紫外可見分光光度計（上海菁華）。

2　方法與結果

2.1福林酚試劑的制備［7］稱取鎢酸鈉100.0g，鉬酸鈉25.0 g，用700 mL蒸餾水溶解于圓底燒瓶中，加入磷酸（85%）50 mL和100 mL濃鹽酸充分混勻，小火加熱回流12小時，放冷，再加入150 g硫酸鋰，50 mL蒸餾水及0.2 mL雙氧水，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，使得雙氧水完全揮發(fā)，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，過濾，于棕色瓶中避光儲存。試液應呈亮黃色。如放置后變?yōu)榫G色，可加雙氧水0.2 mL，煮沸15分鐘即可。

2.2沒食子酸對照品儲備液的制備精密稱取2.2 mg沒食子酸對照品，用蒸餾水溶解，定容至50 mL容量瓶中，得濃度為0.044 mg/mL的沒食子酸對照品溶液。

2.3葡萄糖對照品儲備液的制備精密稱取0.100 0 g葡萄糖對照品，用蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，得濃度為1 mg/mL的葡萄糖照品溶液。

2.4供試品溶液的制備采用正交實驗方法優(yōu)選甜葉菊中總多酚及總多糖的提取工藝。精密稱取甜葉菊粉末（過三號篩）約1.0 g，加入25倍量水于90℃回流提取兩次，1 h/次，合并濾液，蒸干成粉末。再精密稱取粉末約5 mg，置于10 mL的容量瓶中定容至刻度線，充分搖勻，即得供試品溶液。

2.5測定波長的選擇準確吸取沒食子酸對照品溶液1.2 mL，置于10 mL容量瓶中，加入福林試劑1 mL，搖勻，靜置2分鐘，再加入2 mL15%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，混勻，75℃水浴10分鐘，在400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描沒食子酸及樣品的最大吸收波長，沒食子酸對照品的掃描結果顯示其最大吸收波長為760 2 nm，綜合文獻報道的最大吸收波長，確定在752 nm處測定甜葉菊提取物的總多酚含量。準確吸取葡萄糖對照品溶液0.5 mL置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，再從中分別精密吸取1 mL于刻度試管中，加入硫酸蒽酮試液4 mL，搖勻，靜置15分鐘，沸水浴15分鐘，冰水浴10分鐘，在常溫下于400～800 nm波長范圍內(nèi)掃描葡萄糖及樣品的最大吸收波長，葡萄糖對照品的掃描結果顯示其最大吸收波長為580 2 nm，綜合文獻報道的最大吸收波長，確定在588 nm處測定甜葉菊提取物的總多糖含量。

2.6標準曲線的制備和線性關系的考察

2.6.1總多酚對照品溶液的標準曲線準確吸取沒食子酸對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL置于10 mL容量瓶中，加入福林試劑1 mL，搖勻，靜置2分鐘，再加入2 mL 15%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，混勻，75℃水浴10分鐘，在752 nm處測定其吸光度值。以沒食子酸濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程：A=61.364C+0.147 8（r2=0.996 8），結果表明，沒食子酸在1.76～8.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6.2總多糖對照品溶液的標準曲線準確吸取葡萄糖對照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，再從中分別精密吸取1 mL于刻度試管中，加入硫酸蒽酮試液4 mL，搖勻，靜置15分鐘，沸水浴15分鐘，冰水浴10分鐘，于常溫在588 nm處測定其吸光度。以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程：A=10.86C-0.147（r2=0.998 8），結果表明，葡萄糖在0.04～0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.7精密度實驗

2.7.1總多酚精密度實驗分別精密吸取6份沒食子酸對照品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.1”項下方法操作，結果顯示吸光度RSD值為1.17%，表明該方法精密度良好。

2.7.2總多糖精密度實驗分別精密吸取6份葡萄糖對照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.2項”下方法操作，結果顯示吸光度RSD值為1.54%，表明該方法精密度良好。

2.8穩(wěn)定性考察

2.8.1總多酚穩(wěn)定性考察分別精密吸取室溫下放置0、5、10、15、20、30分鐘的沒食子酸對照品溶液1.2 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.1”項下方法操作，在752 nm處測定其吸光度值，結果表明吸光度RSD值為1.26%，表明其在30分鐘內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.2總多糖穩(wěn)定性考察分別精密吸取室溫下放置0、1、2、3、6、12小時的葡萄糖對照品溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照“2.6.2項”下方法操作，結果顯示吸光度RSD值為1.46%，表明其在12小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率

2.9.1總多酚加樣回收率采用加標回收法，精密量取已知量的甜葉菊干燥樣品粉末5 mg，平行6份，按照“2.4”項下方法將其制成供試品溶液，從中吸取6份已知總多酚含量的水提取液0.2 mL，各加入對照品溶液0.5 mL，按照“2.6.1”項下方法測定其混合溶液的吸光度值，并計算其回收率，結果表明甜葉菊提取物中總多酚的平均回收率為98.53%，RSD為2.25%，表明該方法準確度良好，見表1。

表1　甜葉菊提取物總多酚回收率實驗結果（n=6）

2.9.2總多糖加樣回收率采用加標回收法，精密量取已知量的甜葉菊干燥樣品粉末5 mg，平行6份，按照“2.4”項下方法將其制成供試品溶液，從中吸取6份已知多糖含量的水提取液0.1mL，取0.2mL葡萄糖對照品溶液，按照“2.6.2”項下方法測定混合溶液的吸光度值，并計算其回收率，結果表明甜葉菊提取物中總多糖的平均回收率為100.67%，RSD為1.98%，表明該方法準確度良好，見表2。

表2　甜葉菊提取物總多糖回收率實驗結果（n=6）

3　含量的測定

甜葉菊提取物中總多酚、總多糖含量測定。按“2.4”項下方法，從10 mL水提取液中精密吸取0.5 mL稀釋液，并按照“2.6.1”項下方法操作，測定其吸光度值。根據(jù)線性方程計算樣品中總多酚的含量；按“2.4項”下的方法，從10 mL水提取液中精密吸取0.3 mL的稀釋液，并按照“2.6.2”項下方法操作，測定其吸光度值。根據(jù)線性方程計算樣品中總多糖的含量，見表3。

表3　甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量（n=3）

4　討論

實驗結果顯示甜葉菊提取物中含有一定量的總多酚和總多糖，采用可見分光光度法測定甜葉菊提取物中總多酚和總多糖含量可行，結果準確，操作簡便，重現(xiàn)性好，精密度高，可見分光光度法可以作為檢測甜葉菊提取物中總多酚和總多糖的一種方法。

本研究采用2010版中國藥典中蒽酮-硫酸法測定甜葉菊提取物中的總多糖，該法具有快速方便，價格低廉，且不需要特殊儀器等優(yōu)點。

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［2］吳笳笛.多糖的作用及其研究進展［J］.沈陽師范大學學報：自然科學版，2008，26（2）:221-223.

［3］張峰，張繼國，王麗華，等.黃精多糖對東莨菪堿致小鼠記憶獲得障礙的改善作用［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2007，16（36）:5410-5412.

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Content Determination of Total Polysaccharide and Total Polyphenols of TianYeJu

HE Qiaoli1，LI Keao2，JI Zhihong2，TIAN Shuge3△

1 TCM College of Xinjiang Medical university，Urumqi，830011，China；2 Xinjiang QiKang HaBo Uygur Medicine Co.，LTD；3 Central Lab of Xinjiang Medical University

Objective:To establish the method of determining the contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu［Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl］，and determine their contents.Methods:The contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu were detected by visible spectrophotometric method，gallic acid and glucose were tanked as the control articles of determining total polyphenols and total polysaccharide.Results:The contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu were 1.36 mg and 1.73 mg respectively.Conclusion:The method，simple，feasible，reproducible，accurate and reliable，could be taken as the method of determining the contents of total polyphenols and total polysaccharide in the extract of TianYeJu.

the extract of TianYeJu；total polyphenols；total polysaccharide；content determination

R284.1

A

1004-6852（2016）05-0034-03

2015-02-12

自治區(qū)科技支疆項目（編號2013911135）。

何巧麗（1990—），女，在讀碩士研究生。研究方向：中藥化學。

田樹革（1969—），男，教授。研究方向：中藥化學。